番木瓜（Carica papaya L.）俗名木瓜、乳瓜、万寿果,是番木瓜科,是著名的热带亚热带水果之一,原产于非洲和热带美洲,番木瓜与菠萝、香蕉并称为“热带三大草本果树”,素有“岭南佳果”的美誉[1,2]。番木瓜果实营养丰富,富含糖类、蛋白质、多种无机矿物质和维生素,尤其胡萝卜素和Vc的含量分别是菠萝的20倍和4倍,还有延缓衰老、增强人体免疫力等功能,因此具有较高的营养价值和经济价值[3]。但是,由于番木瓜属于呼吸跃变型果实,采后极容易变黄、软化最后导致腐烂,并且番木瓜的货架期短,因而番木瓜的贮藏和运输成为亟需解决的主要问题。这严重影响了番木瓜产业链的健康发展[4,5],因此,如何延长番木瓜的保鲜成为了我们研究的主要方向。
壳聚糖（chitosan, CTS）是天然甲壳素的脱乙酰基产物,也是自然界中唯一的天然碱性多糖[6]。因其具有来源丰富,并无毒无害、可降解、可食用、良好的成膜特性,抗氧化性、不溶于水、和广谱抗菌性等性征,且可溶于醋酸稀溶液,易在物体表面形成半透膜,近年来其在食品工业中的应用成为了研究的热点[7,8,9]。但单一的壳聚糖作为食品涂膜保鲜剂时存在一些问题,如膜的机械强度较弱,且对一些微生物的抑制效果不佳,因而影响保鲜品的品质[10]。为了进一步强化壳聚糖膜的抗菌能力及膜的整体性能,壳聚糖中经常加入精油。植物精油是天然的混合物,是从芳香植物中提取出来,具有挥发性,无毒无害,且具有良好的抗菌性,部分精油还有抗氧化性,被美国食品药品监督管理局认定为“公认安全类产品”[11,12]。
壳聚糖富含活性基团,能有效包埋植物精油、提高抗菌性、发挥精油的缓释作用,植物精油本身具有一定的刺激性,但通过壳聚糖包埋后,精油的刺激性气味就会被掩盖,从而降低精油的刺激性气味对食品风味产生的影响。另一方面,植物精油具有疏水性,可以增强植物精油和壳聚糖复合膜的防水性能,使保鲜效果更好。王建清等[13]研究发现,30 μL/mL的肉桂精油与1%的酸溶性壳聚糖涂膜能延长草莓的货架寿命48 h以上,达到了保鲜效果。王磊明等[14]研究发现,在低温4℃下,0.8%肉桂精油+1.2%的壳聚糖处理蓝莓效果最好,保鲜指标的平均贡献率为0.205。高文华等[15]研究发现壳聚糖肉桂精油涂膜圣女果,其保鲜期延长了14 d。杨震宇等[16]研究发现,在低温4℃下,1.5%壳聚糖+0.4%肉桂精油复合保鲜液处理对鲜切雪莲果具有保鲜效果,贮藏6 d时,依旧新鲜。薛琼等[17]研究发现,以壳聚糖肉桂精油复合3:1比例制备微胶囊处理对葡萄具有较好的保鲜效果。然而肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜果实炭疽病的防治作用及其生理机制研究尚未见报道。因此本文以此为切入点,探究肉桂精油与可食性壳聚糖涂膜对番木瓜炭疽病的防治效果,同时对番木瓜果实的抗病生理特性展开研究,为我国番木瓜产业的健康发展提供理论依据和应用参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试番木瓜品种 本研究所用番木瓜品种为‘大青'番木瓜（Carica papaya L.）,于2021年4月采自广东省湛江市徐闻县金龟岭果园,采摘时挑选形状、大小、外观颜色相对一致,成熟度为七八成熟,无机械损伤无病虫害的果实,每个果实留取1 cm左右果柄,采后立即运回中国热带农业科学院南亚热带作物研究所实验室备用。
1.1.2 化学试剂 壳聚糖（低粘度：<200 mPa·s）,国药集团化学试剂有限公司;肉桂精油,陕西森朗生物化工有限公司;冰醋酸（分析纯）,天津市江天化工技术有限公司;纤维素纳米纤维,开翊新材料科技（上海）有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）,广东环凯微生物科技有限公司。
1.1.3 供试菌株 番木瓜胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）,由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所采后保鲜实验室分离保存。
1.2 方法
1.2.1 肉桂精油壳聚糖复合乳液的制备 用体积分数为0.5%冰醋酸溶液溶解壳聚糖,将壳聚糖加入冰醋酸溶液后,在1000 r/min磁力搅拌器上搅拌1 h使壳聚糖在常温状态下完全溶解,壳聚糖溶液的终浓度为0.5%,之后依次加入0.1%的纤维素纳米纤维和肉桂精油,用锡箔纸包裹,在不透光条件下用磁力搅拌器搅拌1 h,再用10 000 r/min剪切分散乳化机搅拌2 min直至液体互溶乳化,静置,待泡沫消失后备用。
1.2.2 番木瓜果实炭疽病病情指数的测定 将采回的番木瓜果实用0.25 g/L咪鲜胺浸泡果柄5 min,晾干后分别用处理组试剂进行喷雾处理番木瓜果面,4个处理组分别为：0.5%壳聚糖、0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油、0.5%壳聚糖+0.5%肉桂精油、0.5%壳聚糖+0.7%肉桂精油,清水处理作为对照,晾干后装入聚乙烯（PE）保鲜袋于常温25℃条件下贮藏,每隔3 d调查果实病情,计算病情指数及防治效果,每处理21个果实,3次重复。果实病斑面积分级及病情指数的计算参照陈文[18]的方法。
病情指数=Σ[(病害果数×病害级值)/总果数×最高病害级值]×100
防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%
1.2.3 番木瓜果实炭疽病病斑直径的测定 前处理方法同1.2.2,将在常温25℃下贮藏24 h后的番木瓜果实取出,用针刺接种法接种,在每个番木瓜果面靠近两端刺出2个接种点,接种直径为5 mm的炭疽菌菌块,用含无菌水的棉块保湿,之后将果实装入PE保鲜袋,25℃下培养24 h后取下菌快,每隔3 d用十字交叉法测定一次病斑直径,每处理23个果实,3次重复。
1.2.4 肉桂精油复合壳聚糖处理对番木瓜炭疽菌菌丝生长和产孢影响 制作PDA平板培养基,其中处理组PDA平板中分别含有0.0125%肉桂精油、0.025%肉桂精油、0.3%肉桂精油、0.3%肉桂精油+0.5%壳聚糖、0.5%壳聚糖,空白PDA平板作为对照。取提前培养好的番木瓜炭疽菌平板,在其边缘打取直径为5 mm的菌苔接种到已制作好的PDA平板中央,在28℃下恒温培养,用十字交叉法每天测量炭疽菌的菌落直径,并在培养5 d后用血球计数板计量每个培养皿的产孢量,产孢量的单位为个/皿,3次重复。
1.2.5 番木瓜果实抗病相关物质含量和抗病相关酶活性的测定 处理方法同1.2.3,处理组为0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油,清水处理为对照,分别在采后0、3、6、9、12、15 d时取样,取样部位为果实病健交界处的果皮组织,每处理23个果实,重复3次。木质素含量、总酚（TP）含量、过氧化氢（H2O2）含量及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、几丁质酶（CHI）、β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）的活性均采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒进行测定。
1.3 数据处理
实验数据使用Excel 2010软件进行统计,计算平均值和标准误并制图。采用SPSS 22.0软件,利用ANOVA进行差异显著性分析,P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜炭疽病的防治效果
由图1可以看出,番木瓜贮藏12 d时,对照及其他处理均发病,但0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理仍没有发病;15 d时,对照及各处理都发病,且从整体上看,各处理的病情指数都显著低于对照,贮藏15 d时,壳聚糖处理、0.5%壳聚糖+ 0.3%肉桂精油处理、0.5%壳聚糖+0.5%肉桂精油处理、0.5%壳聚糖+0.7%肉桂精油处理的防治效果分别为45.8%、92.5%、63.3%、61.3%,其中0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的防治效果最佳。
图1 肉桂精油复合壳聚糖涂膜处理对番木瓜炭疽病病情指数的影响不同小写字母表示同一贮藏时期不同处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 1 Effect of cinnamon essential oil and chitosan coating treatment on disease index of papaya anthracnose Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments in the same storage period (P<0.05). |
2.2 肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜炭疽病病斑直径的影响
从图2可以看出,处理组的炭疽病病斑直径整体显著低于对照,其中0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理效果最佳,在贮藏9、12、15 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的病斑直径分别为4.1、9.0、14.0 mm,抑制率分别82.0%、73.6%、72.8%。
图2 肉桂精油复合壳聚糖涂膜处理对番木瓜炭疽病病斑直径的影响不同小写字母表示同一贮藏时期不同处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 2 Effect of cinnamon essential oil and chitosan coating treatment on lesion diameter of papaya anthracnose Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments in the same storage period (P<0.05). |
2.3 肉桂精油复合壳聚糖处理对番木瓜炭疽菌菌丝生长和产孢影响
由表1可知,番木瓜炭疽菌在不同处理的平板上恒温培养5 d后,0.025%肉桂精油、0.3%肉桂精油、0.3%肉桂精油+0.5%壳聚糖处理的菌落直径和产孢量均为0,而0.5%壳聚糖单独处理的菌落直径为71.3 mm,产孢量为0.7×106个/皿,0.0125%肉桂精油处理的菌落直径为60.6 mm,产孢量为0.6×106个/皿。说明0.5%壳聚糖对离体炭疽菌也有一定抑制作用,但0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理能够完全抑制炭疽菌的生长和产孢,其中起主要抑菌作用的是肉桂精油,肉桂精油浓度≥0.025%即可完全抑制炭疽菌的菌丝生长和产孢。
表1 肉桂精油复合壳聚糖处理对番木瓜炭疽菌菌丝生长和产孢影响Tab. 1 Effects of cinnamon essential oil composite chitosan tretments on mycelial growth and sporulation of C. gloeosporioides |
| 处理 Treatment | 菌落直径 Colony diameter/mm | 产孢量 Spore yield (spore numbers/dish) |
|---|---|---|
| CK（对照） | 82.3a | 1.4×106a |
| 0.5%壳聚糖 | 71.3b | 0.7×106b |
| 0.0125%肉桂精油 | 60.6c | 0.6×106c |
| 0.025%肉桂精油 | 0 0 | 0 0 |
| 0.3%肉桂精油 | 0 0 | 0 0 |
| 0.3%肉桂精油+0.5%壳聚糖 | 0 0 | 0 0 |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.4 肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜抗病相关物质含量的影响
由图3A可以看出,从整体上看,H2O2含量呈现先上升后下降再上升的趋势,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的H2O2含量整体比对照的高,贮藏3 d时,处理与对照间无显著性差异,到9 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理和对照具有显著性差异,且都达到最大值,H2O2含量别为13.3 μmol/g和9.0 μmol/g。图3B可以看出,在整个贮藏过程中,木质素含量呈现先上升后下降的趋势,在0、3、6 d时0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理和对照无显著性差异,在贮藏9、12、15 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理明显高于对照处理,且在6 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理迅速上升,到9 d时达到最大值94.7mg/g。图3C表明,在整个贮藏过程中,总酚含量呈现先上升后下降的趋势,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的总酚含量整体比对照的高,且在6 d之前,处理与对照无显著性差异,但在9、12、15 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理明显高于对照,且在9 d时,处理与对照都达到最高值,总酚含量分别是16.8 mg/g和13.5 mg/g。
2.5 肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜抗病性相关酶活性的影响
从图4A可以看出,在贮藏过程中,PAL酶活性整体呈现先上升后再下降的趋势,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的PAL酶活性在整个过程中都高于对照。在贮藏3 d后,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理和对照都呈现较快的上升趋势,直到9 d时达到高峰,PAL酶活性分别为19 U/g和15 U/g。图4B可以看出,在整个贮藏过程中,PPO酶活性呈现先下降后上升再下降的趋势,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的POD酶活性整体高于对照,且在3 d时,酶活性快速上升,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的POD酶活性在9 d时达到最高值,比对照高79.2 U/g。图4C可以看出,PPO酶活性整体呈现先上升后下降再上升趋势,对照整体高于0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理,15 d时,达到最大值,对照和处理的PPO酶活性分别为128 U/g和98 U/g。图4D可以看出,CHI酶活性整体呈现先上升后下降然后又上升的趋势,在3 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理高于对照,但在6 d之后,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理与对照基本上无显著差异。图4E可以看出,在贮藏过程中,β-1,3-GA酶活性整体呈现先上升后下降趋势,在贮藏3、6、9、12、15 d时,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的β-1,3-GA酶活性整体比对照高,且9 d时均达到最高值,β-1,3-GA酶活性分别为65.5 U/g和50.7 U/g。
3 讨论
不同浓度肉桂精油复合壳聚糖涂膜处理对番木瓜炭疽病有一定的抑制效果,由研究结果可以看出,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理后的效果最佳,在贮藏9、12、15 d时的抑制率分别是82.0%、73.6%、72.8%。其中贮藏9 d时的抑制作用最为显著,之后呈现缓慢下降的趋势,原因可能是贮藏前期,肉桂精油复合壳聚糖涂膜处理提高了番木瓜果实本身的抗性,增强了对炭疽菌的抑制作用,而后期一方面由于番木瓜自身后熟衰老加速,另一方面肉桂精油会挥发散失,最终导致复合处理的诱导抗病性减弱,抑制效果呈下降趋势。
肉桂精油含有肉桂醛等主要成分,具有良好的抑菌效果,其抑菌机理主要是由于破坏细胞膜的完整性,阻碍菌体能量代谢过程,从而抑制孢子、菌丝正常生长发育[19]。如TZORTZAKIS等[20]研究发现肉桂精油对球孢炭疽菌、草芽孢杆菌、黑曲霉、灰葡萄球菌等表现出较强的抗菌作用,且降低了产孢量。肉桂精油对蓝莓链格孢霉[21]、柑橘酸腐病菌[22]、苹果黑星病菌[23]等多种水果病原真菌均表现出较好的抑制效果。本文的离体抑菌结果显示,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理能够完全抑制离体番木瓜炭疽菌的生长和产孢,其中起主要抑菌作用的是肉桂精油,0.025%的肉桂精油即可完全抑制炭疽菌的生长和产孢,这与前人研究结果相似。而本文在果实上的防治效果实验显示,0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油的防治效果最好,贮藏15 d的防治效果为92.5%,复配液中精油的含量远远大于0.025%,对炭疽病的防治效果并未达到100%,其原因可能是离体实验是精油直接接触到病原菌而表现出较强的抑制作用,而在果实上,病原菌潜伏在木瓜果皮中,精油不能直接接触或者接触的不充分从而降低了抑制效果。
果实采后诱导抗病性与PAL、POD、PPO、CHI和β-1,3-GA酶等抗病性相关酶活性以及H2O2、木质素和总酚等抗病相关物质密切相关。PAL在植物抗病过程中起关键作用,是植物苯丙烷代谢途径的关键酶,能够促进木质素和酚类物质等抗病物质的合成,与果实性状及抗性关系密切;POD参与木质素以及其他酚类的合成;PPO可以氧化酚类物质,提高机体抗病能力;CHI的累积增强果实的抗病能力。肉桂精油和壳聚糖处理提高果蔬采后抗病性方面的研究已有很多报道,如蒋帅[24]研究发现肉桂精油结合壳聚糖处理提高了苹果抗病性与PAL、POD酶活性及总酚含量的增高有直接关系。梁清志等[25]研究发现肉桂提取物处理芒果,提高了果实中H2O2含量及β-1,3-GA酶活性,从而增强了芒果的抗病特性。刘锋等[26]研究发现,壳聚糖处理提高了脐橙的抗病性与PAL、CHI、β-1,3-GA酶活性的提高有直接关系。周会玲等[27]研究发现壳聚糖处理增强苹果采后抗病性与PAL、POD酶活性、总酚、木质素含量提高及PPO酶活性降低有关。本研究与前人研究相似之处是肉桂精油复合壳聚糖涂膜可显著提高番木瓜果实中的PAL、POD、β-1,3-GA酶活性以及木质素、总酚、H2O2含量,而复合处理对CHI酶活性影响不显著。本研究总酚含量的提高一方面可能是复合处理诱导果实合成更多的酚类物质,也可能是PPO酶活性的降低,减少了对酚类物质的降解,这与周会玲等[27]在苹果上的研究结果一致。所以,肉桂精油复合壳聚糖处理提高采后番木瓜果实抗病性的生理机制主要是由于提高了果实中PAL、POD、β-1,3-GA酶活性及抗病相关物质的含量。
植物的抗病过程与体内的活性氧自由基有不可分割的关系,而H2O2作为典型活性自由基,当植物受到病原菌侵染时,植物体内会产生H2O2,从而抑制病原菌孢子萌发甚至杀死病原物[28],另外,H2O2充当着植物反应中的一个重要的信号物质,作为第二信使参与植物的信号传导,激活和调控植物体内胁迫相关基因,并将信号最终放大为蛋白的翻译表达,在植物体中即为产生各种抗病相关物质[29]。关于H2O2的探索,前人也做了许多研究,如李会佳等[30]用BABA和BTH处理番茄的白粉病菌,发现番茄抵抗白粉病菌的侵染与H2O2含量增加有关。谷会等[31]研究发现氯化钙处理菠萝诱导H2O2含量的增加,调控了病程相关蛋白,增强了果实的抗病能力。本研究也得出了类似的结果,肉桂精油复合壳聚糖涂膜可显著提高采后番木瓜果实中H2O2含量,并在第9天达到峰值,而处理后番木瓜果实抗病相关酶PAL、POD、β-1,3-GA酶活性及抗病相关物质木质素、总酚含量也是在第9天达到峰值,说明可能是复合处理后,H2O2作为信号分子参与了番木瓜果实内的抗病信号传导。
总之,不同浓度的肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜采后炭疽病有较好的防治效果,其中0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理的防治效果最好,贮藏15 d后仍达92.5%。防治相关机制主要有两方面,一方面是由于肉桂精油抑制了番木瓜炭疽菌的生长和产孢,另一方面是复合处理提高了抗病相关物质木质素、总酚、H2O2的含量,提高了抗病相关酶PAL、POD、β-1,3-GA酶的活性,从而诱导番木瓜果实提高了抗病性。