天然橡胶（natural rubber）主要是由橡胶树生产的一种不可替代、具有高价值的高分子量生物聚合物,具有许多合成橡胶不具备的特性,可用于生产包括轮胎和医用手套在内的约5万种橡胶产品,对运输、医药和国防等行业至关重要[1]。世界上有超过2500多种植物可生产天然橡胶[2],目前只有以无性系、芽接苗、组培苗和转基因苗等种植生长在热带亚热带胶园的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是天然橡胶的唯一商业来源[3]。我国的橡胶主要种植在海南、云南和广东等省份的热带及亚热带地区[4],随着对天然橡胶需求的日益增长,有效提高橡胶产量和品质在橡胶树产胶研究中愈发重要。橡胶树依靠自身的乳管系统进行产胶,乳管分布在橡胶树树皮内侧,是由薄壁细胞组成的胶乳合成和储存场所[5]。胶乳由橡胶粒子、C-乳清和黄色体组成,其中橡胶粒子是最主要的构成成分,占30%~ 40%[6]。C-乳清是乳管细胞的胞质,与细胞代谢有直接的关联[7]。黄色体含有大量蛋白质,二价阳离子和酶可保证胶乳处于平稳状态[8]。排胶即橡胶树乳管割断和机械损伤后胶乳溢出的过程[9]。胶乳从乳管中流出的速度由急至缓,最后停止排胶,每次每株树可收集到数量不等的胶乳,排胶持续时间是决定橡胶产量的关键因素之一。排胶是巴西橡胶树胶乳采收的重要环节,占生产成本的60%,是橡胶产业提质增效的关键环节[10⇓⇓⇓⇓-15]。近年来,天然橡胶异戊二烯途径合成与调控机制、胶乳诊断指标、乳管伤口堵塞、死皮发生和修复机理等领域均取得了重要进展。本文从天然橡胶生物合成和胶乳再生、乳管伤口堵塞、排胶影响因素和排胶生理与分子机理4个方面总结了排胶领域的研究现状,并结合新技术持续引入排胶研究领域的最新进展,展望了橡胶树排胶机理研究发展趋势和应用,为橡胶树排胶机制研究提供理论依据,也为新型高效安全刺激技术研发提供指导。
1 天然橡胶生物合成和胶乳再生
天然橡胶主要由顺式-1,4-聚异戊二烯组成。天然橡胶的生物合成主要包括异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP）的合成、聚异戊二烯基焦磷酸链的延伸、橡胶分子的合成3个过程[16]。植物通过细胞质的甲羟戊酸途径（MVA）及质体中的甲基赤藓糖醇途径（MEP）合成IPP。DMAPP（dimethylallyl diphosphate）是IPP由异戊烯基焦磷酸异构酶（IPPI）催化形成的,二者可相互转化。DMAPP和IPP通过转酰基转移酶（TPTs）催化形成异戊二烯类化合物牻牛儿焦磷酸（geranyl diphosphate,GPP）、法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate,FPP）、牻牛儿基牻牛儿焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP）。这些异戊二烯焦磷酸短链可激活IPP的聚合[17]。在橡胶转移酶（HRT/cPT酶）、橡胶延伸因子（REF）、小橡胶粒子蛋白（SRPP）的共同作用下,IPP与异戊二烯类化合物结合在一起形成橡胶[18-19]。
2 乳管堵塞
排胶是橡胶树受到机械损伤刺激后的创伤反应过程。橡胶树皮的乳管细胞受到机械损伤后,因损伤处压力为零而乳管细胞内膨压很大（10~ 15 Mpa）,从而造成胶乳从乳管细胞胞质向损伤口方向溢出的初动力。排胶初期会发生黄色体破裂,释放大量正电荷离子和凝集物质来固化胶乳,同时随着胶乳流出乳管周围的薄壁细胞中的水分会渗入乳管细胞,使胶乳稀释再次加大排胶动力维持排胶过程[28]。留在乳管细胞内的线粒体、细胞核等细胞器重新合成新的胶乳,为二次割胶做准备。经过一段时间的胶乳流出后,损伤处会被凝固蛋白质网堵塞停止排胶,排胶停止24 h后在伤口堵塞处发现橡胶凝块[29]。排胶停止的主要原因是损伤口的堵塞,关于堵塞的假说目前有3种：酶假说、静电中和假说和凝集假说。其中“酶假说”认为黄色体中的酸性水解酶和氧化还原酶、F-W复合体中的酚氧化酶、黄色体中的过氧化物酶及D型磷脂酶的酶促反应机制参与橡胶粒子的凝集引起胶乳堵塞[30],但该假说的实验证据较贫乏;橡胶粒子表面带负电荷,是胶乳稳定的主要原因,“静电中和假说”认为黄色体破裂释放正电荷物质与橡胶粒子表面的负电荷凝集引起胶乳堵塞[31];目前比较倾向的假说是 “凝集假说”[32],该假说认为黄色体破裂释放一种凝集素——橡胶素,橡胶素使橡胶粒子结合在一起,但几丁质酶通过水解N-乙酰氨基葡萄糖破坏橡胶素与橡胶粒子的结合来抑制胶乳凝固。最近,我国学者在乳管堵塞物主要成分蛋白质网的研究中发现橡胶粒子、几丁质酶和Hev b蛋白在乳管伤口堵塞物形成中具有重要作用[33⇓-35],揭示了乳管伤口堵塞物形成的机制。
3 排胶影响因素
天然橡胶产量和品质与胶乳中的化学成分有很大关系,胶乳中化学成分受很多因素的影响,主要为品种、季节气候、刺激措施、死皮影响、逆境及病虫害等。
3.1 气候因素
3.2 品种因素
橡胶树不同品种、品系间排胶特性存在显著差异。在传统割胶无刺激条件下,‘热试99-2’‘热试99-5’‘热试99-6’‘热试99-8’‘热试99-9’和‘热试99-10’的胶乳产量较高,且生理状况良好;‘热试99-4’‘热试99-3’‘热试99-1’和‘热试99-7’的胶乳产量较低且生理状况较差,其中‘热试99-10’的排胶速度最快,达0.88 mL/min;‘热试99-4’的排胶速度最慢,只有0.26 mL/min;‘热试99-1’胶乳中的平均蔗糖含量最低,而‘热试99-4’胶乳中的蔗糖含量最高[38]。橡胶树品系‘GT1’较‘云研77-2’‘云研77-4’‘PR107’和‘RRIM600’的干胶产量是最高的[37]。王岳坤等[39]以‘PR107’‘热研73397’‘热研879’为研究对象,发现‘热研879’乳管蔗糖代谢活跃程度最高,乳胶产量最高,‘热研73397’次之,‘PR107’最小。
3.3 刺激因素
目前,我国使用的割胶技术有常规割胶和乙烯刺激割胶技术2种。乙烯刺激割胶技术包括常规刺激（乙烯利）和气刺微割。乙烯对橡胶树的高效增产作用是在1968年发现的,现已在天然橡胶的生产中得到了广泛应用[40]。乙烯引起橡胶树胶乳产量显著增加的一个重要原因是乙烯可延长排胶时间。许闻献等[41]研究指出在一定范围内,乙烯浓度越高,促排胶效果最好,但产生的惯性刺激也越大,严重时可致乳管完全丧失排胶能力,在生产上造成非常大的损失。庄海燕等[42]研究也发现乙烯利刺激产胶是因为延缓了乳管内的堵塞现象,大幅提高乳管内蔗糖的利用率,加速水分及养分的吸收,刺激橡胶乳管细胞内的生物合成,加速产胶和排胶。气刺微割是采胶时割线长度小于等于5 cm,并结合乙烯气体刺激的一种新型割胶技术。气刺微割最开始是1995年在马来西亚推广用于生产,较传统割胶技术更安全,操作要求低,可有效延长橡胶树的经济寿命[43]。气刺微割与常规乙烯利处理相比,虽然产胶量有所减少,但株次产量明显增加,干胶含量相当,树皮损耗较小,死皮发生率降低,割胶速度更快,可有效节约人工成本[44]。可针对不同树龄的橡胶树差异使用乙烯利刺激割胶方式,达到降低成本,提高产量和品质的目的。
3.4 橡胶树死皮及其恢复机制
死皮（tapping panel dryness, TPD）是橡胶树受到过度割胶刺激出现割面干涸的特有现象[45]。死皮发生是橡胶树对过度排胶刺激的一种自我保护措施。死皮是橡胶生产中影响经济效益的重要因素之一,对于死皮的发生原因,科研人员提出了不同的假说。首先,病理学假说认为死皮是因为橡胶树皮被病原物入侵导致,但通过组织细胞学技术并没有在死皮部位鉴定到任何致病菌,因此,确认死皮发生不是由病原菌引起[46-47]。第二,局部严重创伤假说认为橡胶树死皮是过度割胶引起的生理紊乱反应,造成黄色体破裂而引发的乳管细胞程序性死亡,从而引起死皮病[48]。SIVAKUMARAN等[49]已证明死皮树中形成大量胼胝体、无机磷、辅氨酸及Mg2+大量减少,引起树体营养失衡,但这种营养失衡不确定是死皮发生的原因还是结果[50]。第三,水分失衡假说认为反复割胶带走大量的胶乳,引起树体内水分失衡、胶乳不正常的反复稀释促进死皮病的发生,极度的水分缺失会导致树体韧皮部的氰化物中毒,这是导致树皮死的根本原因[51]。第四,自由基假说认为细胞器、黄色体和橡胶粒子中含有导致胶乳凝结的因子,导致NADPH酶活增加,活性氧含量上升,引起死皮[52-53]。第五,乙烯利衰老假说认为乙烯利刺激过度割胶会引起细胞内系统代谢和物质循环加快,加速养分流失,促进树皮衰老,导致死皮发生[54]。第六,激素失调假说认为过度割胶引起激素失衡,进而影响橡胶树的正常生长发育,这可能是导致橡胶死皮的重要因素[46]。也有研究表明,外施中国热带农业科学院橡胶研究所研制的橡胶树死皮康复营养剂,发现其能明显降低橡胶树死皮停割植株的死皮指数及促进割线症状的恢复,且能提高死皮植株产量[50,55]。一般情况下,割线长、割胶频率高、低产株及高强度刺激割胶会造成死皮率升高,因此,选择合理割胶制度可有效降低橡胶树的死皮率,从而提高排胶质量。
3.5 逆境
不利的环境因素也会引起橡胶树排胶减少,经济效益降低。热带北缘地区的海南、广东和云南是我国主要植胶区,周围环境温度在18~24℃之间是最适宜的割胶排胶温度[56⇓-58],每年发生的低温寒害均直接导致与排胶反应相关的渗透压、酶活性和代谢系统的变化,使橡胶减产,减少橡胶树的经济寿命[59-60]。史敏晶等[33]研究发现低温会导致排胶时间过度延长,直接影响了天然橡胶的高产稳产。反之,高温干旱时散热率和呼吸速率同时降低净光合产物的积累而导致排胶量减少[60]。曾宪海等[61]研究发现严重干旱会引起橡胶树嫩叶大面积死亡、变黄或凋零,造成排胶障碍而减产。广东和海南的植胶区还面临台风灾害的侵袭,风力胁迫会造成胶树堵塞指数增加、排胶受阻,造成产量下降,死皮率增加,与胶乳再生相关的代谢活性及相关因子水平均会降低,同时越高产的橡胶树越容易受到风害威胁[62⇓-64]。除了不利的环境因素外,病虫害也时刻威胁着橡胶树的排胶量。白粉病是威胁橡胶产量最严重的一种病害,主要危害橡胶树的嫩叶,病情严重时可影响叶片的光合作用导致减产,根据病情的不同程度会造成不同程度的经济损失[65⇓⇓⇓-69],炭疽病、割面条溃疡病、根系疾病等均会不同程度地造成橡胶树树势减弱、胶乳产量减少[68⇓⇓⇓⇓⇓-74]。橡胶小蠹虫、六点始叶螨、介壳虫、蟋蟀和蝼蛄等虫害也会影响橡胶树长势,并造成胶乳产量大幅度下降,严重时还会引起橡胶树死亡[73,75 -76]。
4 排胶的生理和分子生物学机制
橡胶树排胶过程受多种因素的协调调控。张晓飞等[77]用胶乳诊断的方法比较了6个国外引进品种的排胶特性,发现‘热试11-107’的蔗糖含量与干胶产量呈正相关,而‘热试11-9’的蔗糖含量与干胶产量呈负相关,表明排胶具有品种特异性。
4.1 生理基础
通过胶乳诊断（latex diagnosis）来测定胶乳中物理化学成分及生理指标,以预测橡胶树的排胶特性[78]。参与排胶相关的生理参数主要有总固形物含量（total solids content,TSC）、硫醇（R-SH）、黄体破裂指数（BI）和镁离子等。TSC可直接反应乳管细胞的胶乳再生能力,若干胶含量过高,说明细胞粘性大可引起排胶不畅,含量过低表示乳管细胞再生能力弱。吴明等[79]指出干胶含量大小顺序为‘PR107’>‘热研917’>‘RRIM600’,且受乙烯刺激干胶含量会有所下调。硫醇是胶乳细胞中重要的细胞膜保护剂,反映乳胶中细胞抗氧化能力和对细胞器保护的情况[80],也是乳胶稳定剂之一。割胶会引起细胞内硫醇含量降低[81],硫醇含量高时可清除细胞内的活性氧,延迟乳管堵塞,显著延长排胶时间,其含量与胶乳产量呈正相关;过低时造成非酶促保护系统减弱而引起死皮[82]。高产株系的硫醇含量均较高,‘热研879’和‘热研73397’的硫醇含量显著高于‘PR107’[83]。硫醇受乙烯刺激的诱导,但是品系不同,受刺激的反应也不同。无性系‘PR107’受乙烯利刺激后,细胞内硫醇含量会升高;‘热研879’在乙烯作用下细胞内硫醇含量会先升高再降低[84-85],因此,乳管细胞中的硫醇含量具有品系特异性。
4.2 分子机理
4.2.1 橡胶树基因组
目前,在橡胶树排胶过程中已经有很多基因组学、转录组学和蛋白组学等方面的研究。RAHMAN等[90]首次公布了橡胶树无性系‘RRIM600’的基因组,共预测基因数目68 955个。随着测序技术的成熟和新测序技术的发展,TANG等[91]在2016年发布了橡胶树无性系‘热研73397’的全基因组序列,预测基因数量为43 792个,同年,LAU等[11]利用三代测序技术更新了‘RRIM600’基因组数据,预测基因数量为84 440个。POOTAKHAM等[92]在2017年发布了橡胶树‘BPM24’的全基因组数据,预测基因数为43 868个,并且首次发现胶乳中高表达的基因存在大量的可变剪接现象。在‘RRIM600’基因组数据基础上,MAKITA等[93]在2018年整合大量转录组数据,对基因共表达网络和转录组起始位点进行在线分析。结合新兴的Hi-C（high- through chromosome conformation capture）技术,LIU等[94]在2020年发布橡胶树无性系‘GT1’基因组数据,预测基因44 187个,发现橡胶树经历了2次全基因组复制事件。橡胶树全基因组的公布对后续基因功能的研究发挥着重要作用。
4.2.2 天然橡胶生物合成相关蛋白
目前,发现参与橡胶生物合成的蛋白主要有橡胶延伸因子REF[95]、小橡胶蛋白SRPP[96]、橡胶转移酶HRT[97]、HMGR[98]、HMGS[99]、FDP合酶[100]。酵母双杂交实验已证明REF不仅可与高同源性蛋白互作,也可与TCTP和激发子蛋白等互作[101],使用特异抗体与REF结合或去除REF后,天然橡胶生物合成途径中的异戊烯链会终止延长[102]。SRPP和REF的氨基酸序列同源性高达72%,代龙军等[103]分离出一个新的SRPP亚家族成员的完整氨基酸序列,推测SRPP可能参与逆境反应,并对橡胶生物合成有促进作用。在橡胶树中分离出2个HRT基因和3个HMRG基因,其中HRTs基因同源性为87%,在胶乳中特异性表达,参与胶乳合成、催化IPP多聚化[104];而HMGR1的表达受乙烯利的诱导,且在乳管中的表达量明显高于叶片,HMGR2和HMGR3的表达无组织特异性,而且HMGR3缺少TATA-box启动子,推测HMGR1可能参与橡胶的生物合成[105],HMGR3可能与有持家特性的类异戊二烯生物合成有关。HMGS的酶活力主要存在于乳管中,在胶乳合成早期为胶乳合成提供原料,且高产橡胶树中HMGS的表达水平高于低产橡胶树水平,受乙烯的直接诱导[99]。FDP在橡胶树表皮和胶乳中均有表达,而且割胶会引起FDP表达量的升高,说明FDP在橡胶生物合成和一些异类异戊二烯合成中起双重作用[100]。
4.2.3 排胶相关蛋白研究
橡胶树中许多与排胶相关的基因家族均已经得到鉴定。如钾转运蛋白（KUP）基因家族在橡胶树中有31个成员,其中经过乙烯利刺激后,HbKUP30和HbKUP31在胶乳中的表达量明显上调[106]。已知乙烯在产排胶过程中起重要作用,ACS是乙烯生物合成的关键限速酶,橡胶树中共有7个ACS成员,主要在根、叶、花和树皮中表达,胶乳中的表达量相对较低,但经乙烯利处理后,这些基因的表达量均会显著上升[107]。经乙烯处理后,原生质膜上的ATP酶活性显著升高,激活的ATP酶为蔗糖运输提供能量[108-109]。在胶乳中表达的2个蔗糖转运蛋白HbSUT1A和HbSUT2A均受乙烯诱导,说明这2个蔗糖转运蛋白均参与了乳管的蔗糖供给及乙烯刺激增强乳管代谢的能力[26],其中HbSUT5基因在胶乳、树皮和叶片中均有高表达,并且参与乳管蔗糖供给的调控[110]。紫色酸性磷酸酶（PAP）与乙烯刺激增产相关联,已从橡胶树中克隆出9个PAP基因,HbPAP3在胶乳中表达量较高,而且在乙烯刺激下,HbPAP3、HbPAP23和HbPAP26伴随刺激强度的增强在胶乳中基因表达增强3倍以上[111]。快速碱化因子（RALF）是一种植物多肽类激素,在橡胶树中鉴定到16个RALF基因,其中有8个在胶乳中高表达的HbRALFs参与乙烯刺激响应[112]。茉莉酸信号途径在橡胶生物合成和乳管发育过程中起重要调节作用,HbJAZ5和HbJAZ10参与次生乳管分化,HbJAZ8参与橡胶生物合成[113]。COP9信号小体（CSN）在茉莉酸信号途径中起重要作用,吴绍华等[114]采用RACE技术在胶乳中克隆了8个CNS基因,其中HbCSN5在胶乳中表达量最高,部分基因受到茉莉酸甲酯处理后,上调表达可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。茉莉酸信号途径中的MYC转录因子HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4可与含有G-box顺式元件的产排胶相关基因互作来调控靶基因,HbPIP2;1是其调控的靶基因之一[115]。高产橡胶树种质中HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3基因的表达量是低产种质的2倍以上,其中HbMYC3基因的表达差异最大,有望成为橡胶树产量育种的一个分子标记[116]。
4.2.4 水分运输相关蛋白
4.2.5 乳管堵塞相关蛋白
在乳管堵塞处的“蛋白质网”的形成主要与由肌动蛋白微丝骨架有关。邓治等[121-122]以‘热研7-33-97’胶乳为模板克隆出HbADF6基因,结果发现随着排胶时间的延长HbADF6基因的表达量逐渐下调,而经过乙烯诱导后,HbADF6基因表达量均有上调,只有在排胶即将结束时HbADF6基因的表达量才会下调,说明ADF可解聚在堵塞口处形成的肌动蛋白微丝骨架,延长排胶时间。“蛋白质网”的主要成分是β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶及橡胶素[34]。王冬冬等[35]在橡胶树‘PR107’中克隆了这3个基因序列,结果发现这3个基因受乙烯影响均会显著下调,并且通过免疫印迹分析可得知HGN1、Hevamine A和HEV1受乙烯调控的蛋白含量变化与基因变化规律一致。乙烯通过抑制这3种成分的表达来抑制“蛋白质网”的形成,很大程度上延长了排胶时间和增加胶乳产量。
几丁质酶（EC 3.2.1.14）/溶酶菌（hevamine A）是阻止胶乳凝固的一个重要因子,几丁质的单体是橡胶粒子表面蛋白22 kDa的糖基GlcNAC,而几丁质酶可解除GlcNAC糖基,致使橡胶蛋白不能与橡胶粒子结合,抑制胶乳凝固,延长排胶时间。乙烯利刺激可使几丁质酶基因超表达[32],并且在刺激36 h时达到高峰[123],当停止乙烯刺激时,几丁质酶的活性就不再增加[124]。BOKMA等[125]在2001年获得了Hevamine cDNA序列。黄瑾等[126]以此为基础克隆得到了几丁质酶基因序列的全长,发现不同品系胶乳中的几丁质酶基因均受乙烯诱导,刺激前后基因表达存在明显差异,乙烯浓度越大,差异越显著。但是GIDROL等[32]通过实验证明堵塞指数不同的橡胶树品种‘WAR4’和‘GT1’经过乙烯刺激后,‘WAR4’橡胶树中的几丁质酶基因大量表达,胶乳产量增加了3~5倍,而‘GT1’橡胶树刺激前的几丁质酶基因表达较高,对乙烯刺激反应弱,经乙烯刺激后胶乳产量只增加了1.3~1.5倍,说明不同品系的橡胶树中的几丁质酶对排胶影响存在特异性。
橡胶素（hevein）即橡胶蛋白,分子量约为5 kDa,是植物凝集素家族的一种[126],是橡胶树黄色体可溶性蛋白的主要成分[127],可将橡胶粒子凝集在一起,使胶乳凝结和堵塞乳管的作用,这种凝集机制需要糖基GlcNAC的支持[123]。组织特异性表达发现所有HbHEV基因在胶乳中的表达量最高[128⇓-130],割胶、ABA、乙烯利均会诱导HbHEV基因的表达[129,131]。朱家红等[132]克隆到了橡胶素家族的一个新基因HbHEV3基因,组织表达表明,该基因积极参与橡胶树对乙烯的响应,并在乙烯诱导12 h时表达量最高,表示乙烯利延长排胶时间的同时凝集效果也更显著。但是目前二者之间的分子调控机制还需进一步研究。
5 展望
随着科学技术与研究方法的不断发展和引入到橡胶树排胶研究领域,橡胶树排胶机制方面的研究已经取得了重大进步,对推动橡胶经济产业的发展起到关键性作用。如今,天然橡胶产业从产量提升向品质提升转变,阐明排胶调控机制并据此研发安全、长效、低成本的排胶调控技术成为了橡胶经济产业研究的新热点。
5.1 内源激素检测技术
5.2 排胶相关调控基因筛选和功能鉴定
5.3 高效排胶技术和调节剂的研发
在研发橡胶树乙烯刺激剂、死皮康复剂和割面保护剂的基础上依据橡胶树排胶理论,结合排胶影响因素,研发新型乳管伤口愈合和保护剂、死皮康复喷剂等树排胶调节剂。目前,自动割胶机研发进展迅速,人工成本降低,可结合气刺微割技术和针刺采胶技术形成新的割胶技术体系。
5.4 排胶相关分子标记的开发
由于排胶调控机理与植物生理生化、酶活性代谢和基因表达等密切相关,开发排胶相关分子标记有利于筛选排胶特性差异种质和指导排胶新技术的研发。结合前期研究进展,可从总固形物含量、ATP酶和蔗糖转移酶等筛选排胶相关的生理生化标记;从乙烯、茉莉酸等植物激素信号途径中关键因子ERF、MYB、WRKY等基因中筛选分子标记。此外,排胶相关关键蛋白,如HEV、ADF、RPB1、ACTIN等基因组序列和启动子序列也可用于标记筛选。这些标记可用于种质资源鉴定,也可用于新型调节剂研发过程中的评价指标。
综上所述,橡胶树排胶与天然橡胶生物合成、生理生化、割胶技术和环境因素密切相关,在橡胶树生理与分子生物学领域不断引入新技术和新方法,将为创建排胶调控理论和新型刺激技术研发及天然橡胶产业升级提供理论基础和技术指导。