工业的飞速发展极大地改善人民的生活水平,同时也导致严重的环境污染。根据2014年《全国土壤污染状况调查公报》（中华人民共和国环境保护部,2014）,我国重金属污染现状不容乐观,特别是重金属镉点位超标率高达7%,居于无机污染物首位。相比于其他重金属,镉毒性大,移动性强,若通过污染水源或经食物链富集后进入人体,可对人体造成极大伤害。根据报道,许多食品如食用菌,在栽培过程中能够大量富集重金属元素而无法有效降解,进而作为食物链的一环进入人体内[1]。研究表明,急性吸入镉会造成呼吸道和肺损伤,慢性摄入以肾小管为靶器官并导致肾近端肾小管功能障碍、嗜酸性粒细胞增多和贫血等[2]。因此,重金属污染已经成为亟待解决的生态问题。
目前,已有研究表明常用的方法例如化学沉淀法、膜过滤法和离子交换法等均可以达到去除重金属的目的[3]。但这些传统的物理化学方法存在许多缺点如成本过高、操作复杂、容易产生二次污染等。相比而言,生物修复包括动植物修复、微生物修复等方法更加清洁绿色,如有研究通过筛选海雀稗得到耐镉性强的海雀稗种质资源,从而进一步夯实镉污染区域植物修复技术[4]。然而,植物修复技术也存在修复时间长、效果较慢的缺点[5]。在这种情况下,微生物修复逐渐成为重金属污染修复领域的热门研究。而在实际处理中,微生物吸附法也表现出成本低,操作简单及不产生二次污染等优点[6]。其中,由于细菌来源丰富,生长繁殖迅速,适应性强等特点,已越来越广泛地应用于重金属污染修复中。例如,高耐镉贪铜菌属细菌的最大耐受浓度可以达到2248.2 mg/L[7],普罗威登斯菌属（Providencia sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）耐受浓度可达650 mg/L,并能显著降低土壤中的有效Cd2+含量的上标[8]。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株Burkholderia sp. DF3-1从海南省东方市不磨村经济场（180°44′15″E, 18°53′26″N）废弃金矿矿区土壤中分离,通过16S rRNA鉴定其为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）并保藏于中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验室。使用Luria-Bertani（LB）培养基（胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,琼脂粉15~20 g,水1000 mL,pH 7.2,液体不加琼脂）对该菌进行培养。
1.2 方法
1.2.1 不同Cd2+浓度下菌株Burkholderia sp. DF3-1的生长曲线 将纯种菌株从平板上接种到液体培养基中,在28℃、180 r/min的条件下培养24 h作为种子液。将培养好的种子液以2%的比例接入含有不同镉浓度的LB液体培养基,Cd2+浓度设置为：0、10、50、100 mg/L。将接种好的菌液放入摇床在28℃、180 r/min的条件下培养,每隔一段时间取样,以未接菌的空白培养基为对照,分光光度计波长600 nm处测定OD值。每个处理设置3个重复。
1.2.2 不同Cd2+浓度对菌株Burkholderia sp. DF3-1吸附能力的影响 为研究不同初始Cd2+浓度下菌株DF3-1的吸附能力,将种子液（培养步骤参照1.2.1）按照2%的比例接入不同镉浓度的LB液体培养基,Cd2+浓度设置为：0、5、10、50、100、200 mg/L。28℃、180 r/min的条件下培养48 h后,取菌液放入无菌离心管8000 r/min低温离心10 min,取上清液用原子吸收光谱仪（AAS）测定其中的Cd2+浓度,每个处理设置3个重复。镉去除率计算公式为：
$R=\frac{C_{0}-C_{e}}{ C_{0}} \times 100 \%$
其中,R为去除率（removal radio）;C0（mg/L）为初始Cd2+浓度;Ce（mg/L）为上清液中Cd2+浓度。
1.2.3 不同培养时间对菌株Burkholderia sp. DF3-1吸附能力的影响 配制初始Cd2+浓度为50 mg/L的LB液体培养基,进行接种后（2%）将菌株放入控温摇床28℃、180 r/min培养,以不接菌的空白培养基为对照,每隔特定时间（3、6、9、12、16、20、24、30 h）取样,于8000 r/min低温离心10 min,用AAS测定上清液中剩余Cd2+浓度,吸附率计算同上。每个处理设置3个重复。
1.2.4 不同pH对菌株Burkholderia sp. DF3-1吸附能力的影响 配制初始Cd2+浓度为50 mg/L、pH分别为4、5、6、7、8、9的LB液体培养基,对照同上,接种后,将菌株放入控温摇床28℃、180 r/min培养48 h后,于8000 r/min低温离心10 min,用AAS测定上清液中剩余Cd2+浓度,吸附率计算同上。每个处理设置3个重复。
1.2.5 电子显微镜检测 （1）扫描电子显微镜。配制Cd2+浓度为10、100 mg/L的LB液体培养基,以不添加Cd2+的LB培养基为对照,将上述培养基接种后,控温摇床28℃、180 r/min培养24 h。取2 mL菌液8000 r/min低温离心10 min,弃上清,菌体用无菌去离子水清洗3次后加入2.5%戊二醛溶液固定,4℃静置过夜。用PBS磷酸缓冲液清洗3次,每次10 min,然后乙醇梯度脱水（30%、50%、70%、80%、95%）,每次15 min,接着无水乙醇脱水2次,每次20 min。之后使用无水乙醇:乙酸异戊酯（V/V=1:1）处理30 min,纯乙酸异戊酯置换2 h后固定在玻片上,喷金后使用Zeiss扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）观察并拍照。
（2）透射电子显微镜。准备Cd2+浓度为0、50 mg/L的LB液体培养基,接种后,控温摇床28℃、180 r/min培养48 h。取2 mL菌液8000 r/min低温离心10 min,弃上清,菌体用无菌去离子水清洗3次后加入2.5%戊二醛溶液固定,4℃静置过夜。PBS清洗3次,每次10 min,然后倾去PBS,加入锇酸PBS固定液静置2 h固定,回收锇酸,PBS漂洗3次,每次5 min。然后乙醇梯度脱水（30%、50%、70%、80%、95%）,每次15 min,无水乙醇脱水2次,每次20 min。弃乙醇加入丙酮置换3次,每次5 min,随后用丙酮:包埋剂（V/V=1:1）摇床渗透1 h,丙酮和包埋剂（1:2）摇床上渗透1 h,丙酮和包埋剂（1:4）摇床上渗透2 h,纯包埋剂摇床渗透2 h后,再加入纯包埋剂渗透过夜。将包埋板中加入一半包埋剂60℃聚合过夜,再加入包埋剂和样品60℃聚合48 h。包埋好的样品用超薄切片机切片,厚度为80 μm,铜网捞片并干燥,用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后漂洗,充分干燥后使用日立透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察。
1.2.6 傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy, FTIR） 准备Cd2+浓度为0、50 mg/L的LB液体培养基,接种后（2%）控温摇床28℃、180 r/min培养48 h。取50 mL菌液8000 r/min低温离心15 min,弃上清,菌体用无菌去离子水清洗3次并冷冻干燥。将干燥的样品粉末与溴化钾（KBr）粉末按照1:99（w/w）的比例放入玛瑙研钵充分研磨、混合,整个过程需在红外灯下进行。将研磨好的样品压成直径为10 mm的圆片,压力约为8 t,制好片后就可上机进行检测,分辨率为4 cm-1,扫描范围为500~3500 cm-1。
1.2.7 质粒的提取与消除 使用质粒提取试剂盒分离Burkholderia sp. DF3-1的质粒。将提取的质粒样品取2 μL与5 μL的缓冲液混合均匀后加入制好的1%凝胶加样孔内,同时加入Marker进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统上观察电泳带及其位置,并与Marker比较条带大小。根据呼庆等[15]和李钧敏等[16]的质粒消除方法作部分改进,将Burkholderia sp. DF3-1菌液按照2%的比例分别接种至NA液体培养基、含0.3%SDS的NA液体培养基和含40 mmol/L苯甲酸钠的NA培养基中,28℃、180 r/min培养48 h。将菌液原液、稀释10-1菌液、稀释10-2菌液取100 μL分别涂布于NA培养基平板、含10 mg/L Cd2+的NA培养基平板和含100 mg/L Cd2+的NA培养基平板上,倒置培养2~3 d后观察生长情况,每个处理3个重复。
2 结果与分析
2.1 不同Cd2+初始浓度下Burkholderia sp. DF3-1的生长曲线
图1为初始浓度为0、10、50、100 mg/L时,菌株DF3-1的生长曲线。从0~100 h,添加10 mg/L的Cd2+对DF3-1的生长几乎无影响,达到最大生物量时的OD600值与不添加Cd2+相比无显著差异。在添加Cd2+的浓度为50 mg/L和100 mg/L时,菌株DF3-1生长受到抑制,对数期的生长速率明显降低,最大生物量也显著低于不添加Cd2+时的生物量。另外,10 mg/L和50 mg/L时菌株DF3-1达到稳定期的时间与不添加Cd2+相比差别不大,100 mg/L时达到稳定期的时间有所延后。
2.2 不同Cd2+初始浓度下Burkholderia sp. DF3-1的去除效率
图2为初始浓度为0、10、50、100、200 mg/L时,菌株DF3-1对溶液中镉离子的去除效率。随着初始浓度的升高,菌株对镉离子的去除效率表现为不断下降的趋势。5 mg/L时去除效率最高,为83.64%;200 mg/L时对镉离子仍具有一定的去除能力,去除效率为21.66%。
2.3 不同培养时间下菌株Burkholderia sp. DF3-1的去除效率
由图3可知,在初始浓度为50 mg/L、3~32 h的培养时间下,菌株DF3-1对镉离子的去除是一个逐渐上升的过程。随着细菌的生长,生物量的不断增多,去除效率也逐渐增大,在24 h左右时达到最大值33.30%,随后基本保持稳定。这个结果也基本符合生长曲线试验的结果。
2.4 不同pH下Burkholderia sp. DF3-1的去除效率
图4为初始浓度为50 mg/L、初始pH在4~9时,菌株DF3-1对溶液中镉离子的去除效率。在初始pH为4时,菌株对镉离子的去除效率非常低,只有5.37%;在这之后,去除效率开始升高,在pH>7后去除效率开始下降。其中,在pH为5时去除效率最高,为28.36%。
2.5 电子显微镜检测
2.6 傅里叶变换红外光谱
细胞壁表面的官能团在细胞吸附重金属的过程中起着至关重要的作用。通过分析菌株DF3-1吸附Cd2+前后细胞表面的红外光谱图,能够得到菌株DF3-1对镉吸附的特异性以及特性与其表面官能团有关。如图7所示,菌株DF3-1在吸附前后的红外谱图峰型几乎一致,但是发生了特征吸收峰的位移。通过解谱,位于2928 cm-1的吸收峰位移至2927 cm-1代表非对称伸缩振动的-CH2-基团;1653 cm-1位移至1652 cm-1代表蛋白质和多肽的酰胺I基团;位于1541 cm-1处的吸收峰可归于非对称伸缩振动的-NO2基团;1396 cm-1位移至1398 cm-1处代表羧基基团（-COOH）;1236 cm-1和1238 cm-1处的吸收峰代表着主要是C-O键振动的-C-OH基团;吸收峰1070 cm-1位移至1072 cm-1代表-CO-基团。
2.7 质粒的提取与消除
3 讨论
细菌的生长过程可以分为调整期、对数期、稳定期和衰退期4个阶段。生长曲线的结果表明,菌株DF3-1是一株具有高耐镉能力的细菌,10 mg/L及以下的镉离子对菌株的生长几乎无影响,而在100 mg/L的Cd2+浓度下,菌株依然可以达到对照80%左右的生长量。其次,初始重金属离子浓度是与细菌的去除能力密切相关的影响因素,根据不同初始Cd2+浓度下Burkholderia sp. DF3-1的去除效率结果,在低浓度时,溶液中的金属离子能够充分接触到细菌菌体表面的结合位点,位点利用率较高因此去除效率较高,随着溶液中金属离子增多而位点保持不变或者有所减少的情况下,去除效率不断降低。同时,较高浓度的镉对微生物具有一定的毒害作用,作为生物非必需元素,镉在进入细菌细胞内部后会影响生物正常生长所需要的酶的活性,阻碍生物的生长,影响其去除效率。结合Burkholderia sp. DF3-1的生长曲线和不同培养时间下的去除效率试验,表明菌株DF3-1对Cd2+的吸附与其生物量有关,更多的生物量可以提供更多的结合位点,从而提高去除率。
由扫描电镜和透射电镜结果可知,高浓度的Cd2+会对细胞造成一定毒害作用,而且会与细菌细胞表面的官能团发生一些聚合反应,或与细胞分泌物质与金属离子结合形成沉淀附着于细胞表面[19,20],同时,细胞通过吸附和内流来降低环境中的Cd2+浓度以提高抗性,迅速适应环境。这一结果也与SHABNAM等[21]报道的研究结果一致。当外界的重金属离子浓度足够高的时候,微生物细胞会形成一种抗性机制,即以主动运输的方式内流吸收金属离子,进入细胞的金属离子会被转化成无毒的沉淀形式或限制在某一区域内隔离开。当毒性过高时可对细胞内部造成损害。而由于菌体表面的官能团能够通过化学吸附或静电吸附结合Cd2+,根据FTIR试验结果,菌株DF3-1的表面主要是-CH2-、酰胺I、-NO2、-COOH、-C-OH和-CO-基团参与了吸附过程。根据报道,不同的细菌参与吸附的官能团有所不同,例如,李丹丹[22]研究发现了-CH2、C=O、C-N、N-H、-COO和-SO3等官能团参与了吸附过程。这些结果表明,镉对菌株DF3-1具有一定的毒性,但细胞能够通过胞外吸附和胞内积累去除环境中的镉,从而提高对镉的抗性。
4 结论
综上所述,Burkholderia sp. DF3-1可耐受200 mg/L的Cd2+,10 mg/L以下的Cd2+对其生长几乎无影响;去除率在初始浓度为5 mg/L时最高为83.64%;在pH为5~7之间都可高效去除溶液中的镉。Burkholderia sp. DF3-1的表面主要是-CH2-、酰胺I、-NO2、-COOH、-C-OH和-CO-基团参与了吸附过程,初步推断菌株DF3-1耐镉基因位于染色体上。Burkholderia sp. DF3-1的主要吸附机制为胞外吸附和胞内积累相结合。