芒果壮铗普瘿蚊（Procontarinia robusta）属双翅目（Diptera),瘿蚊科（Cecidomyiidae）,普瘿蚊属（Procontarinai Kieffer & Cecconi）,属于我国入侵害虫[1,2],风险等级为高度风险,列为我国二类检疫对象进行管理[3,4]。芒果壮铗普瘿蚊生活习性表现为寄主专一,只为害芒果树,雌虫产卵量巨大,产卵于叶背,卵孵化后的幼虫唾液刺激叶肉形成坚硬虫瘿,幼虫在虫瘿内取食直到成虫才破壳飞出,喷洒农药难以穿透瘿壳达到靶标害虫,防治困难。受害严重的单个叶片虫瘿数可达到600多个,影响植物的光合作用和生长发育,同时高密度的虫瘿在叶片衰老期很容易导致煤烟病[5,6]。因此寻找调控瘿蚊行为的有效方法成为芒果壮铗普瘿蚊防控中亟待解决的重要课题。
昆虫的行为与植物挥发性气味的组分密切相关[7]。昆虫在长期的进化中形成一套敏感复杂的气味识别和鉴定机制,其中挥发物气味作为桥梁与其他昆虫或者天敌建立协同或者对抗关系,并通过特定的气味组合寻找到合适的寄主、食物资源、配偶或者躲避敌害[8],“推-拉”理论认为,通过不同植物对害虫趋避或者吸引来进行防控[9],但大部分研究集中在单一植物对昆虫的行为影响,而植物气味多样性（plant odor diversity）的提出主要基于大田中气味环境的多样性变化。不同寄主植物的组合气味可以干扰昆虫的行为,比如棉铃虫（Helicoverpa armigera）在不同的寄主组合中产卵寄主选择发生变化,说明其对气味的敏感存在一个上限,超过阈值无法识别过于复杂的化学信息[10,11,12]。三级营养关系研究同样发现,被为害后的植物释放的挥发性气味会吸引天敌的到来,比如被蚜虫为害后,诱导甘蓝产生的挥发物可吸引寄生蜂[13],被棉蚜（Aphis gossypii）和桃蚜（Myzus persicae）为害后的甜椒释放的挥发物可吸引天敌瓢虫（Cycloneda sanguinea）[14];昆虫对植物的选择机理对开发昆虫行为调控策略具有重要的前景[15]。触角电位（electroantennography,EAG）技术可以判断哪种挥发物对昆虫触角化学感受器有刺激作用。昆虫的嗅觉感受器主要分布在触角上,每个触角感受器细胞都可以被认为是一个电压源和电阻的集合体。触角电位信号是一种可以被仪器测量的电压偏差[16]。通过研究植物挥发性气味成分与昆虫之间的行为反应结合触角电位反应值,筛选出有效的挥发物成分,可以开发引诱剂或者趋避剂,从而在其搜索寄主、觅食、寻找配偶等环节上制造人为干扰,达到安全高效的防治效果。本文根据前期芒果叶片植株挥发物的分析检测结果[17],选取5种寄主挥发物,通过触角电位（EAG）和“Y”型管嗅觉仪技术,研究植物挥发性物质与昆虫行为选择之间的内在关系,筛选对其具有生物活性作用的植物挥发物,为研发芒果壮铗普瘿蚊行为调控剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 昆虫采集 新鲜的活虫瘿叶片采集于集美大学水产学院以及厦门市集美区银江路两侧的芒果树上。将新鲜活虫瘿叶片剪取枝叶,取尺寸30 cm×40 cm的密封袋,将剪取的枝叶末端用棉花保湿后放入密封袋内,吹入空气使之膨胀后密封,防止羽化后成虫飞走及操作致死。在瘿蚊羽化飞出后,用试管小心将瘿蚊成虫引入试管备用。
表1 供试试剂名称、纯度和生产厂家Tab. 1 Chemical agent purity and provider |
| 名称 Chemical agent | 纯度 Purity/% | 生产厂家 Manufacturer |
|---|---|---|
| α-蒎烯 | ≥99.0 | Sigma-Aldrich公司 |
| 3-莰烯 | ≥90.0 | Sigma-Aldrich公司 |
| α-石竹烯 | ≥98.5 | Sigma-Aldrich公司 |
| 异松油烯 | ≥85.0 | Sigma-Aldrich公司 |
| 乙酸乙酯 | ≥85.0 | 天津市科密欧化学试剂开发中心 |
1.2 方法
1.2.1 触角电生理反应测定 本研究中所使用的触角电位仪是荷兰syntech公司所生产。主要包括毛细管电极（内径0.02 mm）、微动操作仪（syntech- MP15）、直流/交流放大器（syntech-UN06）和刺激气流控制装置（syntech-CS05）[16]。
将瘿蚊成虫的触角切下,由于触角活性会随着时间的推移而降低,所以应在触角切下后,尽快进行电生理反应的测试。将切下的触角的端部去掉,用毛细管将触角的两头分别接在电极上,毛细管中吸入生理盐水作为导电液。用移液枪吸取20 μL试验所用的0.01 μL/μL的样品溶液,滴在折成“V”字形的滤纸片上,滤纸片应大小适宜,过大容易影响气流,过小则不能完全吸取样品溶液。使用裁成5.0 cm×0.5 cm大小的滤纸片。将吸取样品溶液后的滤纸片放入巴斯德滴管中。滴管的一头与气流控制装置连接,一头与送气管连接。送气管管口和固定好的触角相垂直。实验开始后,控制连续气流的流速为125 mL/min,刺激气体的流速为20 mL/min。每次刺激的持续时间为0.2 s,每隔40 s刺激1次,共刺激3次,最后取其平均值。每个样品进行5个触角的测试。以正己醛作为参照。每组实验以参照、样品、参照的顺序进行。参照值最后取前后2个的平均值。以液体石蜡油作为溶剂和对照。
1.2.2 行为反应测定 行为反应测定使用的是“Y”型嗅觉仪。其主体结构是一个“Y”字形的玻璃管,直管和两臂长度均为30 cm左右,内径约为2 cm,两臂夹角为75°。实验过程中,在直管的一端用橡胶管与一个大气采样器进行连接,另一端的两臂分别用两根相同大小的试管与之连接,交叉处采用标准磨口制成。在实验时,一根试管中放入沾有300 μL的浓度为0.01 μL/μL的样品试剂的棉花,另一端放入空白（空气）样。将刚羽化的芒果壮铗普瘿蚊从密封袋引入“Y”型管的直管部分。接着开启大气采样器,使其以1 L/min的恒定流速向外进行抽气,使得试剂挥发气体和空白样气体均能匀速地从直管中通过。实验持续进行4 h后,关闭大气采样器,观察并统计试剂管、空白管中无行为的芒果壮铗普瘿蚊的头数。并通过在解剖镜下观察其生理结构,确定实验所用壮铗普瘿蚊的雌雄性。每次实验10头瘿蚊,重复3次。实验结束后须将“Y”型嗅觉仪用清水清洗并吹干,然后使用95%酒精冲洗并再次吹干,避免试剂残留影响下一种试剂或浓度的实验结果。比较5种浓度梯度（0.125 mL/L、0.25 mL/L、0.5 mL/L、1 mL/L和2 mL/L）对瘿蚊选择行为的差异。
1.3 数据处理
EAG相对反应值=（待测样品的反应值-对照反应值）/（参照物的反映值-对照反应值）×100%
行为反应中进入处理臂中的芒果壮铗普瘿蚊的头数表示瘿蚊对植物挥发性物质的定向,记为吸引;进入对照臂记为趋避;停留在直管中则记为不反应。趋避率、引诱率以及反应率用以下公式计算：
引诱率=x/（x + y）×100%;
趋避率=y/（x + y）×100%;
反应率=（x + y）/w×100%
x为在处理臂中的瘿蚊的数量,y为在对照臂中的瘿蚊的数量,w为瘿蚊的总数[18]。实验数据采用SPSS软件进行方差分析,采用平均值±标准误（SE）表示,并采用Excel软件绘制统计图。EAG相对反应值（%）、引诱率和趋避率采用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 芒果壮铗普瘿蚊对5种挥发物的触角电位反应
实验结果显示α-蒎烯、3-莰烯、α-石竹烯、异松油烯、乙酸乙酯均能引起芒果壮铗普瘿蚊雌蚊和雄蚊的较为明显的电生理反应。
雌蚊触角电位显示：α-蒎烯处理组显著高于其他挥发物,3-莰烯与α-石竹烯之间差异不显著,异松油烯与乙酸乙酯差异不显著（图1A）。
雄蚊触角电位显示：α-蒎烯的EAG反应值显著高于其他处理组;3-莰烯和α-石竹烯二者间的EAG反应值差异不显著,和其他3种挥发物差异显著;异松油烯和乙酸乙酯二者间的EAG反应值差异不显著,和其他3种挥发性物质的EAG反应值差异显著（图1B）。
表2 雌雄蚊对5种挥发物质的EAG反应值对比Tab. 2 Comparision of EAG response values between male and female of Procontarinia robusta adults to different plant volatiles % |
| 项目Item | α-蒎烯α-Pinene | 莰烯3-Camphene | α-石竹烯α-caryophyllene | 异松油烯Terpinene | 乙酸乙酯Ethyl acetate |
|---|---|---|---|---|---|
| 雌虫 | 197.61±17.38a | 123.67±4.87a | 105.21±4.25a | 83.39±6.04a | 72.74±3.75a |
| 雄虫 | 183.21±10.35a | 116.17±4.80a | 104.58±1.89a | 87.87±3.15a | 79.94±3.65a |
注：同列相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。 | |
Note: The same lowercase letters in the same column indicate no significant difference (P>0.05). |
2.2 芒果壮铗普瘿蚊对芒果挥发物的行为反应
同一浓度0.01 μL/μL不同挥发物选择性显示,3-莰烯对瘿蚊的吸引率最高,达到74.20%,显著高于α-蒎烯、异松油烯;乙酸乙酯次之,平均吸引率达到66.07%;5种挥发性物质对于壮铗普瘿蚊的吸引率大小的排序为3-莰烯>乙酸乙酯>α-石竹烯>α-蒎烯>异松油烯,其中,3-莰烯、乙酸乙酯和α-石竹烯两两之间对壮铗普瘿蚊的吸引率差异不显著;异松油酯对壮铗普瘿蚊的趋避性最高,达到74.25%,显著高于其他挥发物（表3）。
表3 芒果壮铗普瘿蚊对5种挥发性物质的行为反应Tab. 3 Selective response rate of Procontarinia robusta on different plant volatiles substance % |
| 反应行为Selective response | α-蒎烯α-Pinene | 3-莰烯3-Camphene | α-石竹烯α-caryophyllene | 异松油烯Terpinene | 乙酸乙酯Ethyl acetate |
|---|---|---|---|---|---|
| 吸引率 | 53.59±0.15b | 74.20±2.87a | 64.17±3.37ab | 25.76±4.37c | 66.07±5.16a |
| 趋避率 | 46.41±0.15b | 25.80±2.87c | 35.84±3.37bc | 74.25±4.37a | 33.93±5.16c |
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same line indicate significant difference (P<0.05). |
2.3 不同浓度挥发物对芒果壮铗普瘿蚊的选择行为差异分析
实验中也显示浓度阈值现象,α-蒎烯在浓度0.5 mL/L和1 mL/L有显著的趋避效果,在高于或低于此范围内的其他浓度引诱率和趋避率差异不显著。3-莰烯和α-石竹烯处理组随着浓度的升高对瘿蚊的引诱率增加。莰烯是一种双环单萜烯类化合物,是蒎烯的异构产物,结果显示对瘿蚊的选择率不一样。3-莰烯在浓度0.5、1、2 mL/L表现出引诱率显著高于趋避率;α-石竹烯在浓度1 mL/L和2 mL/L对芒果壮铗普瘿蚊有显著引诱作用,低浓度下引诱率和趋避率差异不显著;异松油烯也叫萜品油烯,异松油烯和乙酸乙酯实验观察结果显示高浓度对瘿蚊有显著的趋避性,低浓度的引诱率和趋避率差别不显著,当浓度达到2 mL/L时,瘿蚊的引诱率显著高于趋避率（图2）。
图2 芒果壮铗普瘿蚊对不同挥发物的行为反应卡方检验中的差异显著性水平分别用NS（P>0.05,无显著差异）和*（P<0.05, 差异显著）表示。 Fig. 2 Selection of Procontarinia robusta to different concentration of volatiles Significance levels of χ2 test are indicated by NS (P>0.05, no significant difference) and * (P<0.05, significant difference), respectively. |
3 讨论
昆虫依赖触角感受器与其周围环境中的大量化学信息发生联系。通过特定的化学感觉机制,昆虫可感知来自种内和种间以及无机环境中的各种化学信息,并由此而做出相应的行为反应,从而为自身寻找适宜的食物、配偶以及生存与繁殖场所（如躲避天敌、避免或减少竞争等）,成功达到最大繁殖。不同种类的昆虫,由于它们的化学感觉器的种类、数量、分布以及发达程度等的差异,表现出各自独特的相应行为反应[19]。
本研究结果表明,3-莰烯表现出较高的引诱性,类似的研究认为3-莰烯不仅对害虫有吸引作用,而且对天敌也具有同样的引诱效果。比如麦蚜的4种捕食性天敌昆虫七星瓢虫（Coccinella septempunctata）、龟纹瓢虫（Propylaea japonica）、中华通草蛉（Chrysoperla sinica）和大草蛉（Chrysopa septempunctata）对2-莰烯表现出正趋性[20];莰烯对松瘿小卷蛾（Cydia zebeana）雌蛾表现为低浓度引诱,高浓度驱避,对雄蛾和其天敌小卷蛾革腹茧蜂（Ascogaster olethreuti）均有趋避作用[18],莰烯对枸杞红瘿蚊（Jaapiella sp.）雌虫引诱率为62%[21]。
本研究结果表明,α-蒎烯对芒果壮铗普瘿蚊有较高的吸引率。一些研究表明α-蒎烯对昆虫的行为影响差别较大,有的表现为引诱,有的表现为趋避,比如α-蒎烯对双斑长跗萤叶甲有明显的引诱性[22];青杨脊虎天牛雌虫对α-蒎烯没有明显的定向行为反应[23];β-蒎烯能使马尾松毛虫雌蛾对其产卵喜好性显著地下降[24];α-蒎烯对枸杞红瘿蚊雌虫的选择率为38%,具有显著的驱避作用[21],对松瘿小卷蛾（Cydia zebeana）雄蛾也产生驱避作用[18]。Wibe等[25]认为昆虫对同一挥发物不同浓度表现出不同行为反应是因为昆虫嗅觉感受神经元对挥发物具有浓度反应阈值,在阈值范围内,表现为引诱,阈值范围外则反应受到抑制,比如褐飞虱（Nilaparvata lugens）对低浓度芳樟醇表现为引诱,高浓度下为驱避[26]。
虽然异松油烯对枸杞红瘿蚊有显著的引诱性[21],但是本研究结果表明其对芒果壮铗普瘿蚊却是趋避作用,浓度的差异可能是导致结果差别的主要原因。乙酸乙酯是很多植物的挥发物成分之一,对昆虫行为调控也有所差别。比如当棕榈象甲（Rhynchophorus palmarum）雄虫接收到寄主植物挥发性物质乙酸乙酯时就会释放出聚集信息素[32];乙酸乙酯能引起斑翅果蝇强烈触角电位反应,但是当加入到乙醇和乙酸的混合物中对斑翅果蝇的引诱率并没有增效作用[33]。这种现象可以用“气味环渡理论”来解释,该理论从人类调香技术延伸而来,认为将各种不同的气味排列分别罗列在一个圆图上,利用“相邻补强、对角补缺”的规律指导香料之间的相互强化或相互掩蔽[34],所以也能解释虽然EAG反应值高的气味分子在混合物中并不一定都能起到行为增强效果。实验中的α-蒎烯的EAG值最高,但是行为反应最高的却是3-莰烯,因此在未来开发行为调控剂应结合行为反应和EAG筛选高效低浓度挥发物。
芒果叶片挥发物浓度与瘿蚊寄主选择的微妙关系目前尚未定论,植物释放的物质多为低分子量、亲脂性和高挥发性,距离可达几十米,昆虫的行为与植物的挥发性气味的组分密切相关[7],昆虫对挥发物的识别不是单一组分,而是通过不同组分比例的挥发物图谱识别寄主[28],原则上认为昆虫寻找配偶过程中涉及到物种特异性信息素,但是越来越多的证据证明植物挥发物对这个过程起到促进作用,即植物挥发物和信息素形成的气味组合可以帮助昆虫及时有效地找到配偶[35];利用植物源挥发物可以引诱害虫,阻扰害虫行为,或者对昆虫信息素作用有增强效果。因此单一的检测某一物质对芒果壮铗普瘿蚊的引诱性来确定其作用机制是不够全面的,应进一步测定挥发物多组分与瘿蚊寄主选择是未来的研究重点。