植物体内天然化合物的糖基化修饰是一类常见的修饰反应,该反应通过糖基转移酶（glycosyl transferases, GTs）来实现[1-2]。GTs以糖苷键的形式在底物分子上添加糖基来形成更加稳定的天然糖苷或糖酯。糖基主要是葡萄糖、鼠李糖、木糖、半乳糖等。截至目前,从最简单的单细胞藻类到被子植物中都发现了糖基转移酶,说明该酶在植物的生长发育过程中非常重要。随着植物的不断进化,GTs家族在不断扩大,已经鉴定得到110个GTs家族（http://www.cazy.org/）。其中,使用UDP活化的糖基作为糖供体的GTs属于UDP依赖型糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases, UGTs）基因家族。
UGTs基因家族通过对植物激素、类黄酮和生物碱等化合物进行糖基化修饰来参与植物的生长发育过程[3-4]。例如在拟南芥中过表达UGT84B1基因会导致转基因植株的生长素水平降低,但生长素糖基化产物比野生型明显增加,表明糖基化会影响生长素的稳态[5]。过表达UGT73C5和UGT73C6基因使得转基因植株表现出油菜素类固醇缺陷,并且油菜素类固醇含量降低[6-7]。UGTs基因家族也可以通过ABA来参与植物响应非生物胁迫过程,例如UDP-葡糖基转移酶基因UGT71B6及其2个高度同源的UGT71B7和UGT71B8通过调节ABA的含量影响植物在逆境胁迫中的适应性[8]。也有研究表明UGT71C5基因通过将ABA糖酯化来保持ABA的稳定从而降低了转基因植株的耐旱性[9]。UGTs基因家族在植物响应生物胁迫中也具有重要作用。在植物防御生物胁迫的过程中,病原体的入侵通常会启动水杨酸和茉莉酸介导的信号通路,2条通路通常是以拮抗的方式发挥作用[10-11]。有研究指出,UGT76B1基因是联系水杨酸和茉莉酸途径的中间环节,表明小分子的糖基化介导了植物防御信号的传递。无病原菌入侵下,过表达UGT76B1基因会降低依赖水杨酸信号通路的植物防御能力,但会促进了茉莉酸信号通路介导植物防御反应。突变UGT76B1基因则会增强对丁香假单胞菌的抗性,降低对坏死性铜斑病链球菌的抗性[12]。
木薯（Manihot esculenta Crantz）是热带和亚热带地区大戟科木薯属植物,其地下块根富含淀粉,被称为“地下粮仓”,是世界三大薯类之一,也是全世界约10亿人口的主粮[13]。木薯对光、热、水有较高的利用率,同时对人工管理需求较少,对干旱具有明显的抗性和耐贫瘠,但却有较高的淀粉产量,其优质淀粉不仅可以为人类提供碳水化合物,也可以用来制作工业酒精和饲料[13]。在木薯的病害中,由地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, Xam）引起的木薯细菌性枯萎病菌一直是国内外木薯生产中造成毁灭性损失的主要病害之一[14]。通过对木薯UGTs基因家族的转录组数据进行分析发现MeUGT14基因的表达明显受到Xam菌株的诱导,根据序列比对发现MeUGT14基因和MeUGT85K4/MeUGT85K5高度同源,有研究报道MeUGT85K4/MeUGT85K5基因和氰苷的合成相关[15]。目前未发现其他对该基因的抗病功能进行研究,因此,本研究通过克隆显著受到Xam诱导表达的MeUGT14基因,构建MeUGT14基因的VIGS载体并转化至木薯叶片中,对基因干扰植株在细菌性枯萎病中的抗性进行评价,以期为研究MeUGT14基因在木薯抵抗细菌性枯萎病过程中的抗病机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
木薯SC124（Manihot esculenta cv. SC124）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。pTRV载体由施海涛老师实验室惠赠。RNA提取和反转录试剂分别购自天根生化科技（北京）有限公司和北京诺尔赛克科技有限公司。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 载体构建
根据MeUGT14基因的序列,设计引物（F1：5′-aaggttaccgaattctctagaGGTTCAAT CTCAACCCAGAAGC-3′;R2：5′-gagacgcgtgagctcg gtaccCTTTCGGGTAGAATCACTGAGTGA-3′）,扩增得到长度为285 bp的片段。连接至T载体测序,测序正确后酶切连接至pTRV载体,进行菌液PCR和双酶切验证,全部正确后保留菌液和质粒。
1.2.2 病毒诱导木薯中基因沉默
将转化pTRV2-MeUGT14载体的农杆菌和pTRV2载体转化的农杆菌分别注射到木薯叶片中,挑选10个植株进行注射,每个植株注射6片叶片,将分别进行农杆菌侵染的的木薯叶片放置于温室中并保湿,侵染2周后收集相关植株的样品提取RNA进行荧光定量PCR,检测目的基因MeUGT14的表达量（检测引物为F1：5′-TGCTCTAGAGGTTCAA TCTCAACCCAGAA-3′;R2：5′-CGGGGTACCC TTTCGGGTAGAATCACTG-3′）。
1.2.3 Xam侵染
将Xam菌液的母液进行复苏培养,吸取1 mL复苏的菌液添加至刚配置的LB液体培养基,培养至OD600=0.6左右。用MgCl2溶液稀释重悬菌液至OD600=0.2（MgCl2终浓度10 mmol/L,加入万分之五的表面活性剂silwet L-77）。使用注射器将稀释的菌液接种渗透至木薯叶片背面（木薯叶片为30日龄）,然后置于温室中继续培养（注意保湿）[16]。
1.2.4 Xam细菌数目统计和叶片表型分析
在农杆菌侵染2周时确认基因沉默效果,然后挑选干扰成功的植株接种Xam,在接种Xam的0 d和6 d时,分别取侵染后木薯叶片（打孔器）。样品分别用无菌水漂洗2 min,重复3次,然后碾碎叶圆盘。将无菌水碾碎的菌液按浓度梯度稀释（103~108）,取10 μL不同浓度的菌液点在LB平板上,每梯度重复3次。平板密封恒温培养箱培养（28℃, 16 h）,最后统计细菌数量,每个时间点收集3个重复,每个重复至少收集10个叶圆盘进行细菌数量统计。分别在0 d和6 d时,观察表型变化并拍照记录。
2 结果与分析
2.1 MeUGT14基因显著受到Xam诱导
从GEO数据库（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=mrkbmwsqxpejdajandacc=GSE53369）中下载得到相关转录组数据[17]。通过对数据进行分析发现,MeUGT14基因显著受到Xam菌株的诱导。如图1所示,MeUGT14基因在侵染后5 d表达量被显著提高并达到峰值,随后表达量在7 d时有些许下降,表达量分别提高了3.0倍和2.3倍。结果表明MeUGT14基因明显受到Xam诱导。
2.2 构建pTRV2-MeUGT14干扰载体
根据MeUGT14基因挑选合适的序列,设计引物扩增得到长为285 bp的片段,酶切位点分别为XbaI和KpnI,连接至T载体后进行测序。测序正确后通过双酶切连接至载体pTRV2,得到pTRV2-MeUGT14干扰载体,通过菌液PCR和双酶切对pTRV2-MeUGT14载体进行验证（图2）,结果表明,pTRV2-MeUGT14干扰载体构建正确。
图2 pTRV2-MeUGT14干扰载体构建A：干扰片段克隆;B：pTRV2载体酶切;C：pTRV2-MeUGT14双酶切。M1: DL2000 DNA marker; M2: 15 000 DNA marker。 Fig. 2 Construction of pTRV2-MeUGT14 vector A: Cloning of fragment of MeUGT14; B: Digestion of pTRV2 vector; C: Verified of pTRV2-MeUGT14 vector by digestion. M1: DL2000 DNA marker; M2: 15 000 DNA marker. |
2.3 病毒诱导MeUGT14基因沉默
通过VIGS诱导沉默的方法获得3株MeUGT14基因被干扰的阳性植株。荧光定量结果显示MeUGT14基因的表达量在不同植株中均被显著降低,分别降低了69%、45%、68%（图3）。结果表明,MeUGT14基因在木薯叶片中被明显抑制。
2.4 沉默MeUGT14基因导致叶片抗病性降低
在沉默MeUGT14基因和对照叶片上接种Xam菌株后的结果如图4所示,接种0 d时,细菌数在干扰和不干扰MeUGT14基因表达的叶片上无显著差异;而接种6 d后,可以明显发现降低MeUGT14基因的表达导致叶片上的细菌数量明显增多,和对照叶片相比有显著差异。干扰植株中MeUGT14基因的表达量从高到低分别是MeUGT14V-2、MeUGT14V-3和MeUGT14V-1,而细菌数量从多到少则是MeUGT14V-3、MeUGT14V-2和MeUGT14V-1,基因表达量和细菌数量之间无对应关系。叶片表型图片也可以明显发现降低MeUGT14基因的表达导致叶片上的菌斑更明显（图5）。结果表明,抑制MeUGT14基因的表达导致木薯叶片抵抗病菌侵染的能力降低。
图4 MeUGT14基因被沉默后细菌接种数量的变化情况不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 4 Quantification of bacteria number in cassava leaves transformed with pTRV-MeUGT14 Different lowercase letters indicate significant difference among treatments (P<0.05). |
3 讨论
UGTs基因家族通过对植物体内不同天然化合物进行糖基化修饰来参与植物生长发育过程。如通过调控生长素、油菜素类固醇、ABA等物质的稳态来调控生长发育和响应非生物胁迫过程[5⇓⇓-8]。UGTs基因也被报道参与调控水杨酸和茉莉酸响应来影响植株对疾病的抗性[12]。如UGT74F1突变体表现出低水杨酸含量,对Pseudomonas syringae细菌呈现出易感特征[18];UGT76B1突变体导致植株对Alternaria brassicicola病菌的抵抗力下降,而此时茉莉酸相关的标记基因表达量被抑制[12]。在本研究中,干扰MeUGT14基因的表达量导致木薯叶片对Xam病菌的抵抗力下降,MeUGT14基因表达量被抑制的程度和细菌数量之间的关系没有一一对应,推测可能是叶片不同位置MeUGT14基因被抑制的程度不一样导致,但这些结果也表明MeUGT14基因在叶片抵抗病菌侵染中发挥了作用。MeUGT14基因和UGT76B1及UGT74F1这些基因有较近的进化关系,推测MeUGT14基因可能通过影响水杨酸和茉莉酸的合成来响应Xam病菌侵染。本研究结果为进一步研究MeUGT14基因在木薯抗生物胁迫中的机制提供了研究基础和线索。