NAC（NAM、ATAF1/2、CUC1/2）是植物特有的一类转录因子家族,广泛存在于陆生植物中[1]。NAC转录因子的C末端为高度变异的转录调控区,N端为高度保守的5个亚结构域[2]。NAC转录因子结构的多样性使得NAC转录因子功能多样化[3],植物NAC转录因子参与植物根、茎、叶等组织的生长发育以及调控次生代谢产物的合成,而且逆境胁迫方面功能显著,尤其是非生物逆境胁迫。植物NAC转录因子在调控植物侧根的生长发育上发挥着重要作用,掌叶大黄RpNAC1基因在一年生植株的根中表达量最高[4]。花生AhNAC14在不同器官中的表达量分析显示在侧根中最高[5],过量表达ZmNAC1基因使拟南芥侧根数增多[6]。同时玉米ZmNAM1/2在胚芽鞘中大量表达,促进茎尖分生组织的形成[7],说明植物NAC转录因子在植物茎的生长发育中起一定作用。植物NAC转录因子还对调控叶片衰老发挥着重要作用,拟南芥过表达SiNAC1基因可提高脱落酸合成基因的表达,积累脱落酸促进拟南芥叶片衰老[8]。过量表达甜瓜CmNAC60基因的拟南芥植株叶片衰老也明显加速[9]。烟草NtNAC080基因的过表达导致拟南芥叶片提前衰老[10]。植物NAC转录因子在调控次生代谢产物合成中也发挥着重要作用。番木瓜的果实成熟过程中,番木瓜转录因子CpNAC1能够促进类胡萝卜素的生物合成[11]。在菠萝的成熟过程中AcoNAC1基因对果实的形成和发育有促进作用而且参与到逆境胁迫响应[12]。植物NAC转录因子在非生物逆境方面功能明显,一直是现在研究的热点。在高盐处理下,火龙果HpNAC的上调表达[13],水稻OsNAC1通过促进根系发育提高过表达OsNAC1转基因棉花的耐旱耐盐性[14];油茶CoNAC基因的表达模式与其抗旱性有关[15]。在模拟干旱和高盐胁迫处理下,梭梭HaNAC20表达量均显著上调[16]。大麦HvSNAC1基因的过表达使其在干旱胁迫下气孔阻力增加,通过保证充足的光合作用提高抗旱性[17]。在低温环境下甘薯NAC转录因子有25个NAC基因差异表达[18],苹果MdNAC029基因负调控苹果的抗冷能力[19]。
1 材料与方法
1.1 材料
逆境胁迫材料种植于广西大学农学院标本园,拟南芥为哥伦比亚型拟南芥（wild type, WT）保存于本实验室。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥转化、筛选和鉴定
将前期课题组已经构建好的过量表达载体pBI121-MiNAC1,通过花期侵染法转化野生型拟南芥[22]。收取种子后,播种在1/2 MS（50 mg/L Kan）培养基上,筛选出阳性植株。待长至4片真叶时,移栽到基质中在长日照条件下进行培育。提取阳性苗DNA进行PCR检测,检测引物为载体公用引物35SFu和基因特异引物MiNAC1d,对于检测为阳性的植株进行继续培育,直到获得T3代纯合植株。
表1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primer sequences used in this study |
| 引物名称Primer name | 引物序列（5'-3'） Primer sequence (5'-3') | 用途Application |
|---|---|---|
| T18 | TTTTTTTTTTTTTTTTTT | 逆转录 |
| 35SFu | GACGCACAATCCCACTATCCTT | 转基因植株检测 |
| MiNAC1d | TCGCCTTCCAATATCCGCTA | |
| qNAC1u | GTCTTCAGCTCCTCTCCCAG | 半定量引物 |
| qNAC1d | TCCAGTTCGTTTTGACCCCT | |
| AtActin2u | CACTGTGCCAATCTACGAGGGT | 内参 |
| AtActin2d | GCTGGAATGTGCTGAGGGAAG |
1.2.2 过量表达拟南芥株系的表型分析
在长日照条件下以WT为对照,观察转入芒果MiNAC1基因对拟南芥生长发育的影响。
1.2.3 过量表达拟南芥株系的逆境处理
逆境胁迫处理,将播种6 d的幼苗（WT、OE2、OE7、OE9）分别移栽到经过不同逆境胁迫处理的1/2 MS培养基上。干旱胁迫：0、200、300、400 mmol/L的甘露醇处理;盐胁迫：0、100、150、200 mmol/L的NaCl处理。干旱胁迫和盐胁迫苗在22℃培养箱中垂直培养。低温胁迫：将苗置于22℃（常温）和4℃（低温）条件下进行处理。参考张辰明等[24]的方法,每个处理重复3次,处理10 d后对拟南芥主根长、侧根数（长于5 mm的根）及根冠比进行测量并拍照记录。根冠比=根鲜重÷鲜叶重。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0软件对数据进行整理、统计分析。
2 结果与分析
2.1 拟南芥转化与检测
图1 转MiNAC1拟南芥的检测与表型分析A：转MiNAC1拟南芥阳性植株PCR检测;B：对照和转MiNAC1拟南芥的半定量检测;C：过量表达MiNAC1拟南芥的表型分析。 Fig. 1 Detection and phenotypic analysis of transgenic MiNAC1 Arabidopsis A: Detection the transgenic positive lines by PCR; B: Semi-quantitative detection the overexpressed and WT lines; C: Phenotype analysis of transgenic and WT lines. |
2.2 过量表达的MiNAC1对拟南芥生长发育的影响
对T3代纯合株系的莲座叶、抽薹时间和开花时间以及开花时的植株高度与对照植株进行比较观察,发现转芒果MiNAC1基因对拟南芥的叶片形态、开花时间等表型没有明显的影响（图1C）。
2.3 过量表达的MiNAC1对拟南芥干旱胁迫的影响
本研究采用不同浓度甘露醇处理过量表达的MiNAC1株系（OE2、OE7、OE9）并测其根长、侧根数与根冠比。在0 mmol/L甘露醇的培养下过量表达的MiNAC1株系与WT之间的根长没有明显差异。随着甘露醇浓度的增大,WT与过量表达的MiNAC1株系的生长发育均受到抑制,叶片发黄变小,叶柄狭长,根长渐短,侧根增多。但过表达株系受到的抑制相对于WT较小（图2A~图2D）。在200、300、400 mmol/L浓度的甘露醇处理时,过量表达MiNAC1株系的根长比WT显著增长（图2E）,侧根数显著增多（图2F）,根冠比显著增大（图2G）。结果表明,转芒果MiNAC1基因可以显著提高转基因拟南芥对干旱的抗性。
2.4 过量表达的MiNAC1对拟南芥盐胁迫的影响
本研究采用不同浓度NaCl处理WT与过量表达的MiNAC1株系（OE2、OE7和OE9）并测其根长、侧根数与根冠比。在0 mmol/L NaCl的处理下过量表达的MiNAC1株系与WT之间的根长,侧根数与根冠比没有明显差异,随着NaCl浓度的增大,WT与过量表达的MiNAC1株系的生长发育均受到抑制,表现出叶片发黄变白,根长渐短,侧根增多的现象。但过量表达的MiNAC1的生长发育受到的抑制不明显（图3A~图3D）。在100、150、200 mmol/L浓度的NaCl的处理下,过量表达的MiNAC1的根长比WT的显著增长（图3E）,侧根数显著增多（图3F）,根冠比显著增大（图3G）。结果表明,转芒果MiNAC1株系可以显著提高拟南芥对盐胁迫的抗性。
2.5 过量表达的MiNAC1对拟南芥低温胁迫的影响
3 讨论
植物的生长发育受到非生物胁迫的影响,严重降低农作物的产量和品质。干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫是造成农作物损失最严重的非生物胁迫[25-26]。植物遭到胁迫后打破正常的生理代谢状态,以适应胁迫下的环境[27],比如沙芥幼苗根系的主根长、主根体积和根冠比随着干旱胁迫天数的延长不断增加[28]。转细叶百合LpNAC17基因的烟草幼苗在盐胁迫下其根长、鲜重和长势显著好于对照[29]。NAC转录因子对植物的生长发育和逆境胁迫应答等方面发挥着重要的调控作用[30]。植物NAC转录因子是一个大的基因家族,在应对逆境胁迫的功能方面一直被广泛关注。在前期研究中,课题组从芒果中分离克隆了一个MiNAC1基因,表达模式分析显示,低温、盐胁迫和干旱胁迫均影响其表达,说明MiNAC1基因与芒果的逆境胁迫应答有关[21]。
不同物种的NAC基因均可以使其转基因植株提高对逆境胁迫的抗性,比如将水稻OsNAC1基因转入棉花,过量表达的棉花在干旱和高盐胁迫下蒸腾速率下降,根系发育增强,提高了过量表达棉花的耐旱和耐盐性[14]。在干旱和盐胁迫培养下,过量表达的水仙NtNAC1基因可以提高烟草对干旱和盐胁迫的抗性[31]。番茄SiNAC35的表达模式分析显示其不但受干旱胁迫、盐胁迫和细菌病原体的诱导,与烟草空载相比在干旱和盐胁迫下过表达株系还表现出更多侧根数量和更长的根长[32]。说明植物在遭受逆境胁迫时通过增加主根的长度和须根的数量来应对逆境胁迫[33],本研究中,将芒果MiNAC1基因转入模式植物拟南芥中,在干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫下,转基因拟南芥和对照拟南芥的根系生长均受到抑制,但转基因拟南芥植株受到的抑制效应显著小于WT植株,而侧根数和根冠比也都大于WT,说明转芒果MiNAC1基因可以提高转基因拟南芥植株对干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫的抗性。
本研究中过表达拟南芥的主根增长,侧根数目显著增加,提高了株系的生物产量,且根冠比增大。说明芒果MiNAC1基因可以参与干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫的应答,具有提高芒果抗逆性的运用潜能。