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2022 , Vol. 43 >Issue 6: 1102 - 1113

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.002

组学与生物技术

菠萝蜜果实PG基因的克隆与表达分析

  • 陈杰 1 ,
  • 黄舒怡 1 ,
  • 李真琴 1 ,
  • 廖倩贤 1 ,
  • 宋康华 2 ,
  • 洪克前 2 ,
  • 王俊宁 , 1, *
展开
  • 1.广东海洋大学滨海农业学院,广东湛江 524088
  • 2.海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室/中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江 524088
*王俊宁,E-mail： 。

陈 杰（1999—）,男,学士,研究方向：采后保鲜。

收稿日期: 2021-08-25

  修回日期: 2022-01-13

  网络出版日期: 2022-06-24

基金资助

广东海洋大学大学生创新训练项目(CXXL2020171)

国家级农科教合作人才培养基地资助项目(GDOU2013040301)

教育部卓越农林人才培养计划资助项目(GDOU2014041204)

收起

Cloning and Expression Analysis of PG Gene in Jackfruit

  • CHEN Jie 1 ,
  • HUANG Shuyi 1 ,
  • LI Zhenqin 1 ,
  • LIAO Qianxian 1 ,
  • SONG Kanghua 2 ,
  • HONG Keqian 2 ,
  • WANG Junning , 1, *
Expand
  • 1. College of Coastal Agricultural Sciences, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088, China
  • 2. Hainan Provincial Key Laboratory for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products / South Subtropical Crops Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang, Guangdong 524088, China
*WANG Junning,E-mail： 。

Received date: 2021-08-25

  Revised date: 2022-01-13

  Online published: 2022-06-24

Fold

摘要

为明确PG基因在菠萝蜜果实后熟软化过程中的作用,本研究以‘海大2号’菠萝蜜果实为材料,采用0.5 mg/L 1-MCP和1000 mg/L ETH处理,研究了室温（20℃）条件下果实成熟过程中硬度和果胶的动态变化,克隆获得4个PG基因,并对其进行了生物信息学和表达分析。结果表明：随着菠萝蜜果实的成熟,果肉硬度快速下降,可溶性果胶和离子型果胶不断增加,共价态果胶有所下降;ETH处理促进了果实WSP和ISP含量的上升,加速了软化进程,1-MCP处理抑制了贮藏前期果肉硬度的下降,推迟了软化进程,但明显提高了3种果胶的含量。AhePG1~AhePG4基因的开放阅读框（ORF）长度1221~1434 bp,编码406~477个氨基酸。AhePG1蛋白含有4个保守结构域（Ⅰ~Ⅳ）,AhePG2和AhePG3只含结构域Ⅰ和Ⅱ,AhePG4缺失结构域Ⅲ;AhePG基因分别与桃（AF095577.1）、菜豆（XM_007162208.1）、葎草（MN971583.1）、菜豆（XM_007151391.1）PG基因编码的氨基酸序列的亲缘关系较近,相似度分别达75.63%、73.11%、79.71%、70.75%。qRT-PCR分析结果显示：AhePG1基因在果实成熟前期表达量低,在后期高表达,而AhePG2/3/4基因的表达量在果实成熟过程中总体较低。ETH处理抑制了AhePG1基因的表达量,而1-MCP处理延缓了4个AhePG基因表达量的增加,但增加了成熟后期AhePG2、AhePG3、AhePG4基因的表达。相关性分析发现,果肉硬度与水溶性果胶含量和AhePG1基因表达呈显著和极显著负相关,而水溶性果胶含量又与AhePG1基因表达呈显著正相关。本研究说明,菠萝蜜果实的软化与果胶降解有关,AhePG1可能是菠萝蜜果实果胶降解和果实软化的关键PG基因之一,控制着果实成熟后期的软化;1-MCP处理能延缓菠萝蜜果实的成熟,但并不影响果实后期成熟时的软化,AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4基因可能对其软化均有作用。

关键词： 菠萝蜜; AhePG基因; 克隆; 基因表达; 果实软化

本文引用格式

陈杰 , 黄舒怡 , 李真琴 , 廖倩贤 , 宋康华 , 洪克前 , 王俊宁 . 菠萝蜜果实PG基因的克隆与表达分析[J]. 热带作物学报, 2022 , 43(6) : 1102 -1113 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.002

Abstract

To clarify the role of PG gene in the process of jackfruit ripening and softening, using ‘Haida 2’ jackfruit as the material, the dynamic changes of the hardness and pectin were studied at room temperature (20℃) during the ripening of the fruits treated with 0.5 mg/L 1-MCP and 1000 mg/L ETH, four polygalacturonase genes from ‘Haida 2’ fruits were cloned, and the bio-informatics and expression were analyzed. The results showed that with the ripening of the fruit, the firmness of the pulp droped rapidly, the soluble pectin and ionic pectin continued to increase, and the covalent pectin decreased. ETH treatment promoted the increase in WSP and ISP content and accelerated the process of fruit softening. 1-MCP treatment inhibited the decrease of pulp firmness in the early stage of fruit storage, delayed the process of fruit softening, but significantly increased the content of three types of pectins. The length of the open reading frames (ORF) of AhePG1~AhePG4 genes were 1221-1434bp, encoding 406-477 amino acids. AhePG1 protein contained four conserved domains (I-IV), AhePG2、AhePG3 only contained domains I and II, and AhePG4 lacked domain III. The relationship among amino acid sequences encoded by AhePG genes and PG genes from peach (AF095577.1), Phaseolus vulgarise (XM_007162208.1), Humulus (MN971583.1), and Phaseolus vulgarise (XM_007151391.1) was close, with similarities of 75.63%, 73.11%, 79.71% and 70.75%, respectively. The results of qRT-PCR analysis showed that the expression level of AhePG1 gene was low in the early stage and high in the later stage of fruit ripening. The expression level of AhePG2/3/4 genes was generally lower. ETH treatment inhibited the expression of AhePG1 gene, while 1-MCP treatment delayed the increase of four AhePGs expression, but increased the expression of AhePG2, AhePG3 and AhePG4 genes in the late stage of maturity. The result of correlation analysis showed that pulp firmness had a significant and very significant negative correlation with water-soluble pectin content and AhePG1 gene expression, and water-soluble pectin content had a significant positive correlation with AhePG1 gene expression. It showed that the softening of jackfruit fruit was related to the degradation of pectin, and AhePG1 maight be one of the key PG genes in jackfruit fruit pectin degradation and fruit softening, which controlling the softening of the fruit at the later stage of maturity.1-MCP treatment could delay the ripening of jackfruit fruit, but did not affect the softening of the fruit during the later ripening period, which meight be affected by AhePG genes.

Key words： jackfruit; AhePG genes; cloning; gene expression; fruit softening

果胶是由不同酯化程度的D-半乳糖醛酸以α-1、4-糖苷键聚合而成的多糖,是植物细胞初生壁和胞间层的主要成分,其存在形式和含量对细胞壁结构的稳定性和机械强度有重要影响[1]。在未成熟果实中,不溶性的原果胶与纤维素等物质紧密结合,并将相邻细胞粘连在一起,赋予果实一定的脆硬度。随着果实的成熟,原果胶逐渐降解为可溶性果胶,细胞间粘附力减弱,胞间层和初生细胞壁结构遭到破坏,果实质地变软。果胶根据其溶解度可分为可溶性果胶（water soluble pectin, WSP）、共价结合果胶（covalent binding pectin, CSP）和离子结合果胶（ionic soluble pectin, ISP）。高滋艺等[2]发现,脆性好的成熟苹果中WSP含量较高,硬度低的品种中ISP含量较高,说明ISP与WSP含量的差异与果实的质地有关。柿果实采收时,细胞壁结构完整,3 d后细胞壁中胶层溶解,初生壁也发生局部降解,同时原果胶含量迅速下降,水溶性果胶含量迅速上升[3]。在梨、木枣和冬枣成熟过程中也伴随着果胶物质的降解[4-5]。
多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase, PG）是一种能催化果胶降解的细胞壁水解酶,参与果实的成熟软化,这在苹果[6]、梨[7]、桃[8-9]、番茄[10]、草莓[11]、杧果[12]等果实中得到了证实。如水蜜桃成熟之前PG酶活性很低,果实较硬,随着果实的成熟,PG酶活性和水溶性果胶含量增加,果实硬度下降,其中PG酶活性与果实硬度呈负相关[8-9]。PG是一类由多基因家族编码的蛋白,目前已从拟南芥[13]、水稻[14]、白菜[15]、苹果[16]、桃[17]、枣[1]、杧果[12]的基因组中分别鉴定出了66、44、99、85、84、41、51个PG基因成员。PG基因进化关系的分析发现,依据不同的分类标准可将PG聚类为不同的亚类。在拟南芥[13]、杧果[12]、枣[1]上,可将PG基因分成A~F 6个亚类,而在苹果[16]、桃[17]、白菜[15]上,PG基因被分成A~G 7个亚类。不同亚类的PG基因在表达模式上存在差异,其中一些亚类成员趋向于在生殖器官中表达,另一些则趋向于在营养组织中表达,这预示着不同亚类的PG可能有其独特的生物学功能[17-18]。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）是典型的呼吸跃变果实,在果实的成熟过程中有明显的后熟软化现象,果实中的原果胶和纤维素逐渐被降解,可溶性果胶和可溶性的糖不断增加,细胞中的淀粉粒逐渐消失,细胞间隙增大,细胞壁结构变得松散,果肉逐渐变软[19⇓-21]。刘光财[21]研究发现,有3个α-淀粉酶和4个β-淀粉酶基因参与了菠萝蜜果实后熟过程中淀粉的降解。董黎梨等[22]发现,β-半乳糖苷酶在湿苞菠萝蜜果实的成熟过程中呈现先增后降的趋势,说明它与菠萝蜜果实的成熟软化有关。许多研究表明,PG参与了多种果实的成熟软化,但在菠萝蜜果实的成熟软化中研究较少。鉴于此,本研究以‘海大2号’菠萝蜜果实为研究材料,克隆并结合不同采后处理研究了菠萝蜜PG基因在贮藏期间的表达特性,以期揭示菠萝蜜PG基因在其果实后熟软化过程中的作用,并为采取适宜措施延长菠萝蜜果实的货架期提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为‘海大2号’干苞型菠萝蜜品种果实,采自廉江市石头岭镇某农户果园。在果实盛花期挂牌,花后约150 d采收。果实采后立即运回实验室,选择成熟度和大小一致、无病虫伤的果实,分为3组,分别进行1000 mg/L ETH溶液浸泡和0.5 mg/L 1-MCP熏蒸处理,具体操作参照王俊宁等[20]的方法,以未经处理的果实为对照（CK）。处理后将3组材料均放在22℃、90%的相对湿度条件下自然成熟。因不同处理果实成熟进程不同,采用不同间隔时间取样：对照（CK）每天取样;ETH处理每0.5 d取样;1-MCP处理在第0、4、8、10、12、14、16天取样。每次取3~5个果,将果肉分离出来并切成小块,混匀,液氮速冻后,存于-80℃超低温冰箱中备用。

1.2 方法

1.2.1 果肉硬度测定

每个果任取10个果苞,用刀片从侧面划开,去除种子,用FTC TMS-PRO质构仪（美国）进行测定,每个果苞测定2次,取平均值。质构仪测定的条件：Test Speed：60 mm/s,Trigger Force：0.5 N,探头选择：直径5 mm。

1.2.2 果胶的提取和测定

果胶的提取：取2 g菠萝蜜果肉,加5 mL 80%乙醇煮20 min,冷却后8000 r/min离心10 min,弃上清,然后使用20 mL 80%乙醇和丙酮分别重新离心洗2遍,得到粗细胞壁,然后在45℃干燥,称重即得细胞壁物质含量。称取烘干的细胞壁物质50 mg,按以下步骤依次提取不同成分：用10 mL 50 mmo1/L的乙酸钠（pH 6.5）提取得到WSP;用10 mL 50 mmol/L EDTA和乙酸钠（pH 6.5）提取离心得到ISP;用10 mL 50 mmo1/L的Na2CO3（含2 mmol/L EDTA）提取得到CSP。果胶的测定：采用咔唑比色法[23],以每克新鲜组织中含有半乳糖醛酸的毫克数来表示（mg/g）。

1.2.3 总RNA的提取和反转录

采用Plant Kit超快型植物RNA提取试剂盒（华越洋）提取菠萝蜜果肉总RNA。以提取的RNA为模板,采用cDNA合成试剂盒反转录合成第一链cDNA。

1.2.4 PCR引物设计及合成

AhePG1~AhePG4基因的全长cDNA引物采用Primer Premier 5.0 软件进行设计,委托上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。
表1 基因全长引物序列

Tab. 1 Gene full length primer sequence

引物名称 Primer name 引物序列（5°-3°）
Primer sequence (5°-3°)
AhePG1-F ATGGCAATTCTAACAACTCCTTTCAGAATC
AhePG1-R TTACAAGCAACTGGAAGGCTGGACTTG
AhePG2-F ATGGCAAGAACAAGAATTCAAATCCTCGTATATC
AhePG2-R TTATACAATGGTTTTTGCCTCGTATCCCAG
AhePG3-F ATGCTACTGGTATTGCTCTTGCTGTTCTTG
AhePG3-R TCATAAAGCTGCGGATTTTCCATATAAAGTTGG
AhePG4-F ATGGAGGCTCTTCTAAAATCCAGAAAATCTC
AhePG4-R CTATTTCAAAGAACAAACCTTCAAAGGAACAC

1.2.5 PG基因的cDNA克隆与表达分析

以‘海大2号’菠萝蜜果实的cDNA为模板,进行PCR扩增。目的片段经回收、连接转化后,阳性克隆检测测序,得到AhePG1~AhePG4基因的全长序列。
选用AheGAPDH为内参基因,根据AhePG1~ AhePG4基因的全长设计荧光定量引物（表2）。qPCR扩增程序如下：94℃,1 min;94℃,5 s,55℃,30 s,72℃,30 s,39个循环。基因相对表达量采用2-ΔΔCT的方法进行计算。
表2 基因荧光定量引物序列

Tab. 2 Gene quantitative PCR primer sequence

引物名称
Primer name		 引物序列（5°-3°）
Primer sequence (5°-3°)
AheGAPDH-qup AATGTCCTTCCGAGTTCCTA
AheGAPDH-qdw ATCATCCTCAGTGTAACCCAAA
AhePG1-qup TGCCTCCGCCACCTACAAT
AhePG1-qdw AGCGTTTCCGATAACCCAG
AhePG2-qup GTTCTCCCTCGTTCAATCCCTT
AhePG2-qdw TCCGCTCGTCAAACCTCT
AhePG3-qup TGGTTTGGTGGGATTGGTTTAG
AhePG3-qdw GAGAGTCCGATGGGGTGATGA
AhePG4-qup TGGCGTTGGAGATGGAAAA
AhePG4-qdw GGGTGAAGTGGCTGGTAAGATT

1.2.6 生物信息学分析

使用在线软件ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）预测菠萝蜜PG编码蛋白的基本理化性质;用在线软件SoftBerry ProtComp 9.0（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）进行其亚细胞定位预测;用NetPhos 3.1 Server和DictyOGlyc 1.1 Server软件进行NAC编码蛋白质磷酸化和糖基化位点预测;用在线软件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测PG编码蛋白的二级结构;运用在线软件Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page）构建其蛋白的三级结构模型;在TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）下载拟南芥PG蛋白全长序列;用软件Clustalx和GENEDOC进行不同物种PG氨基酸多重匹配分析;在软件MEGA7.0上使用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树;利用Pfam 34.0（http://pfam.xfam.org/）数据库分析菠萝蜜PG蛋白保守区域,利用MEME软件分析其保守基序。

1.3 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 25.0软件进行数据统计,Origin Lab Origin 2019软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 不同处理菠萝蜜果实硬度的影响

果实硬度是衡量菠萝蜜果实后熟程度的重要标准,采摘时果肉质地较硬,为(13.78±0.50)kg/cm2（图1）。正常后熟的菠萝蜜果实前2 d硬度变化较小,第3~4天果实快速软化,之后4 d果实软化速率减缓;ETH处理加速了果实的软化,并提高了果肉软化速率,处理后的果肉迅速软化,第2.5天果肉硬度已接近最低值[(6.91±0.55)kg/cm2];1-MCP处理减缓了果实软化速率,前9 d果实硬度仅降低8.49%,为(12.61±0.52)kg/cm2,之后开始加速软化,12 d后果肉硬度降至(4.50±0.12)kg/cm2。
图1 不同处理对果实硬度的影响

Fig. 1 Effects of different treatments on jackfrui hardness

2.2 不同处理对菠萝蜜果实WSP、ISP、CSP的影响

如图2所示,自然成熟的菠萝蜜果实WSP含量随着成熟度的进程不断增加;ETH处理加速了WSP含量的增加,在贮藏0.5 d时就达到最大[(6.06±0.07)mg/g],然后迅速回落,之后变化不大;1-MCP处理之后果实的WSP含量迅速增加并维持较高的水平,在整个贮藏期间远高于对照和ETH处理。ISP含量也随着果实的成熟不断增加,ETH和1-MCP处理均增加了贮藏期间果实的ISP含量。CSP含量在自然成熟的前2 d略有下降,之后开始增加,于贮藏第4天达到高峰;ETH处理在贮藏第1天下降到最低后开始增加;而1-MCP处理的CSP含量则是在贮藏第10天出现高峰后开始下降。
图2 不同处理对水溶性果胶、离子结合果胶和共价结合态果胶含量的影响

Fig. 2 Effects of different treatments on content of water-soluble pectin, ion-bound pectin, and covalently bound pectin

2.3 菠萝蜜AhePG的克隆和生物信息学分析

从菠萝蜜果实转录组库中,挑选到4个PG基因的序列,分别命名为AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4,经过一系列PCR扩增和测序后,最终获得它们的全长cDNA序列,分别为1221、1416、1371、1434 bp。采用生物信息学在线软件分析发现,AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4基因分别编码406、471、456、477个氨基酸,分子量分别为52.27、42.55、51.95、49.00 kDa;在AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4蛋白的氨基酸组成中,甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）含量最高,其次含量较高的AhePG3/4为亮氨酸（Leu）,AhePG1和AhePG2分别为丙氨酸（Ala）和缬氨酸（Val）;AhePG1和AhePG4编码蛋白属于稳定性的碱性蛋白,AhePG2为不稳定的碱性蛋白,而AhePG3为不稳定的酸性蛋白;AhePG2、AhePG3、AhePG4为疏水性蛋白,而AhePG1为亲水性蛋白（表3）。
表3 AhePG蛋白的理化性质

Tab. 3 Physical and chemical properties of AhePG proteins

蛋白名称
Protein name		 氨基酸数Number of amino acid 分子质量
Molecular weight/kDa		 等电点
pI		 脂肪系数Aliphatic
index		 不稳定系数Instability index 亲水性Hydropathicity 含量最多的3种氨基酸及占比Three most abundant amino acids and ratio
AhePG1 406 42.55 8.84
(碱性）		 81.43 30.88
(稳定)		 0.030
（亲水）		 Ser, 10.3%
Gly, 9.1%
Ala, 8.6%
AhePG2 471 52.27 6.41
(碱性）		 82.36 44.22
(不稳定)		 -0.145
（疏水）		 Gly, 10.3%
Ser, 7.6%
Val, 7.2%
AhePG3 456 49.00 5.31
(酸性）		 90.18 43.66
(不稳定)		 -0.038
（疏水）		 Ser, 11.6%
Gly, 10.5%
Leu, 9.4%
AhePG4 477 51.95 8.54
(碱性）		 87.09 31.41
(稳定)		 -0.181
（疏水）		 Gly, 9.0%
Ser, 8.2%
Leu, 8.2%
利用SoftBerry ProtComp 9.0软件对4个PG蛋白进行亚细胞定位预测发现,AhePG1蛋白定位在胞外上、AhePG3、AhePG4蛋白均定位在质膜上的分值最高（共10分：数值越高表示可信度越大）（表4）,说明AhePG1蛋白可能定位于胞外,AhePG3、AhePG4蛋白可能定位于质膜上;而AhePG2蛋白定位在胞外、过氧化物酶体、叶绿体、细胞质、线粒体等部位的分值差异不大,它可能在胞外、过氧化物酶体、叶绿体、细胞质、线粒体等部位均有分布。
表4 AhePG蛋白的亚细胞定位预测

Tab. 4 Prediction of subcellular localization of AhePG proteins

定位Location AhePG1 AhePG2 AhePG3 AhePG4
细胞核 0.00 0.00 0.00 0.00
质膜 0.43 0.00 8.54 8.92
胞外 9.46 2.34 0.00 0.00
细胞质 0.00 1.67 0.00 0.00
线粒体 0.05 1.14 0.49 0.44
细胞质内层 0.00 0.00 0.00 0.00
过氧化物酶体 0.06 2.20 0.13 0.14
高尔基体 0.00 0.96 0.00 0.00
叶绿体 0.00 1.69 0.85 0.47
液泡 0.00 0.00 0.00 0.03
糖基化位点预测发现,AhePG1、AhePG2、AhePG3蛋白分别在第223、47和230个氨基酸的位置均有1个丝氨酸Ser的糖基化位点,而AhePG4蛋白无糖基化位点。磷酸化位点预测显示,AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4蛋白分别含有46、45、48和47个磷酸化位点,包括丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3种磷酸化位点（表5）,其中,丝氨酸被磷酸化的位点数目多,分布均匀集中,而酪氨酸被磷酸化的位点分布相对稀少。PHD软件预测发现,4个PG蛋白质的二级结构均由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成,其中无规则卷曲和延伸链是它们的主要组分,延伸链均匀分布在整条肽链,α-螺旋含量较少,且集中在N端（AhePG4除外,它的N端和C端具有α-螺旋）（表5）,这一点在其三维结构上得到了印证（图3）。
表5 AhePG蛋白磷酸化和糖基化位点及二级结构组分

Tab. 5 Phosphorylation and glycosylation sites and secondary structure components of AhePG proteins

蛋白名称
Protein name		 糖基化位点数Number of glycosylation sites/piece 磷酸化位点数
Number of phosphorylation sites/piece		 二级结构组分
Secondary structure component/%
丝氨酸
Ser		 苏氨酸
Thr		 酪氨酸
Tyr		 α-螺旋
α-helix		 β-折叠
β-sheet		 β-转角
β-turn		 无规则卷曲Random coil
AhePG1 1 29 13 4 12.07 39.41 5.91 42.61
AhePG2 1 28 13 4 10.62 35.46 7.22 46.71
AhePG3 1 32 10 6 10.53 31.80 7.24 50.44
AhePG2 0 27 16 4 11.32 32.08 6.29 50.31
图3 AhePG基因编码蛋白的三级结构预测

Fig. 3 Prediction of tertiary structure of protein encoded by AhePG genes

通过NCBI进行序列比对分析,将AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4氨基酸序列与GenBank中登录的桃、欧洲李、杏、白梨、西洋梨、沙梨、菜豆等氨基酸序列比对,发现AhePG1氨基酸序列与GenBank中登录的桃（AF095577.1、KF976393.1）相似性最高,分别是75.63%、75.54%;AhePG2氨基酸序列与菜豆（XM_ 007162208.1）氨基酸相似性最高,为73.11%;而AhePG3氨基酸序列与葎草（MN971583.1）、菜豆（XM_007154258.1）的氨基酸序列相似性最高,分别为79.71%和75.71%;而AhePG4氨基酸序列与菜豆（XM_007151391.1）的氨基酸序列相似性最高,为70.75%。
对AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4蛋白进行多重序列比对（图4）,发现AhePG1包含PG蛋白特有的4个保守结构域,结构域Ⅰ（SPNTDG）、结构域Ⅱ（GDDC）、结构域Ⅲ（CGPGHGISIGSLG）和结构域Ⅳ（RIK）;AhePG2和AhePG3只包含Ⅰ、Ⅱ 2个结构域,缺失结构域Ⅲ和结构域Ⅳ;AhePG4包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ3个结构域,缺失结构域Ⅲ。此外,在AhePG2和AhePG3蛋白保守基序中还存在个别氨基酸发生变异,如在AhePG2蛋白中,结构域I的保守基序‘SPNTDG’中的“S”变成“T”;在AhePG3蛋白中,结构域Ⅰ的保守基序‘SPNTDG’中的“N”变成“Y”,“D”变成“L”,结构域Ⅱ的保守基序‘GDDC’中的第一个“D”变成“Y”。
图4 AhePG蛋白的多重序列比对

Fig. 4 Alignment of amino acid sequence of AhePG proteins

用MEME工具对菠萝蜜AhePG蛋白的保守基序进行搜索分析,得到3个保守基序,分别命名为基序motif 1~motif 3（图5）,分析发现Motif 1为AhePG蛋白的保守基序,对应‘SPNTDGI’与‘GDDC’,此外Motif 2也具有较高的保守性,可能与菠萝蜜AhePG蛋白自身以及它们在不同组织的特异性有关。
图5 AhePG蛋白保守基序分析

Fig. 5 AhePG proteins conserved motif analysis

为了解AhePG的进化关系,使用软件MEGA7将4个AhePG基因与66个拟南芥PG基因构建系统进化树,按照置信值大小划分,所选的PG蛋白质可分为6个组（clade1~clade6),AhePG2、AhePG3和AhePG4处于同一个分支（clade2）中,而AhePG1单独在一个分支（clade5）。由进化树可知,菠萝蜜PG基因在拟南芥PG基因中有同源基因,AhePG1与AT3G59850.1,AhePG2与AT3G57790.1,AhePG3与AT3G16850.1,AhePG4与AT2G23900.1（图6）。
图6 PG基因进化树结构图

Fig. 6 Evolution tree structure diagram of PG gene

2.4 不同处理对菠萝蜜成熟过程中PG基因表达的影响

如图7所示,在自然后熟过程中,AhePG1基因的相对表达量在贮藏前2 d变化不大,第3天上升缓慢,之后迅速增加,于第4天开始接近最大（15.16±1.68）,并维持高水平表达;ETH处理的AhePG1基因表达变化不大;1-MCP处理降低了前8 d中AhePG1基因的表达,第8天的表达量为1.38±0.23,之后开始上升,于第10天达到最大（12.29±0.86）后开始下降。AhePG2基因在采后前2 d表达量有所下降,第3天起开始缓慢上升,第4天达到最大后开始下降;ETH处理抑制了前期AhePG2基因表达的下降,于第1.5天达到最大后开始下降;1-MCP处理抑制了贮藏前4 d AhePG2基因的相对表达,随后其表达量开始上升,于第10天达到最大（4.85±1.04）后开始下降。AhePG3、AhePG4基因的相对表达量相似,在自然成熟过程中,它们的相对表达量在贮藏第1天变化不大,第2天起开始增加,于第4天达到最大（分别为2.98±0.86、2.08±0.46）后开始下降。ETH处理加快了AhePG3、AhePG4基因的表达,于第1.5天达到最大后（分别为5.38±0.74、5.00±0.69）开始下降。1-MCP处理抑制了AhePG3基因在贮藏前8 d和AhePG4基因在贮藏前4 d的相对表达量（与第0天比变化不大）,但在随后的成熟过程中,2个基因的表达迅速升高,均于第10天达到最大（分别为14.06±1.57、11.11±1.17）后开始下降,在第12天基本不表达。
图7 AhePG基因的相对表达量

Fig. 7 Relative expression levels of AhePG genes

2.5 各指标的相关性分析

用正常成熟的菠萝蜜果实的硬度、WSP、ISP、CSP、AhePG1~AhePG4基因的表达水平作相关性分析发现,果肉硬度与3种形态的果胶——WSP、ISP、CSP均呈负相关,其中与WSP的相关性为-0.895,达到显著水平;与AhePG1~AhePG3基因的相对表达量也呈负相关,其中与AhePG1的相关性达到极显著水平（-0.976）。此外,WSP含量与AhePG1基因的相对表达量的相关系数为0.838,达到显著水平（表6）。
表6 各指标间相关性分析

Tab. 6 Correlation analysis among various indicators

项目Item 硬度Hardness WSP ISP CSP AhePG1 AhePG2 AhePG3 AhePG4
硬度 1
WSP -0.895* 1
ISP -0.642 0.613 1
CSP -0.500 0.234 -0.031 1
AhePG1 -0.976** 0.838* 0.505 0.619 1
AhePG2 -0.039 -0.290 -0.120 0.713 0.082 1
AhePG3 -0.281 0.063 0.576 0.479 0.229 0.659 1
AhePG4 0.057 -0.198 0.435 0.243 -0.122 0.587 0.934** 1

注：*表示显著相关（P<0.05）,**表示极显著相关（P<0.01）。

Note: * indicates significant correlation (P<0.05), ** indicates extremely significant correlation (P<0.01).

3 讨论

在猕猴桃果实贮藏过程中,果实的软化与果肉中果胶物质的降解密切相关[24]。杨德兴等[25]发现,随着猕猴桃果实的成熟软化,PG酶活性不断增加,原果胶逐步降解成WSP。在8个不同品种的秋子梨果实软化前后,果肉中的硬度和水溶性果胶含量变化较大,且果肉硬度与水溶性果胶和离子结合果胶含量间均呈显著负相关,而与共价结合态果胶含量间呈极显著正相关[4]。本研究发现,随着菠萝蜜果实的成熟,果肉硬度快速下降,可溶性果胶和离子型果胶不断增加,共价态果胶有所下降,果实迅速软化,且果肉硬度与3种类型的果胶含量均呈负相关,其中与水溶性果胶达到显著的水平,这与前人[4,9]的研究有类似的地方,但又有不同,这可能是物种的不同引起的。邵远志等[26]发现,ETH处理可以促进番木瓜果实中原果胶的分解和WSP含量的上升,而1-MCP处理则极显著延缓了WSP含量的上升。1-MCP处理抑制了库勒香梨CSP的分解,降低了WSP、ISP的上升程度[27]。ETH处理促进了菠萝蜜WSP和ISP含量的上升,加速了果实软化的进程,这与邵远志等[26]的研究结果一致;而1-MCP处理抑制了果实贮藏前期果肉硬度的下降,推迟了果实的软化进程,但明显提高了3种果胶的含量,这与杨玉荣[27]的研究结果不相符。
PG是一个庞大的基因家族,其蛋白一般具有4个典型的保守结构区域（Ⅰ,SPNTDGI;Ⅱ,GDDC;Ⅲ,CGPGHGIS;Ⅳ,RIK）,但仍有少部分蛋白只含PG蛋白的部分保守结构域,甚至缺失保守域[1,16 -17]。如枣上有41个ZjPG基因,其中只有36个ZjPG蛋白具有完整的保守结构域[1];在苹果的85个MdPG中,大部分MdPG蛋白都含有完整或趋于完整的保守结构域,有少数MdPG蛋白存在缺少或缺失现象[16];又如桃分支E中的13个PG蛋白只具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ这3个结构域,都缺少结构域Ⅳ,分支G中的PpaPG82、PpaPG83、PpaPG84不含结构域Ⅰ-Ⅳ[17]。本研究从菠萝蜜果实中获得4个PG基因AhePG1、AhePG2、AhePG3、AhePG4,编码406~477个氨基酸,其蛋白的二级结构主要由延伸链和无规则卷曲组成,α-螺旋比例较少且集中在N端,这与‘携李’[28]的PsPG蛋白类似。AhePG1蛋白含有4个保守结构域,AhePG2、AhePG3只包有结构域Ⅰ、Ⅱ,缺失结构域Ⅲ和Ⅳ;AhePG4含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ三个结构域,缺失结构域III,这与前人[1,16 -17]的研究结果相似。此外,在AhePG2、AhePG3蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ的保守基序中也存在个别氨基酸的变异,这与苹果[16]上的研究类似。用MEME工具对苹果、冬枣、桃中PG蛋白的保守基序搜索分析发现,它们分别含有10、8、6个保守基序（motif 1~motif 10）[1,16 -17],并且同一物种的不同PG成员所包含的保守基序也不同。本研究在AhePG1~AhePG4蛋白中只搜索到3个保守基序（motif 1~motif 3）,可见,PG蛋白中保守基序的数量因物种和PG成员的不同而异。
研究发现,PG基因参与果实的成熟软化。猕猴桃中有11个AcPG基因在软化果实中高或中度表达,其中AcPG4、AcPG18和AcPG8 3个AcPG基因与PG活性、果胶含量和果实硬度的特征密切相关,认为它们可能在果实软化中发挥重要作用[29]。代学慧等[12]发现,杧果中有4个PG基因（mango034432、mango010108、mango029745、mango008398）随果实后熟而表达量增加且表达量较高,同时与杧果果实软化、细胞壁结构变松散的变化趋势一致,其中mango029745和mango034432又与已鉴定的在果实软化中具有功能活性的基因聚在一起,因此被认为最有可能是杧果果实软化中的关键PG基因。cpPG1基因在番木瓜果实软化过程起核心作用[30]。‘携李’PsPG基因在果实成熟的后期表达较高,参与果实后期的软化[28]。本研究发现,AhePG1基因在果实成熟前期表达量低,但在成熟后期高表达,AhePG2、AhePG3、AhePG4基因虽随果实的成熟表达有所增高,但表达量总体较低。相关性分析发现,AhePG1基因与果实的硬度呈极显著的负相关,与水溶性果胶含量呈极显著正相关。可见,AhePG1可能是菠萝蜜果实果胶降解和果实软化的关键PG基因,控制着果实成熟后期的软化。
与软化相关的PG基因表达受乙烯的调控。南果梨PuPG1、PuPG4、PuPG7基因和番茄PG基因的表达量在果实成熟过程中都随乙烯生成量的增加而逐渐升高[31-32]。外源乙烯或ETH处理果实,可诱导南果梨的PuPG1、PuPG4、PuPG7基因[31]、金冠苹果PG基因[33]和猕猴桃AdPG1基因[34]的表达量,但在杧果上,有7个PG基因随果实的成熟而表达量下降[12],外源ETH处理抑制了猕猴桃AdPG10、AdPG12基因的表达[34]。本研究发现,ETH处理降低了AhePG1基因的表达量,但略提高了AhePG2~AhePG4基因的表达。可见,不同的PG基因,其表达受乙烯的影响不同。1-MCP作为乙烯受体抑制剂,一般会抑制PG基因的表达[31,33 -34]。‘槜李’经1-MCP处理之后,PsPG基因的表达受到抑制,果实硬度下降趋势减缓[28]。1-MCP处理柿果实,抑制了DkPG1基因的表达上升,延缓了PG酶活性峰[35]。1-MCP处理菠萝蜜,延缓了4个AhePG表达量的增加,但在该处理果实的后期成熟过程中,却增加了AhePG2~ AhePG4基因的表达,对AhePG1基因的表达影响不大。说明,1-MCP处理能延缓菠萝蜜果实的成熟,但并不影响果实后期成熟时的软化,AhePG1~ AhePG4基因可能对其果实后期的软化均有作用。

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