热激蛋白（heat shock protein, HSP）又称热休克蛋白,是指生物体遭受物理、化学和生物等胁迫刺激后,大量表达或者新合成的一类高度保守的蛋白质。HSP广泛存在于各种生物体内,在结构上高度保守,根据分子量大小将HSP分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、sHSP家族[1]。小热激蛋白（small heat shock protein, sHSP）是植物中含量最丰富的热激蛋白,分子量约为12~ 42 kDa,多数为15~27 kDa。植物sHSP由核内多基因家族编码,并且其sHSP的数量因植物种类而异。如拟南芥有19个sHSP[2],水稻有23个sHSP[3],杨树有36个sHSP[4],辣椒有35个sHSP[5],番茄有42个sHSP[6]。
在正常生长情况下,植物组织中sHSP基因家族表达量非常低,而一旦热激或其它逆境胁迫诱导刺激,sHSP基因家族的表达量迅速增加,同时生物体对逆境胁迫的耐受能力也会提高。水稻多重应激反应基因3（multiple stress-responsive gene 3, OsMSR3）是一个sHSP基因,其表达在提高拟南芥对金属离子镉胁迫的耐受性的同时也增加了抗氧化相关基因的表达[7];在拟南芥中过表达茶树CsHSP17.2,可显著提高转基因拟南芥在热激胁迫下的存活率[8];甘蔗sHSP通过硅胁迫可诱导甘蔗抗旱性提高[9]。sHSP家族能够行使各种不同的功能,核心在于其具有分子伴侣活性。豌豆中线粒体sHSP22表现为一种保持酶,可与其他蛋白质共沉淀,以帮助缓解在热胁迫适应过程中其他分子伴侣的分解和重折叠[10]。此外,sHSP具有调节植物发育的功能,如VvHSP20s参与了葡萄浆果的发育[11];而SlHSP17.7和糖可相互作用以调节番茄果实的发育,并影响番茄的品质[12]。因此,植物sHSP是一类具有多样化功能的小分子蛋白。
巴西橡胶树又名三叶橡胶,多年生常绿落叶大乔木,原产于拉丁美洲的亚马逊流域。由于病害、台风、干旱和低温等逆境胁迫,使得橡胶树干胶产量严重下降。因此,研究橡胶树抗逆机制具有十分重要的意义。鉴于sHSP基因家族在植物抵抗逆境胁迫响应中的重要作用,及其在进化和功能上的高度保守,推测sHSP基因家族可能在橡胶树抗逆境胁迫中发挥重要作用。以往有关植物sHSP家族基因的研究主要集中在拟南芥、水稻、番茄和杨树等植物中,关于多年生热带植物中的sHSP研究鲜有报道。目前,在橡胶树中,sHSP基因家族成员是否响应生物或非生物胁迫还未见系统报道。本研究系统研究橡胶树sHSP家族中12个sHSP基因家族成员的生物信息学和表达模式,为深入研究sHSP家族基因在橡胶树抗逆镜胁迫中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）‘热研7-33-97’品系幼树购自于中国热带农业科学院橡胶研究所,乙烯利处理参照Hao等[13]的方法,处理浓度为1%,以不做任何处理的幼树为对照,采集处理后0、4、8、24、48、72 h树皮;本研究中橡胶树不同组织材料均取自‘热研7-33-97’健康树,以上样品分别设置至少3个生物学重复。以‘热研8-79’健康树、2~3级和4~5级死皮树为材料提取树皮的RNA,由中国热带农业科学院橡胶研究所李德军研究员赠予。RNA提取试剂盒购自百泰克;反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自天根公司;所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余试剂药品购于索莱宝公司;荧光定量PCR仪器为瑞士Roche公司的LightCycler® 96。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成 按照通用植物总RNA提取试剂盒（RP3001）提取橡胶树不同组织总RNA,对总RNA进行定量和电泳检测,样品cDNA第一链合成按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(KR118)说明书进行。
1.2.2 橡胶树sHSP基因家族成员的命名与生物信息学分析 课题组前期获得橡胶树转录组数据[14],通过分析获得12个橡胶树sHSP家族基因;通过ExPASy网站中的在线程序ProtParam分析蛋白质的基本性质;利用NCBI中Conserved Domain Database预测蛋白保守结构域;通过SOPMA在线工具预测蛋白的二级结构。
1.2.3 橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析 采用罗氏LightCycler® 96的RT-PCR系统对12个橡胶树sHSP基因家族的表达模式进行分析。以分别稀释10倍的各样品cDNA为模板,Hbβ-actin为内参,使用各sHSP基因特异性引物进行RT-PCR分析。反应总体系为20 μL,其中包括4.0 μL mix,上下游荧光定量特异性引物（10 μmol/L）各0.6 μL,cDNA模板1.0 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性15 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40个循环。每个样品重复3次,采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。使用SPSS 26.0软件对数据进行差异显著性分析,用Excel 2019软件制图。本研究所用的引物序列见表1。
表1 sHSP基因表达分析所用引物序列Tab. 1 Primers sequences used in expression analysis of sHSPs |
| 基因名称 Gene name | 上游引物序列（5′-3′） Forward primer sequence (5′-3′) | 下游引物序列（5′-3′） Reverse primer sequence (5′-3′) |
|---|---|---|
| Hbβ-actin | GATTCCGTTGCCCAGAAGTC | CACCACTCAGCACAATGTTACC |
| HbsHSP15.8 | GCGGAGAAAGAAGTATGG | GCCTTCGGAATAGTAACAG |
| HbsHSP16.2 | CCAAAGCCATCTAAAGTG | GTTCATCACAAGGCAAAT |
| HbsHSP17.3 | AACCCAACAAGCAGCATT | TTTGAGCCCAGGAAGGTC |
| HbsHSP17.4 | TTGCTACGGACATCTTGG | CTTCCTCCTCACCCTCTT |
| HbsHSP17.5a | GAGGAGGTGAAAGTAGAGG | TTAGCATTCTCAGGCAAC |
| HbsHSP17.5b | AGAGTATCCCAACTCCTATGT | TAGCACCTTCCTTCTCCT |
| HbsHSP18.2 | TTCTTGAGGAGGTTTAGG | TGTAGTTACACCCATTCC |
| HbsHSP18.3 | CCAGGGCTAAAGAAAGAG | CCTCAGGAATTTCCCACT |
| HbsHSP22.5 | TCAGTCCCTTGTTGTTTG | CTCCTGGTAGTTCTGCTT |
| HbsHSP22.6 | CACTTCTCCCATTTGTTG | CCCTATTCTCCTCCACCT |
| HbsHSP23.9 | TGTGGCACCTTCTGTTTC | GGCTCAGAGTCCTCGTTG |
| HbsHSP25.8 | CATTCCTAAGACCCAAGT | ACGCATACATACATACCG |
2 结果与分析
2.1 sHSP基因家族的命名与生物信息学分析
表2 橡胶树sHSP蛋白的基本性质Tab. 2 Characterization of sHSPs from H. brasiliensis |
| 名称 Name | 登录号 Accession No. | 氨基酸数 Number of amino acids | 蛋白 分子量 Molecular weight/kDa | 理论 等电点 Theoretical pI |
|---|---|---|---|---|
| HbsHSP15.8 | XM_021795255.1 | 140 | 15.8 | 5.56 |
| HbsHSP16.2 | XM_021815233.1 | 143 | 16.2 | 6.92 |
| HbsHSP17.3 | XM_021826758.1 | 151 | 17.3 | 5.80 |
| HbsHSP17.4 | XM_021824793.1 | 155 | 17.4 | 6.84 |
| HbsHSP17.5a | XM_021810470.1 | 153 | 17.5 | 5.51 |
| HbsHSP17.5b | XM_021815466.1 | 156 | 17.5 | 5.79 |
| HbsHSP18.2 | XM_021826752.1 | 157 | 18.2 | 5.08 |
| HbsHSP18.3 | XM_021782424.1 | 162 | 18.3 | 5.99 |
| HbsHSP22.5 | XM_021809362.1 | 195 | 22.5 | 5.17 |
| HbsHSP22.6 | XM_021780759.1 | 198 | 22.6 | 6.15 |
| HbsHSP23.9 | XM_021787784.1 | 214 | 23.9 | 7.78 |
| HbsHSP25.8 | XM_021824066.1 | 233 | 25.8 | 7.63 |
表3 橡胶树sHSP蛋白家族二级结构含量Tab. 3 Contents of secondary structure of sHSP proteins in H. brasiliensis% |
| 蛋白名称 Protein name | α-螺旋 Alpha helix | 延伸链 Extended strand | β-转角 Beta turn | 无规则卷曲 Random coil |
|---|---|---|---|---|
| HbsHSP15.8 | 14.29 | 19.29 | 5.00 | 61.43 |
| HbsHSP16.2 | 12.59 | 25.87 | 8.39 | 53.15 |
| HbsHSP17.3 | 19.87 | 21.85 | 5.30 | 52.98 |
| HbsHSP17.4 | 27.74 | 23.87 | 9.03 | 39.35 |
| HbsHSP17.5a | 26.80 | 20.26 | 6.54 | 46.41 |
| HbsHSP17.5b | 27.56 | 24.36 | 4.49 | 43.59 |
| HbsHSP18.2 | 19.75 | 20.38 | 7.01 | 52.87 |
| HbsHSP18.3 | 17.90 | 17.90 | 5.56 | 58.64 |
| HbsHSP22.5 | 23.08 | 21.03 | 8.21 | 47.69 |
| HbsHSP22.6 | 28.28 | 19.70 | 7.07 | 44.95 |
| HbsHSP23.9 | 26.64 | 14.49 | 5.61 | 53.27 |
| HbsHSP25.8 | 12.45 | 18.03 | 3.86 | 65.67 |
2.2 sHSP基因家族在不同组织和叶片不同发育时期表达分析
通过RT-PCR分析12个sHSP家族基因的组织表达模式,sHSP家族基因的表达量在各组织中的表达水平存在明显差异（P<0.05）。除了HbsHSP 22.6在胶乳中高表达,在树皮中较低表达,而在其他组织中超低表达或几乎不表达,其他sHSP成员没有组织特异性,大部分sHSP成员在胶乳中表达量最高,如HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP 18.2、HbsHSP 8.3、HbsHSP22.5和HbsHSP23.9;而HbsHSP17.4则在树皮中表达量最高;HbsHSP 17.5a则在树茎中表达量最高;HbsHSP25.8则在树叶中表达量最高（图1）。12个sHSP家族基因在橡胶树叶片的不同发育时期的表达模式结果见图2,每个小热激蛋白在橡胶树叶片的每个发育时期（古铜期、浅绿期、成熟期、衰老期）均有表达,其中,HbsHSP15.8在成熟期中显著高表达;HbsHSP16.2、HbsHSP 7.4和HbsHSP18.2在古铜期和浅绿期2个时期表达量最高;HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在古铜期和衰老期表达量最高;HbsHSP17.3、HbsHSP17.5a、HbsHSP18.3和Hbs HSP22.6在橡胶树叶片古铜期表达量最高,且HbsHSP17.3和HbsHSP22.6的基因表达模式类似,表达量在叶片发育中从古铜期至衰老期呈现缓慢下调的趋势,而HbsHSP17.5a和HbsHSP18.3则呈现显著的下降-上升-下降的趋势;HbsHSP17.5a和HbsHSP22.6基因在橡胶树叶片不同发育时期的表达量无明显变化。
图1 12个橡胶树sHSP基因家族在不同组织的表达分析不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 1 Expression patterns of twelve sHSP genes family of rubber tree in different tissues Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.3 sHSP家族基因在不同死皮等级橡胶树中的差异表达
为了明确橡胶树12个sHSP家族基因在不同死皮等级橡胶树中的表达谱。本研究利用RT-PCR系统分析12个sHSP家族基因在健康、轻度死皮和重度死皮橡胶树树皮中的表达水平。统计分析结果表明,在橡胶树品种‘热研8-79’中,HbsHSP 15.8、HbsHSP 17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、Hbs SP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP23.9和HbsHSP 25.8在死皮树中的表达量与健康树相比明显降低,且随着橡胶树死皮病严重程度的增加呈现显著下降趋势;HbsHSP22.6基因在患轻度死皮病树皮中的表达量与健康树无明显差异,而在重度死皮树中严重下降;相反,HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和Hbs HSP22.5基因在罹病树中的表达水平与健康树相比均有不同程度的上调,其中HbsHSP16.2只有在重度患病树中显著上调,HbsHSP17.3的表达模式则随死皮病严重程度的增加呈现显著上调的趋势,而HbsHSP22.5虽然在患病树中大量积累,却与死皮病的严重程度无明显相关（图3）。橡胶树死皮病是一种十分复杂的生物学过程,可能由多个途径参与调控,综上所述,推测橡胶树sHSP家族基因可能以正调控或负调控的方式参与橡胶树多种逆境胁迫或病害等,并在其中发挥重要作用。
2.4 乙烯处理对橡胶树sHSP基因家族表达的影响
通过RT-PCR分析sHSP基因家族在乙烯处理橡胶树中的表达模式,结果见图4。HbsHSP15.8的表达量在1%乙烯处理4 h后明显下降,8 h时上升,24 h时再下降,48 h到72 h逐步上升到原来的水平;HbsHSP16.2在乙烯处理后表达量显著下降,直到48 h开始有缓慢上升的趋势;HbsHSP17.3则在乙烯处理后,表达量在4 h和8 h显著上升,然后在24 h显著下调,到72 h时略有上升;Hbs HSP17.4与HbsHSP17.3总体上相似,不同的是HbsHSP17.4是在8 h时才开始显著上升;而HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP22.5的表达模式大致为上升-下降-上升趋势;而HbsHSP 18.2和HbsHSP23.9从4 h开始显著下调,HbsHSP 18.2在72 h时有上调,HbsHSP23.9则从48 h开始略有上调;HbsHSP22.6在乙烯处理后,显著下降,随着处理时间的推移,未有明显上升趋势,推测HbsHSP22.6可能受逆境胁迫影响最严重,使得其表达量急剧下降。HbsHSP18.3和HbsHSP 25.8呈下降-上升-下降趋势,区别是HbsHSP18.3在8 h时表达量不仅显著上升,并且超过了对照。上述结果表明,橡胶树sHSP基因家族的12个成员均可能参与乙烯相关信号转导。
3 讨论
不同植物的同种sHSP在氨基酸组成上具有高度同源性,所有sHSP的C端都有一个保守的ACD结构域。不同的sHSP分子在结构上呈现复杂的多元化,其编码的蛋白主要由3部分组成,包括不同物种间不相同的N端臂、高度保守的ACD结构域和相似的C端延伸结构,同一物种间具有相对保守性。本研究检测了橡胶树sHSP基因家族中12个sHSP基因成员的表达模式,结果发现在12个sHSP蛋白中均预测到ACD结构存在。二级结构分析显示,12个sHSP蛋白二级结构均具有sHSP蛋白的典型特征,由α-螺旋、β-转角、延伸链和大量的随机卷曲组成。ACD保守区域和二级结构的分布与含量特征对sHSP蛋白行使功能至关重要,推测橡胶树的这12个sHSP蛋白具有小热激蛋白分子伴侣活性,可能参与逆境胁迫。
已有研究结果表明,除热激外,sHSP基因家族也在胚胎发生、种子成熟和萌发、花粉发育及果实成熟等植物生长发育的特定时期表达[15]。对高粱sHsp基因家族中的15个SbsHSP家族基因表达谱分析发现,SbsHsp家族基因在根和叶中大量积累[16];在豌豆中,线粒体sHSP2基因在叶子中受热激或氧化胁迫诱导,但在种子发育过程中也强烈积累[10];叶绿体sHSP21蛋白通过和质体类核蛋白pTAC5（plastid transcriptionally active 5）相互作用,构成一个蛋白复合体,是叶绿体发育所必需的[17]。与上述研究结果一致,橡胶树sHSP家族中的12个sHSP成员在橡胶树不同组织和叶片发育时期表达存在差异。大多数橡胶树sHSP基因家族成员如Hbs SP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP 17.3、HbsHSP 7.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP 2.5、HbsHSP22.6和HbsHSP 23.9在胶乳中的表达量明显高于其他组织,暗示其在胶乳中具有重要功能。
由于sHSP合成与胁迫响应相关,人们普遍认为sHSP的作用在于保护逆境中的细胞,减轻逆境胁迫对植物体的损害。在热胁迫下,耐热品系辣椒比热敏品系辣椒具有更高的CaHSP16.4表达水平。在耐热品系中沉默的CaHSP16.4会导致丙二醛含量的显著增加和总叶绿素含量的显著降低,而将其转入拟南芥后,CaHSP16.4过表达系的存活率明显高于野生型,电导渗漏率明显降低,说明CaHSP16.4可帮助植物增强热胁迫的耐受性[18];而Hsp17.6CⅡ的过表达赋予了拟南芥过氧化氢酶活性和对非生物胁迫的耐受性[19];前人研究表明,小麦TaHSP20基因家族在小麦胁迫调控应答中的重要性,并提出sHSP可提高小麦耐热性的育种目标[20]。与上述报道结果一致,本研究结果表明,橡胶树sHSP基因家族表达受乙烯和死皮病害的胁迫调控,推测sHSP基因家族参与橡胶逆境胁迫反应并在其中发挥重要作用。我国属非传统植胶区,橡胶树生长周期内不可避免地受到台风、低温和季节性干旱等逆境条件影响。在此之前,研究者就关注到sHSP基因在橡胶树抗逆镜过程中扮演的重要角色,先后研究了HbsHSP14和HbsHSP17[21],以及HbsHSP23.8[22],以上2个研究都较全面的分析了橡胶树在不同胁迫逆境下HbsHSP14、HbsHSP17和HbsHSP23.8基因的表达模式,其结果也表明HbsHSP14、HbsHSP17和HbsHSP23.8基因的表达受到高盐、干旱、低温、乙烯和茉莉酸处理调控,揭示了HbsHSP14、HbsHSP17和HbsHSP23.8在橡胶树逆境胁迫应答、乙烯和茉莉酸信号途径中可能发挥作用。乙烯是在橡胶树中研究较为深入且应用较广的激素,实践证明乙烯可作为橡胶树增产刺激剂,通过延长排胶时间提高橡胶产量。鉴于sHSP基因在进化和功能上的保守性,以及橡胶树sHSP基因家族在逆境处理的表达模式的相对一致性,进一步揭示了sHSP在抵御橡胶树逆境胁迫中的重要作用。