木薯是世界三大薯类作物之一,起源于热带美洲,是世界第六大粮食作物,因其适应性强,耐旱、耐贫瘠等优势而被广泛栽培于热带和部分亚热带地区,是热带湿地低收入农户的主要食粮,全世界约有8亿人用木薯作食物[1]。除作为粮食作物外,木薯在化工、医药、纺织等方面均有重要作用,在我国南方,木薯主要作为我国淀粉和生物质能源的重要原料[2,3]。木薯块根中块根富含淀粉,但是缺乏铁、锌、类胡萝卜素等[4]。近年来,随着国家木薯产业技术体系提出木薯粮饲化和特用化的产业需求,木薯多用途的潜在价值逐渐得到发挥,如木薯作猪、牛、羊和蚕饲料[5,6,7,8]。前期研究表明,不同木薯种质的块根、根、茎、叶及叶柄中都含有类胡萝卜素并且该性状受多基因控制[9,10]。
类胡萝卜素是一种以异戊二烯为基础单位聚合而成的萜类化合物,类胡萝卜素种类有很多种,在高等植物中类胡萝卜素的合成除受光、氧气、营养物质等外部条件影响外,也受其激素及内在基因的调控。前期通过类胡萝卜素群体关联分析发现木薯转录因子GAMYB与其类胡萝卜素合成相关[11];激素是调控类胡萝卜素合成的关键非生物因子,木薯类胡萝卜素积累受激素调控,类胡萝卜素作为ABA生物合成的前体,外源喷施ABA能让木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白表达增强,β-胡萝卜素含量提高[12]。据研究报道PSY基因组成型过量表达,打乱了植株体内激素代谢平衡,使得赤霉素GA和脱落酸ABA的合成量减少,引起植株生长异常,反而最终抑制类胡萝卜素合成[13],说明类胡萝卜素的合成受植物激素ABA和GA的影响。因此本文采用‘SC9'木薯茎秆水培苗为研究对象,用GA3诱导木薯水培苗,对木薯叶片中4种类胡萝卜素的积累均起到不同程度的促进作用,分析GA3对木薯根、茎、叶和叶柄中类胡萝卜素生物合成相关基因及转录因子MeGAMYB的表达情况和类胡萝卜素的含量之间的关系,从而为阐释木薯GAMYB转录因子介导GA促进木薯类胡萝卜素生物合成的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为‘SC9'成熟期木薯茎秆,‘SC9'为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家审定品种,种植于儋州市国家木薯种质资源圃。
1.2 方法
‘SC9'木薯茎秆用300 mL塑料杯自来水培养,每隔3 d换一次水,室外正常光照。40 d后,用50 mg/L GA3水溶液替换自来水进行处理,分别在0、3、6、9、12 h取根、茎、叶和叶柄样品,用qRT-PCR技术检测类胡萝卜素生物合成途径中相关基因及转录因子MeGAMYB的表达情况和检测0、1、2、3、4 d取根、茎、叶和叶柄样品,用HPLC技术检测类胡萝卜素的含量。平行对照用自来水处理相同时间点取样检测。每个时间点3个生物学重复。
1.2.1 RNA的提取与定量PCR 保存的样品用液氮研磨至粉碎,称取约0.1 g粉末参照TIANGEN植物总RNA 提取试剂盒（多糖多酚类）提取根、茎、叶和叶柄的总RNA,用nanodrop和琼脂糖凝胶电泳分别检测RNA浓度以及完整度,反转录合成cDNA第一链参照TRANSGEN公司cDNA第一链合成试剂盒。
通过Phytozome 13网站查找到转录因子MeGAMYB及木薯类胡萝卜素生物合成相关基因的序列,并用Primier 5进行定量引物设计,包括MeGAMYB、MePSY、MeCRTISO、MePDS、MeZDS、MeLCYB、MeBCH、MeVDE、MeNXS、MeXAN和MeAAO以及内参基因为MeActin（表1）。利用合成的cDNA第一链稀释5倍为模板,用诺唯赞生物技术有限公司的SYBR Premix Ex Taq II 进行定量PCR。
表1 木薯类胡萝卜素积累相关基因的定量PCR引物Tab. 1 Primer of carotenoids accumulation pathway in cassava for RT-PCR |
| 基因 Gene | 正向引物（5′-3′） Forward primer (5′-3′) | 反向引物（5′-3′） Reverse primer (5′-3′) |
|---|---|---|
| MeGAMYB | CAAATGGAGGTGAGGACAATAAAAG | TTTTTCCACAACGAGAGAGCCCTGA |
| MePSY | ACTCTGTTAATGACCCCTGAAAGG | GTGTGAAGCATTAGGTCCATCAAC |
| MeCRTISO | AAAGAGGTGGATGTAGAAGGAAATG | CATCGAATGTATAACCATCCCTCTG |
| MePDS | CTTATGTGGAGGCTCAGGATGGTTT | CCTCTCTGGGGGATTTCCATCTAAG |
| MeZDS | GCTGAAGGTGGCTATTATTGGGTCT | AAGAGCCCACTTTACCACCAATGAA |
| MeLCYB | TTGCTTGATTGTCTTGATACCACCT | GCTTGGATTGTTATGCCATCGTTGC |
| MeVDE | CATGGGAGGAGGGGACTTAATTATC | TTGCCTTAGTTACATTTGCACCAGT |
| MeBCH | CGATGTATGCACGAGTCTCACCA | CTGGGACTGCGTTGATTATTGC |
| MeNXS | CGCTGCCTTCCCGTAAACGTAAACAG | CGCTGCCTTCCCGTAAACGTAAACAG |
| MeXAN | CGCAATAGAAGATGAGGTTCAAAGT | TTCTTAATGGGATCATAATTCTCGC |
| MeAAO | AGGCTATTGCTGGAAATCTTTGTCG | ATTTCCTGCTTATCTCCCTCCTTCC |
| MeActin | TGATGAGTCTGGTCCATCCA | CCTCCTACGACCCAATCTCA |
1.2.2 类胡萝卜素的提取与测定 保存的样品用液氮研磨至粉碎,根、茎、叶和叶柄称取约0.5 g粉末,加入5.0 mL的三氯乙烷:无水乙醇（V:V=1:1）提取液,12 000 r/min离心5 min,取3.0 mL上清液用氮气吹干,加入0.6 mL 20%氢氧化钾-甲醇复溶,50℃水浴60 min,用0.22 μm的有机相滤膜过滤后待测备用。
吸取0.2 mL过滤样品于内衬管,放置液相样品瓶中,HPLC测定类胡萝卜素含量。测定条件：色谱柱agilentHC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 µm);流动相：乙腈A、异丙醇B;洗脱程序：0~10 min,100%A,0~15 min,20%A,15~30 min,100%A;流速：1 mL/min;进样量：10 µL;柱温为室温;检测波长：450 nm。α-胡萝卜素（纯度>98%）、β-胡萝卜（纯度>98%）、叶黄素（纯度>98%）、玉米黄质（纯度>98%）等标准品为Sigma公司,标准品均用甲醇溶解稀释。
1.3 数据处理
利用Excel软件分析定量结果,采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量,结果以平均值加标准差表示。
2 结果与分析
2.1 GA3处理对‘SC9'木薯水培苗α-胡萝卜素含量的影响
从图1可以看出,GA诱导能促进木薯中α-胡萝卜素的合成,其中α-胡萝卜素含量在GA处理4 d时达到最高,为0.19 μg/g,而对照在相同时间点几乎无明显变化。
2.2 GA3处理对‘SC9'木薯水培苗β-胡萝卜素含量的影响
从图2可以看出叶片中β-胡萝卜素本底水平较高,GA3诱导能促进木薯中β-胡萝卜素的合成,其含量在0、1、2、3、4 d均比对照高,其中β-胡萝卜素在GA3处理2 d时达到最高,为107.73 μg/g,随后呈下降趋势;而对照在相同时间点几乎无明显变化。
2.3 GA3处理对‘SC9'木薯水培苗叶黄素含量的影响
从图3可以看出,GA3诱导能促进木薯中叶黄素的合成,其含量在0、1、2、3、4 d呈逐渐增加的趋势,4 d内达到0.31 μg/g,但未达峰值,还有上升空间;而对照在相同时间点几乎无明显变化。
2.4 GA3处理对‘SC9'木薯水培苗玉米黄质含量的影响
从图4可以看出,GA3诱导能促进木薯中玉米黄质的合成,玉米黄质含量本底水平较高,GA3处理后均比对照高,在3 d达到峰值;而对照在相同时间点几乎无明显变化。
2.5 GA3处理对‘SC9'木薯水培苗不同组织中类胡萝卜素生物合成相关基因的影响
从图5可以看出,类胡萝卜素生物合成相关基因在12 h内根、茎、叶和叶柄中均受GA3不同程度的诱导,其中MeLCYB、MeCRTISO、MePDS、MeBCH、MeAAO和MeXAN在叶片中诱导效果较明显,而MeZDS、MePSY和MeBCH在根中诱导效果明显。其中GA3调控的转录因子MeGAMYB在叶片中受GA3诱导最明显,而对照在相同时间点几乎无明显变化。
2.6 GA3处理类胡萝卜素含量与生物合成相关基因的相关性分析
除番茄红素在叶片中无法检测到外,GA3均能促进叶片中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质的积累。而叶片中β-胡萝卜素和玉米黄质含量占90%以上,转录因子MeGAMYB及木薯类胡萝卜素生物合成相关基因表达在根、茎、叶和叶柄等不同器官、组织中均受GA3诱导调控,其中MeLCYB、MeCRTISO、MePDS、MeBCH、MeAAO和MeXAN在叶片中诱导效果较明显,与GA3调控的转录因子MeGAMYB表达基本呈一致趋势,初步可以筛选出受转录因子MeGAMYB调控的基因如MeLCYB、MeCRTISO、MePDS、MeBCH、MeAAO和MeXAN等。
3 讨论
GAs是一类重要的植物激素,其在延缓植物叶片衰老、抑制叶绿素的降解、植物开花诱导和果实发育过程起着重要作用[14,15,16,17]。GAMYB是一个受GA3调控的编码一个R2R3-MYB DNA结合结构域的MYB类转录因子,是GA3信号应答途径中首个被鉴定出来的正向作用的因子,在拟南芥和水稻中,mir159调控的GAMYB-like家族转录因子主要在花发育和谷物糊粉层重点GA3信号转导[18,19]。其中GID1（Gibberellin-Iinsensitivedwarf1）是GA3的受体,其能感知GA3信号通过受体GID1蛋白传给DELLA,DELLA蛋白属于GA3信号和植物生长发育的关键抑制因子,而GA3促进植物的生长发育是通过降解DELLA蛋白来完成[20]。GA3跟GID1与DELLA蛋白的相互作用会引起一些转录因子如MYB和FIT等转录因子基因表达量的上调[21,22]但是对于GAMYB在类胡萝卜素代谢中的调控机理研究相对较少。
类胡萝卜素是木薯粮饲化的重要指标,木薯中类胡萝卜素主要包括有α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素和番茄红素等。据研究报道,木薯块根中仅β-胡萝卜素含量占总类胡萝卜素含量的90%[23],而本研究以木薯叶片为研究对象,与块根研究结果不同,木薯叶片中主要含有β-胡萝卜素和玉米黄质,二者含量占90%以上,而α-胡萝卜素和叶黄素占极少的部分。本文在GA3的作用下,木薯水培苗各个组织中类胡萝卜素代谢途径中的基因和MeGAMYB都受到不同程度的调控,特别是叶片中MeGAMYB的表达量出现了显著上调,同时,相关基因如MeLCYB、MePDS等也出现了显著上调。基于本文研究结果可以推测,在GA3信号条件下,GA3信号分子与 GID受体蛋白结合从而导致植物生长的抑制因子DELLA蛋白通过泛素-蛋白酶体途径被降解,MeGAMYB与DELLA蛋白相互作用促进了类胡萝卜素生物合成途径相关基因的表达,从而促进了类胡萝卜素的生物合成,但是具体的机理研究还需要进一步探索。本结果为后续研究木薯类胡萝卜素代谢提供了候选基因和相关的转录因子,为进一步研究木薯类胡萝卜素合成的机理提供参考,也为提高木薯叶片和块根中类胡萝卜素含量的研究奠定了基础。