槟榔（Areca catechu L.）,是多年生常绿乔木,属棕榈科中的槟榔亚科,主要分布于中国、柬埔寨、东非、埃及、印度、马来西亚、阿拉伯半岛等热带和亚热带地区。在中国,槟榔位列“四大南药”之首,具有抗炎症、治疗水肿、脾胃疼痛、驱寄生虫、抗真菌、抑制流行性感冒等效果[1,2,3,4,5],其药用价值在我国已有1000多年的历史。其中,海南槟榔种植面积占全国的95%以上,目前是海南省仅此于橡胶的第二大热带经济作物[6],也是海南省政府重点发展的“三棵树”（橡胶、槟榔、椰子）之一。
海南省万宁市是著名的“中国槟榔之乡”“国家槟榔示范基地”,素有“海南槟榔半万宁”之称,种植面积约占海南省的四分之一。但近些年来,槟榔病虫害问题日趋严重,黄化现象对万宁槟榔产业造成了严重威胁,让广大种植户恐惧、甚至“谈黄色变”。其中槟榔黄化病（yellow leaf disease, YLD）是目前严重影响槟榔生长和产量的一种传染性病害[7,8],病害症状主要表现为初期时中间和下层的叶片开始逐渐变为与绿色部分具有明显界限的黄色,然后开始往上蔓延,最终使得整个植株的叶片变黄、叶片变得硬而短又脆,心叶变小,并且部分出现畸形,最终导致果实和叶片的脱落而死亡[9]。我国海南槟榔黄化病最早发现于1981年海南省的屯昌县境内的槟榔种植园,面积仅6.67 hm2[10],之后随着槟榔种植面积的扩大,槟榔黄化病也随着种植地区而开始蔓延,逐渐引起了人们的重视,罗大全等[11,12,13]通过巢式PCR和电镜技术鉴定出槟榔黄化病由植原体引起。2015年Yu等[14,15]等在槟榔黄化叶片中通过RNAseq发现了槟榔长线形病毒（Areca palm velarisvirus 1, APV1）,并报道了其全长基因组。2020年,Wang等[16]通过对海南省部分市（县）槟榔黄化叶片进行病原检测,确定APV1是槟榔黄化现象的病害因子之一,并在槟榔园中发生流行。为进一步摸清APV1在万宁市槟榔黄化病园的发生情况,本研究团队以万宁为切入点,首次对万宁13个乡镇（区）的槟榔黄化病园的APV1进行检测鉴定,同时对感染APV1的槟榔叶片症状进行了分类统计,摸清由APV1引起的槟榔黄叶病毒病的发生情况,可为该病害的田间诊断和科学防控奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 采样材料 15 m勾刀、采样袋、大塑料袋、枝剪、记号笔、中性笔、纸巾、写字板、草帽、酒精、蚊香。
1.1.2 主要试剂与仪器 主要试剂：RNAprep Pure多酚多糖植物总RNA提取试剂盒（DP441）、反转录cDNA第一链合成试剂盒（MR05101M）、2×Taq PCR mix购于天根生化科技（北京）有限公司。主要仪器：Bio-Rad T100 PCR仪器、干式恒温器（DTH-100）、凝胶电泳仪,高速低温组织研磨仪（KZ-III-F）,全球定位系统（GPS）。
1.2 方法
1.2.1 采样方法 采用随机法[17],对万宁市兴隆区、南桥镇、三更罗镇、万城镇、后安镇、和乐镇、龙滚镇、长丰镇、北大镇等13个乡镇（区）,共计149个村委会（农场）的黄化病园疑似样品进行采样。使用酒精擦拭后的勾刀取发病园槟榔叶片1~2个裂叶,放于自封袋内,标记时间、地点、编号,并做GPS记录,当天采样当天送回,用于室内病毒病检测。
1.2.2 样品处理 剪取槟榔黄化叶片样品,称取0.1 g,大小为2 mm×5 mm的若干小块,于无酶无菌处理的1.5 mL离心管中,每管放3粒直径3 mm的无酶无菌钢珠,做好标记,按顺序置于24孔或48孔研磨钢槽中,迅速置于-80 ℃冰箱冻存备用。
1.2.3 RNA提取及反转录cDNA合成 利用RNAprep Pure多酚多糖植物总RNA提取试剂盒,参照说明书,提取样品总RNA,并利用反转录cDNA第一链合成试剂盒,将提取的总RNA进行反转录,获得cDNA,-20 ℃保存备用。
表1 本研究中所用引物信息Tab. 1 Information of primers used in this study |
| 引物名称 Primer Name | 序列（5′-3′） Sequence (5′-3′) | 片段长度 Fragment size/bp | 退火温度 Tm/℃ |
|---|---|---|---|
| YLDV1-F | TCTTATCTGACGAAGCGGTACA | 371 | 46 |
| YLDV1-R | TAGAGATTCTTCTCGACTCA | ||
| YLDV2-F | GATCTGTGAATATATCAGAACA | 311 | 55 |
| YLDV2-R | CACCCTTGGTATCAACAATAGA | ||
| YLDV3-F | CACAAGAATATCGCGCCATTCT | 457 | 50 |
| YLDV3-R | GATGTATTGACAAGTGGGTCT | ||
| YLDV4-F | ATCTGGACCGAGTAATGGGA | 500 | 55 |
| YLDV4-R | TCATTGTGATACACATACAAGT | ||
| YLDV5-F | AACTAAGATGTGGGCTAATGCA | 520 | 50 |
| YLDV5-R | TAGTTCTGTTGTGATAGCTACCT |
1.2.5 APV1检出率统计及黄化症状归类 将1.2.1和1.2.2采集和处理的槟榔叶片样品,进行APV1检测。按下列公式计算病毒检出率：R= n/N×100%。式中,R为病毒检出率,n为阳性样品数,N为检测样品总数。
对采集的样品,在剪取之前,根据采样时间、地点和编号进行拍照留底,再将检出阳性的样品对照编号进行症状区分和归类整理,总结出检测到APV1的槟榔叶片症状类型。
2 结果与分析
2.1 对引物进行扩增效率分析
如图1所示,泳道“24”“48”阴性对照无污染,比较各引物对的扩增效率,其中较好的为YLDV2-F/YLDV2-R和YLDV4-F/YLDV4-R,扩增效率最差的为YLDV1-F/YLDV1-R和YLDV5- F/YLDV5-R,其次是YLDV3-F/YLDV3-R。由图中显示,泳道“23”中,仅YLDV5-F/YLDV5-R扩出,说明5对引物扩增效率表现出一定的差异。对YLDV5-F/YLDV5-R扩出的泳道“23”中样品和5对引物中随机选择4个带有目的条带的样品送测序,将测序结果在NCBI中BLASTn比对,比对结果显示,检测样品均为APV1。由于YLDV4-F/YLDV4-R长度为500 bp,扩增片段比YLDV2-F/YLDV2-R长,表现更多的遗传信息和扩增效率,因此优先使用YLDV4-F/YLDV4-R作为应用引物,对未扩增出的样品使用YLDV2- F/YLDV2-R和YLDV5-F/YLDV5-R检测。
2.2 病毒检出率统计
本次调查共采集成龄槟榔叶片样品1454份（每株树采集1份样品）、槟榔苗圃叶片140份。样品的检测结果统计见表2,其中兴隆区、长丰镇、东奥镇共264份样品,APV1检出率为100.00%;南桥镇、礼纪镇、三更罗镇共351份槟榔叶片,APV1平均检出率为96.04%;其余镇的病毒检出率均在80%以上,和乐镇最低,60份样品的检出率为75%,其次是山根镇,检出率为78.79%;1454份槟榔叶片样品中,共检出病毒样品1297份,检出率为89.20%（表2）。通过对万宁各乡镇APV1检出率的统计,更直观展现APV1在万宁槟榔上的发生危害情况（图2）。此次调研中,也对万宁部分槟榔苗圃进行了病毒检测,共检测了1龄苗、2龄苗共28份,有17份带毒,检出率达60%。
表2 万宁市各乡镇/区APV1病毒检出率Tab. 2 Detection rate of APV1 in all towns, Wanning |
| 镇/区 Towns/region | 槟榔叶片症状类型 Sample symptom types of arecnut leaves | APV1检出率 APV1 detection rate/% |
|---|---|---|
| 兴隆区 | 不均一黄化;黄绿相间;斑驳黄化;叶肉与叶脉黄化;叶脉黄化;皱缩黄化;槟榔叶尖黄化;带有真菌病斑的黄化 | 100.00 |
| 南桥镇 | 橙红色黄化;水渍状暗绿点黄化;槟榔叶尖黄化;不均一黄化;黄绿相间 | 94.74 |
| 三更罗镇 | 不均一黄化;皱缩黄化;叶脉两侧不规则褪绿,似橡皮擦过状;黄绿相间 | 95.20 |
| 万城镇 | 带有真菌病斑的黄化;不均一黄化;槟榔叶尖黄化;黄绿相间;斑驳黄化;叶脉两侧不规则褪绿 | 92.86 |
| 后安镇 | 槟榔叶尖黄化;叶肉与叶脉黄化;斑驳黄化;不均一黄化;黄绿相间 | 81.00 |
| 和乐镇 | 斑驳黄化;槟榔叶尖黄化;不均一黄化;皱缩黄化;黄绿相间;叶脉两侧不规则褪绿 | 75.00 |
| 龙滚镇 | 槟榔叶尖黄化;水渍状暗绿点黄化;不均一黄化;带有真菌病斑的黄化,叶脉黄化 | 81.90 |
| 长丰镇 | 黄绿相间;不均一黄化;皱缩黄化;叶脉两侧不规则褪绿,似橡皮擦过状 | 100.00 |
| 北大镇 | 叶肉与叶脉黄化;槟榔叶尖黄化;不均一黄化;黄绿相间;斑驳黄化;叶脉黄化 | 84.21 |
| 礼纪镇 | 黄绿相间;槟榔叶尖黄化;斑驳黄化;不均一黄化;带有真菌病斑的黄化 | 98.47 |
| 东奥镇 | 橙红色黄化;斑驳黄化;叶肉与叶脉黄化;槟榔叶尖黄化;不均一黄化;黄绿相间 | 100.00 |
| 山根镇 | 叶脉两侧不规则褪绿,似橡皮擦过状;槟榔叶尖黄化;均一黄化;黄绿相间;水渍状暗绿小点黄化 | 78.79 |
| 大茂镇 | 带有真菌病斑的黄化、斑驳黄化,不均一黄化、黄绿相间;水渍状暗绿点黄化 | 84.62 |
| 合计 | 1297/1454 | 89.20 |
2.3 APV1的槟榔叶片症状
3 讨论
槟榔黄化病是严重威胁槟榔产业健康发展的一种传染性病害[18]。槟榔黄化病逐年加重,轻者减产10%~20%,重者减产50%~60%,局部地区造成毁种失收,给海南槟榔种植户带来了巨大的经济损失,严重影响海南农村经济的发展。一些学者[9,10,11,12,13]通过巢式PCR、电镜技术检测鉴定认为槟榔黄化病主要由植原体引起。虽然相对于植原体引起的黄化而言,APV1是新发现的病原,但也有学者发现该病毒与槟榔黄化病的发生与流行密切相关[16],本调查研究结果与其观点一致;本调研结果同时表明万宁市槟榔黄叶病毒病危害严重,发生率高、发生面积广,遍及万宁各乡镇（区）,在所有的病原采集点都能检测到APV1。本文在黄化病园采集的13个乡镇（区）共1454份黄化类型叶片中,APV1检出率最高达100%,最低也有75%,平均检出率为89.2%,这些数据表明,APV1可能是引起槟榔黄化的主要病毒之一。但依然需要完成柯赫氏法则来进一步证实这一论断,因病毒很难体外活体培养,难以进行遗传操作,且APV1传播媒介饲养条件不完善,可通过构建侵染性克隆的方法进行验证和开展相关功能基因的研究[19,20,21]。
至于该病毒何时开始在海南省槟榔上发生,发生之后如何传播扩散,发生扩散期间是否发生适应性进化?这些重要科学问题目前均未得到解析。本文在槟榔苗圃中也检测到带有该病毒,可见槟榔苗期就可以携带APV1,很可能在生长至一定结果年限,才影响了槟榔长势和产量及外在表现,也可能在结果期染病,从小苗带毒到影响结果需要多长时间,还需要进一步研究验证。总之,APV1的研究仍处于初始阶段,其传播媒介不清楚,传播机理尚不明确,发生规律也无相关报道。众所周知,大约80%的植物病毒依赖昆虫介体进行传播[22,23]。虫媒病害的发生与流行和介体昆虫的活动密不可分,“病毒-昆虫-植物”三者互作决定了病虫害的流行发生和严重程度[24]。由昆虫传播的植物病毒病每年造成的作物损失达几十亿美元,其中飞虱、蚜虫、木虱、粉虱、叶蝉、蜡禅和蓟马等昆虫是植物病毒病的主要传播介体[25],因此,切断昆虫介体传播途径,是控制植物病毒病最行之有效的方法;其次是种植健康槟榔苗,检测到长线形病毒的槟榔苗圃,应谨慎销售,随着科技的蓬勃发展,槟榔脱毒苗有望占领市场;槟榔种果是否带毒,目前尚无报道,还处于研究阶段,但是仍应该选择健康槟榔园制种,并建立隔离苗圃,以绝后患。
因为APV1是新发现的引起槟榔黄化的病原,有必要摸清其危害症状。本文检测观察发现,该病毒病的症状并不单一,即出现了同一病毒引起不同症状的现象,除与报道的植原体病害症状[11, 15]有相似之处外,也有其他症状,比如槟榔叶尖黄化、主脉及叶肉黄化、叶脉黄化、水渍状暗绿点黄化、叶脉两侧不规则褪绿似橡皮擦过状等。说明病毒病症状的复杂性,病毒与症状之间的相互关联并不是绝对的,症状可以改变,而且很大程度上取决于寄主植物及感病时间的长短、病毒种类和环境条件等[26]。而且病毒症状的发展有个过程,有些植物病毒侵染植物后,前期症状和后期症状可能完全相同,也可能完全不同,且整个发展过程没有明显的界限。例如烟草花叶病毒（TMV）感染的普通烟,最初叶片出现明脉症,一两天后很快发展成斑驳症,再过几天就发展成典型的花叶症,花叶症又可从轻花叶发展成重花叶[27]。6种检测到APV1的叶片症状中,在健康的2龄槟榔园发现有斑驳似西瓜皮样症状,但没有检测到APV1,说明这种症状叶片本身不携带该病毒,此种症状可能是缺素或者其他病因引起;而在成龄发病槟榔园里的斑驳黄化能检测到APV1,说明斑驳是在APV1侵染之前就存在,只是因APV1侵染,叶片变得发黄。而且在槟榔黄化园里,有些健康叶片中也检测到了APV1,说明该病毒具有隐症属性。然而由APV1引起的槟榔叶片症状是如何发展变化的,还需要进一步深入研究。
本文首次报道了海南万宁由APV1引起的槟榔黄叶病毒病的发生情况和症状识别,明确了万宁APV1的发生危害现状。后续将从时间和空间尺度上对APV1的发生和流行等重要进程进行量化分析,推断APV1的最近共祖时间及起源点,并探明非生物的地理因素对该病毒适应性进化的影响,进一步阐明APV1的分子流行规律,为制定其防控策略、阻断该病毒的流行提供理论依据,也可为其他病毒病原的相关研究提供重要的参考。
责任编辑：谢龙莲