李是蔷薇科李属植物,不仅具有较高的营养价值,能提供人体所需的维生素、类胡萝卜素、矿质元素、纤维素外,也具有较高的药用保健价值[1,2,3]。李果实色泽艳丽,风味酸甜爽口,营养丰富,既可鲜食,也可加工成李干、果脯、果汁、果酒等产品。李果实颜色多样,花色苷是影响李果实色泽和功能的重要物质[4],其在果实中的种类和含量的多少不仅使李呈现不同的颜色,也是李保健功能高低的重要指标之一。
‘芙蓉李’是福建省地理标志产品,其果实红皮红肉,极具特色,既可鲜食又可加工。该品种不仅在福建省栽培历史悠久,而且广泛分布于其他李产区,对我国南方李产业影响巨大。研究认为[4],花色苷是‘芙蓉李’中主要的呈色和功能性物质,具有较大的开发潜力。然而,花色苷的性质极不稳定,已有研究表明花色苷极易受温度、pH等的影响,光照、金属离子等也会引起花色苷的降解[5,6,7],从而影响贮藏保鲜果的色泽及果汁、果酒等加工产品的营养品质;也有研究指出抗坏血酸含量对贮藏期间血橙汁的聚合物颜色及褐变指数有较大影响[8]。然而,目前有关蓝莓、葡萄等[9,10]水果花色苷稳定性的研究较多,但李花色苷稳定性的研究鲜有报导。因此,本文以‘芙蓉李’为材料,选择对花色苷稳定性影响较大的温度、pH等因子,以及研究较多的光照、金属离子、氧化剂、还原剂等因子,探讨‘芙蓉李’花色苷保持色泽的有利条件,为‘芙蓉李’花色苷在果汁饮料、果酒等方面的开发利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 试验原料为红皮红肉的‘芙蓉李’（Prunus salicina Lindl.）,选择无坏果、虫果的成熟‘芙蓉李’,采摘时果实可溶性固形物为12.0%~13.4%,采自福建省农业科学院果树研究所古田基地。取样时,选择树体东、南、西、北4个方向高度、果实大小及成熟度相对均匀一致的果实60个,取样后迅速装入有冰袋的保鲜盒中并运回实验室;再取果实鲜样,切碎,混匀后放入-80 ℃超低温冰箱中速冻备用。
1.1.2 仪器及试剂 TU-1900双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;FG2型便携式pH计,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;HR1871型飞利浦榨汁机,飞利浦（中国）投资有限公司;RE52CS型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。所用化学试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 ‘芙蓉李’花色苷粗提物制备 从超低温冰箱中取‘芙蓉李’果实50 g,料理机粉碎,用体积分数为49.5%的甲醇（CH3OH∶HCl∶H2O = 50∶0.5∶49.5）按照1∶5（g∶mL）的比例混合均匀,超声1 h,抽滤以及收集提取液,收集滤渣重复以上步骤2次,收集合并提取液,定容至1000 mL备用。
1.2.2 温度对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 量取提取液25 mL于三角瓶中,分别在4、25、40、60、80 ℃下保温,分别于1、2、6、12、24 h后取出,冷却后,测定吸光值并观察溶液颜色的变化。
1.2.3 pH对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 量取提取液25 mL于三角瓶中,用HCl或NaOH调节提取液的pH至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0,室温下分别放置0、1、2、6、12 h后测定吸光值。
1.2.4 光照对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 量取提取液25 mL于三角瓶中,分别放置于黑暗中和自然光下室温放置,每隔24 h测定吸光度,连续测定5 d。
1.2.5 金属离子对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 量取提取液25 mL于三角瓶中,向提取液中分别加入AlCl3、KCl,使其浓度梯度分别为0.01、0.05、0.1、0.2 mol/L,以及加入FeCl3,浓度梯度为0.0005、0.001、0.005、0.01 mol/L,室温放置0、1、12、24 h后测定提取液的吸光值。
1.2.6 H2O2对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 量取提取液25 mL于三角瓶中,向提取液中加入H2O2,使其浓度分别为0.01%、0.1%、0.5%,室温放置0、1、12、24 h后测定溶液吸光值。
1.2.7 维生素C对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 量取提取液25 mL于三角瓶中,向提取液加入维生素C,使其浓度分别为0.5%、1%、2%、3%,室温分别放置0、1、12、24 h测定吸光值。
1.2.8 花色苷含量的测定 采用pH示差法[4]进行测定：取2 mL浸提液于10 mL容量瓶中,分别用pH 1.0的KCI-HCI缓冲液、pH 4.5的乙酸钠-盐酸缓冲液（0.12 mol/L）,稀释至10 mL,混匀后用蒸馏水作对照,用分光光度计分别在520、700 nm下测光密度值。
$花色素苷含量\left( \text{mg/100 g} \right)=\frac{A\times \text{MW}\times \text{DF}\times V\times 100}{\left( \varepsilon \times L \right)\times Wt}$
式中：A-吸光度差;ε-矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数,26900;DF-稀释因子;MW-矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量,449.2;V-最终体积,L;Wt-样品重量,g; L-光程,1 cm;A=(A520-A700)pH1.0- (A520-A700)pH4.5。
1.3 数据处理
所有试验均重复3次,取平均值进行数据分析和比较。使用Excel 2007软件进行整理数据及绘图,采用SPSS12.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 温度对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响
由图1所示,随温度升高和时间延长,花色苷整体呈下降趋势。当温度<60 ℃时,在保存的0~1 h内是花色苷变化最快的时刻,保存到1 h时,在4、25、40、60 ℃时花色苷含量分别下降到86.31%、85.40%、85.39%、84.49%;1~2 h内花色苷的含量变化较小,分别仅为1 h时的1.06%、1.60%、1.07%、2.16%。此后随着时间延长,4、25 ℃时花色苷含量缓慢下降,到24 h时分别下降到76.27%、73.53%;40、60 ℃时花色苷含量下降较快,到24 h时分别为63.02%、56.17%。温度60 ℃时,随时间延长,花色苷含量下降趋势,至24 h时仅为10.50%。进一步对4、25、40、60 ℃时,6、12、24 h时花色苷的含量进行方差分析,结果表明：不同时间点时不同处理间的差异均达到显著水平（p<0.05）;6 h时,4、25、40 ℃温度处理间差异不显著但含量显著高于60 ℃处理;12 h时,4、25 ℃温度处理间差异不显著但含量显著高于40、60 ℃处理;24 h时的差异与24 h时相同。由此可见,温度较低时,花色苷降解减缓,有利于李花色苷的保存。
2.2 pH对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响
由图2所示,pH越低越利于‘芙蓉李’花色苷的保存。不同pH,花色苷的保存率差异明显,随pH增大、提取液酸性变小,花色苷保存率逐渐下降;但在同一pH条件下,延长保存时间对花色苷的保存量影响很小。值得一提的是,当pH调整为1.0时,花色苷的含量略高于提取液中的含量,这可能与花色苷在不同pH条件下的存在状态有关。对不同pH、不同时间点的处理进行方差分析表明,不同处理间差异极显著（p<0.01）,但pH 1.0和pH 3.0的处理在不同时间点时差异均不显著。
2.3 光照对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响
由图3可知,光照与否对‘芙蓉李’花色苷的稳定性有较大影响,遮光处理可减缓花色苷的降解。由结果可知,遮光与否在24 h内对花色苷稳定性的影响相差不明显,但随时间延长,当处理48 h时,遮光处理的花色苷保存率为98.99%,而自然光照处理的仅为96.67%;随后,随时间延长,2种处理时花色苷的降解趋势相同。对这2种处理方式在不同时间点的差异进行分析表明,两者间差异不显著（p>0.05）。由此可见,光照不是影响‘芙蓉李’花色苷稳定性的主要因素。
2.4 金属离子对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响
2.4.1 K+对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 由图4可以看出,加入离子时,溶液中花色苷的瞬时含量降低,但随着时间延长,溶液中李花色苷的含量逐渐增加,且浓度越高增加速度越快,当保存到1 h,溶液中花色苷的含量高于对照中。由此可知,随着时间延长,含K+的花色苷保存率和对照组相比均有大幅增加;方差分析结果显示,当处理时间为1、12、24 h时,不同浓度处理间的差异不显著（p>0.05）。因此,虽然K+能够增加李花色苷的稳定性,且K+浓度越高对李花色苷的稳定性越有利,但浓度为0.01 mol/L时已能起到较好的保护作用,此后增加浓度,花色苷的保存率虽有所增加,但效果不显著。
2.4.2 Al3+对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 由图5可以看出,加入离子时,溶液中花色苷的瞬时含量亦降低;随着时间延长,溶液中花色苷的含量逐渐增加,但趋势较缓;当保存到24 h,溶液中花色苷的含量除低浓度组外,其余仍低于对照中。由此可知,随着时间延长,含Al3+的花色苷保存率和对照组虽有所增加,但总体低于对照,Al3+对保持‘芙蓉李’花色苷的稳定性不利,在不同时间点,各处理间差异极显著（p<0.01）。
2.4.3 Fe3+对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响 由图6可知,Fe3+对‘芙蓉李’花色苷稳定性也存在与K+、Al3+相同的趋势,即加入离子时,溶液中花色苷的瞬时含量降低,但随着时间延长,溶液中花色苷的含量有所增加,不同的是,Fe3+浓度低时溶液中花色苷的含量增加较快,Fe3+浓度越高即达到0.01 mol/L时,当保存时间超过1 h,溶液中的花色苷含量反而下降。在不同时间点,各处理间差异也达到极显著水平（p<0.01）。由此可见,低浓度的Fe3+有利于‘芙蓉李’花色苷的保存。
2.5 氧化还原剂对‘芙蓉李’花色苷稳定性的影响
3 讨论
研究表明,不同的温度和pH影响花色苷的稳定性及花色苷的降解速度[11,12,13]。在水溶液及食品中,温度和pH均会影响花色苷的结构,使其可能存在4种结构：蓝色的醌式碱（A）、红色黄烊阳离子（AH+）、无色的甲醇碱或甲醇假碱（B）和查尔酮（C）。在这4种结构中存在着相对平衡的关系,互相转换易受温度和pH的影响,即加热花色苷溶液或碱化时,平衡向无色的查耳酮（C）方向进行,同时引起黄烊阳离子（AH+）的降低;当冷却和酸化时,醌式碱（A）和假碱（B）迅速变成阳离子（AH+）,但是查耳酮（C）的变化相当慢。本研究结果表明,‘芙蓉李’花色苷在低于60 ℃条件下比较稳定,2 h后保存率仍可达82.66%以上,溶液颜色变化不大;但当温度提高到80 ℃,溶液颜色迅速减退,保存率下降较快。其结果说明‘芙蓉李’花色苷具有一定的耐热性,但在加工时要尽量避免高温和长时间处理。此外,花色苷在酸性介质中比碱性介质中相对稳定,从本研究pH的影响结果来看,酸性条件确实有利于‘芙蓉李’花色苷的稳定,且pH越低保存效果越好。
光照也是影响花色苷稳定性的因素之一,但本研究表明光照能加速‘芙蓉李’花色苷的降解,但其影响程度较小,而Ochoa等[14]的研究认为光可使树莓、甜樱桃及酸樱桃中的花青素发生明显降解。金属离子也可影响花色苷的稳定性,如本研究结果显示高浓度的K+离子和低浓度的Fe3+离子可增强李花色苷的稳定性,而Al3+会使李花色苷的稳定性下降。不过不同金属离子对不同植物来源花色苷的稳定性不同,房岩强等[15]研究发现,金属离子Al3+对紫色马铃薯花色苷的色泽无不良影响,而Fe3+影响显著;李颖畅等[16]研究发现,Al3+对蓝莓花色苷的稳定性无显著影响,Na+、Zn2+、Mn2+能够增强花色苷的稳定性,而Fe3+对花色苷具有破坏作用;张志博等[17]研究发现Fe3+对越橘花色苷有一定的保护作用。
此外,氧化剂也会影响花色苷的稳定性。本研究结果显示H2O2对‘芙蓉李’花色苷具有强破坏作用,维生素C虽然在短期内对‘芙蓉李’花色苷有一定的增色作用,但对其稳定性也有破坏作用,主要是由于‘芙蓉李’花色苷富含的酚羟基易被氧化剂氧化,从而导致花色苷降解和褪色。因此在加工和利用中应尽量避免使用H2O2,维生素C也不宜作为护色剂或抗氧化剂添加到加工品中。