三角梅属（Bougainvillea）是瑞香目（Thymelaeceae）紫茉莉科（Nyctaginaceae）的常绿藤状观花灌木[1]。最早发现于巴西,其色彩鲜艳,花色繁多,花期长,深受广大园艺学家和花卉爱好者的喜爱。该属全世界约有14~18种[2],其中根据印度农业研究所记载的具有园艺价值的观赏品种大约有300多种[1]。我国引种三角梅属植物最早可追溯到1872年,至今已有140余年的历史,种植区域多集中在澳门、香港、云南、海南、台湾、广东、福建等南方省区[3-4]。
三角梅属枝条柔韧度强,可塑性好,萌发力强,是园林绿化造景最理想的材料之一,除了常用于景观树和道路绿化以外,还可将其编织后应用于花架、花柱、绿廊、拱门和墙面的装饰,也可以修剪成各种形状,应用于公园造景,具有重要的观赏和经济价值[5]。但三角梅属品种育性低,加上其独特的花被管结构,自然条件下很少结实,给三角梅属育种工作的开展带来极大的困难,不利于新品种的产生[6⇓-8]。市场上一般用扦插和嫁接的方式进行繁殖,但无性繁殖方法不利于三角梅种质资源库的扩大及品种创新,要培育出性状更优良、花色更丰富以及花型更奇特的品种仍然要靠杂交育种手段[9]。因此,当务之急是利用已有的种质资源开展杂交育种工作,通过一系列试验筛选出育性较好、性状优良的亲本材料,以提高三角梅属植物的杂交结实率。杂交育种成功的前提是具有较强的花粉活力和柱头可授性,因此,鉴定不同三角梅品种的花粉活力和柱头可授性,对杂交育种工作意义重大。目前,有关三角梅花粉活力的研究已有相关报道[10⇓-12],但不够系统,而关于三角梅柱头可授性的研究还未见报道。
‘伊娃夫人’‘小叶紫’和‘伊娃白’属于光三角梅系（Bougainvillea glabra Choisy）品种[13-14]。‘伊娃夫人’苞片浅紫色;‘小叶紫’苞片艳红紫色;‘伊娃白’新苞片黄绿色,后转白色[14]。这3个品种的花色鲜艳,花期长,抗性好,是华南地区广泛运用的园林绿化品种,同时其育性也相对较好。而‘加州黄金’和‘橙红’属于巴特系三角梅（Bougainvillea × buttiana Holttum et Standl）品种[14]。‘加州黄金’新苞片橙色,转橙黄色,最后变浅粉色;‘橙红’新苞片为黄橙色,成熟时为橙红色转浅玫瑰色。这2个品种随着开花期的变化,苞片均会出现渐变现象,观赏价值极高,且一年中可多次开花[14]。而这2个品种育性不明,目前尚未见其结实的报道。因此,本研究选用上述5个三角梅品种,通过测定及比较分析其花粉活力、花粉离体萌发率和柱头可授性,旨在探究各个品种的育性强弱,为三角梅育种过程中优良亲本的选择提供基础信息。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料共有三角梅品种5个,分别为‘伊娃夫人’（Bougainvillea glabra ‘Mrs Eva’）、‘小叶紫’（Bougainvillea glabra ‘Sao paulo’）、‘伊娃白’（Bougainvillea glabra ‘Mrs Eva White’）、‘加州黄金’（Bougainvillea × buttiana ‘California Gold’）、‘橙红’（Bougainvillea × buttiana ‘Afterglow’）。以上材料均来自广州市林业和园林科学研究院白云苗圃三角梅研究中心。
1.2 方法
1.2.1 花粉生活力测定
采用FDA染色法进行花粉活力的观测。具体步骤为：于上午8：00采摘开花后1~3 h的花朵带回实验室,用镊子取下花药,装入1.5 mL离心管中。在装有花粉的1.5 mL离心管中,加入250 μL 0.01%的FDA染色液,在漩涡振荡器上震荡混匀,28℃避光5 min。用100 μL移液枪吸取60 μL悬浮液滴于载玻片上,盖上盖玻片,用Nikon eclipse 80i正置荧光显微镜进行观察,在明场下统计视野内的花粉粒总数,在蓝色激发光下观察具有活力的花粉粒数。在蓝色激发光环境下,有活力的花粉会发出黄绿色荧光,无活力的花粉无荧光[15]。每进行一次拍一次照保存,记录好名称、日期等信息。每个品种设3个重复,每个重复取3个视野,每个视野花粉粒总数不少于20粒。
花粉活力=（发荧光的花粉数目/视野内花粉粒总数）×100%
1.2.2 不同保存条件下花粉活力比较
试验分为4℃冰箱和28℃干燥保存2种处理。于上午8：00采摘开花后1~3 h的花朵带回实验室,用镊子取下花药,装入1.5 mL离心管中,然后分别置于4℃和28℃环境中。分别测定2个不同温度条件下存放0、2、4、8、12、24 h后的花粉活力。每个处理设3个重复,每个重复取3个视野,每个视野花粉粒总数不少于20粒。染色方法及具体步骤同1.2.1。
1.2.3 花粉离体萌发率测定
采用液体培养基培养法。采集各品种盛开的花朵带回实验室,将花药用镊子剥下装入1.5 mL离心管中,加入250 μL培养液,在漩涡振荡器上混匀,让花粉充分散开。然后用100 μL移液枪吸取60 μL悬浮液滴于载玻片上,将载玻片置于放有湿纸巾的一次性灭菌塑料培养皿中,盖上培养皿盖子,置于28℃培养箱中离体培养12 h。在Leica DM500光学显微镜下观察记录花粉粒总数及萌发数（以花粉管大于或等于花粉粒直径为标准判定花粉是否萌发）,计算花粉萌发率。每个品种重复3次,每次取3个视野,每个视野内花粉数不少于20粒。
花粉萌发率=（萌发花粉数/花粉粒总数）× 100%
培养基配方为：300 mg/L Ca(NO3)2·4H2O+ 100 mg/L H3BO3+200 mg/L MgSO4·7H2O+100 mg/L KNO3+200 g/L蔗糖[16]
1.2.4 柱头可授性检测
以开花后3~5 h的花朵柱头为试材,采用联苯胺-过氧化氢法鉴定5个三角梅品种的柱头可授性[17-18]。具体步骤为：采集开放的花朵带回实验室,用镊子去除掉花药及花被管部分,只保留柱头和子房部位,然后将柱头放置在载玻片上,滴入联苯胺-过氧化氢反应液（V1%联苯胺∶V3%过氧化氢∶V水=4∶11∶22）,使反应液完全淹没柱头为宜,染色5 min左右[19]。将载玻片置于显微镜载物台上,在显微镜下观察柱头的反应情况,同时拍照记录。若柱头周围颜色变为蓝紫色并产生大量气泡,则柱头可授性很强（++++）;若柱头颜色变为蓝色,同时伴随着气泡产生,则柱头可授性较强（+++）;若柱头变色不明显同时产生少量气泡,则柱头可授性较弱（++）;若柱头颜色无变化并无气泡产生,则柱头无可授性（-）[20]。
1.3 数据处理
运用WPS Office 2019软件进行数据记录、运算及制图,用SPSS 26软件进行数据差异性分析。
2 结果与分析
2.1 花粉活力比较
图1 5个三角梅品种A：加州黄金;B：伊娃白;C：小叶紫;D：橙红;E：伊娃夫人。 Fig. 1 Five varieties of Bougainvillea A: Bougainvillea × buttiana ‘California Gold’; B: Bougainvillea glabra ‘Mrs Eva White’; C: Bougainvillea glabra ‘Sao paulo’; |
图2 ‘伊娃夫人’荧光花粉粒A~C：明场图像,D~F：荧光图像;其中：A、D对应,B、E对应,C、F对应。 Fig. 2 Bougainvillea glabra ‘Mrs Eva’ fluorescent pollen grains A-C: Brightfield image, D-F: Fluorescence image; A corresponds to D, B corresponds to E, C corresponds to F. |
2.2 不同保存条件下花粉活力比较
28℃干燥保存和4℃冰箱保存对5个三角梅品种花粉活力的影响较大,2种方法存在显著性差异,且随着保存时间的延长,花粉活力的变化规律也不相同。
28℃干燥保存下,5个三角梅品种的花粉活力随着时间的延长均呈现下降的趋势（图4）。‘橙红’的花粉干燥保存8 h后完全丧失活力,整体看来‘伊娃夫人’‘小叶紫’和‘伊娃白’3个品种的花粉活力均高于‘橙红’和‘加州黄金’,可见28℃干燥的方法不适用于维持三角梅的花粉活力。
从图5可知,4℃冰箱保存条件下,5个三角梅品种的花粉活力除‘小叶紫’外均呈先升后降的趋势。‘伊娃夫人’‘橙红’和‘伊娃白’的花粉活力在保存8 h时达到最高,分别为19.14%、2.34%和26.52%。而随着时间的延长,5个品种的花粉活力开始逐渐降低,当保存时间达到24 h时,‘橙红’和‘加州黄金’的花粉完全丧失活力,而其余3个品种活力也达到最低。从整体上看,‘伊娃夫人’‘伊娃白’和‘小叶紫’的花粉活力均高于‘橙红’和‘加州黄金’,同时也说明4℃保存环境下三角梅的花粉活力能够得到一定的提高,最佳保存时间为8 h左右,但保存时间仍不宜过长。
除‘小叶紫’外的其他4个品种的花粉活力呈先升后降的趋势,说明在4℃条件下三角梅花粉的活力并不遵循随时间的延长而降低的规律。
2.3 花粉离体萌发率比较
由图6可知,5个三角梅品种花粉离体萌发率均较低,其萌发率由大到小依次为‘小叶紫’>‘伊娃白’>‘伊娃夫人’>‘加州黄金’>‘橙红’。‘小叶紫’的花粉萌发率最高,为4.50%;而‘橙红’的花粉萌发率则最低,仅为0.08%。从整体上看,‘橙红’和‘加州黄金’的花粉萌发率低于其余3个品种。
2.4 柱头可授性比较
表1 不同三角梅品种的柱头可授性比较Tab. 1 Comparison of stigma receivability of five varieties of Bougainvillea |
| 品种名 Cultivar | 可授性强度 Receptivity strength | 柱头染色颜色 The color of stigma | 气泡量 The volume of bubbles |
|---|---|---|---|
| 伊娃夫人 | ++++ | 蓝紫色 | 多 |
| 小叶紫 | ++++ | 蓝紫色 | 多 |
| 伊娃白 | +++ | 蓝色 | 较多 |
| 加州黄金 | ++ | 淡蓝色 | 少 |
| 橙红 | ++ | 淡蓝色 | 少 |
注：“+”表示柱头可授性强度,“+”数量越多表示柱头可授性越强。 | |
Note: “+” indicates the strength of stigma acceptability, and the more “+” indicates the more stigma acceptability. |
3 讨论
花粉生活力是指花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力,是育种工作能否顺利进行的参考指标之一[21]。采用FDA染色法可检测花粉活力,染色成功与否取决于品种自身的花粉特性,活力高的品种染色成功率也高。FDA染色结果表明,0.01% FDA染色液均能使5个三角梅属品种染色,其中‘伊娃白’‘伊娃夫人’和‘小叶紫’活力均较高。28℃干燥保存和4℃冰箱保存对5个三角梅品种花粉活力的影响有显著区别。28℃干燥保存条件下,5种三角梅的花粉活力均随着时间的延长而降低,个别品种如‘小叶紫’在28℃干燥保存2 h时,花粉活力存在短暂的上升现象,推测可能是刚采摘时部分三角梅花药未完全爆开,花粉还未成熟,而通过保存一段时间后花粉逐渐成熟,活力上升才导致的此类现象。而4℃冰箱保存条件下花粉活力的变化却与之不同,在24 h时间内,除‘小叶紫’外其余品种均出现先降低后回升再降低的趋势,其变化规律并不遵循时间越长活力越低的一般规律。猜测可能是花粉刚放在低温保存条件下时,三角梅的花粉活力产生应激反应导致活力下降,适应环境后再慢慢恢复其活力,或者是低温延缓了其花粉成熟的时间,具体原因仍需做进一步研究。2种不同的保存方式中,28℃保存不适合保存花粉。
植物花粉萌发率的高低受培养基类型及主要成分含量的多少影响,不同属、种的植物萌发所需的蔗糖和硼酸浓度也不相同,且培养基主要成分的多少,对植物花粉萌发存在明显的域值效应[22]。本试验采用液体培养基培养的5个三角梅品种花粉萌发率均较低,最高的‘小叶紫’品种萌发率也仅为4.50%;各品种萌发率高低依次为‘小叶紫’>‘伊娃白’>‘伊娃夫人’>‘加州黄金’>‘橙红’,但变化趋势与FDA染色法结果一致。存在这种现象的原因可能是没有找到花粉萌发的最佳时间或者没有采用最适合的培养基所致,其真正原因需要进一步的试验。
除植物花粉是育种工作中的基本材料外,植物柱头的可授性强弱也是决定育种工作成功与否的指标之一[23]。通过联苯胺-过氧化氢溶液处理后的三角梅柱头能够产生氧化还原反应,在处理过程中有活力的柱头能够变色并产生气泡,而无活力的柱头则基本不会变色。5个三角梅品种中,‘小叶紫’‘伊娃夫人’和‘伊娃白’的柱头柱头颜色变为蓝紫色并产生较多的气泡,而‘橙红’和‘加州黄金’的柱头变色不明显,基本无气泡产生,说明‘小叶紫’‘伊娃夫人’和‘伊娃白’的柱头可授性强于‘橙红’和‘加州黄金’。
综上所述,‘小叶紫’‘伊娃夫人’和‘伊娃白’3个三角梅品种的花粉活力、离体萌发率和柱头可授性均较高,而‘橙红’和‘加州黄金’的各个指标均较低。本研究结果可为今后三角梅杂交育种提供一定的参考。