番木瓜（Carica Papaya L.）,番木瓜科番木瓜属,是热带与亚热带地区广泛种植的水果之一[1]。番木瓜营养丰富,经济价值高,但由于番木瓜是呼吸跃变型果实,采后易失水和软化,导致番木瓜采后不耐贮运、商品价值下降,限制了番木瓜产业持续健康发展。因而,延缓番木瓜采后品质劣变,提升番木瓜商品价值是该产业亟待解决的问题。目前,番木瓜采后常采用涂膜、气调和传统化学药剂等保鲜方法。但这些方法存在投资大和药剂残留等问题[2]。而热处理和精油熏蒸处理具有绿色、安全无毒、无残留、设备及操作方法简单等优点,愈发受到国内外研究者的关注。热处理是指将果蔬短时间内置于不致损伤的高温环境中,使其发生高温胁迫作用,从而提升抗逆境能力,以达到保鲜目的的采后保鲜方法[3]。已有大量文献报道了热处理用于果蔬保鲜中的良好效果,如香蕉[4]、猕猴桃[5]、杨梅[6]和蓝莓[7]等。精油处理在果蔬防腐保鲜方面应用潜力大、前景好,植物精油对草莓[8]、冬枣[9]、柑橘[10]等具有较好的保鲜效果。香茅精油是香茅体内的重要次生代谢产物,具有抑菌和果蔬保鲜等多方面的作用,在果蔬采后保鲜方面具有较好的应用前景。香茅精油在一定程度上可显著控制多种果蔬采后主要致病腐败菌的生长,有望替代化学合成抗菌剂用于果蔬的采后保鲜。例如,Regnier等[11]报道了香茅精油对柑橘酸腐致病菌的抑制作用,结果表明5 μL香茅精油挥发熏蒸处理4 d后能100%抑制该致病菌菌丝体生长;Maqbool等[12]报道了0.05%香茅精油对香蕉和番木瓜致病菌的体外抑制率达到73.4%和71.3%,在体内实验中,10%阿拉伯胶和0.05%香茅精油复合溶液处理后的果实发病率明显低于对照。
热处理作为近年来的保鲜研究热点,同其他技术结合处理得到广泛应用,但是热处理复合香茅精油熏蒸处理在番木瓜采后保鲜中的应用还未见详细报道。本研究以‘美中红’番木瓜为试材,研究了热处理复合香茅精油熏蒸处理对番木瓜采后保鲜效果以及软化相关酶活性的变化规律,以期为番木瓜采后贮藏保鲜和产业发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 ‘美中红’番木瓜,广东省湛江市遂溪县金龟岭农场。
香茅精油（≥99%）,研邦化工科技有限公司;草酸（分析纯）,天津福晨化学试剂厂;抗坏血酸（分析纯）,上海蓝季科技发展有限公司;2,6-二氯酚靛酚（分析纯）,美国Sigma-Aldrich公司;多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性测定试剂盒、纤维素酶（CL）活性测定试剂盒、β-半乳糖苷酶（β-GAL）试剂盒和果胶酯酶（PE）试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司。
1.1.2 仪器与设备 SOP型电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;FHM-5硬度计,北京亿事达科技有限公司;PAL-BX/ACID9便携式数显糖酸一体折光仪,日本爱拓有限公司;FWS-26型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;ZRD-A5210型烘箱,上海智城分析仪器制造有限公司;UV-2700紫外-可见分光光度计,日本岛津公司;Envolution RC型超速离心机,美国Thermo Fisher公司。WITT OXYBABY M+ O2/CO2测定仪,上海众林机电设备有限公司;TS7700便携式色差计,深圳三恩时科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验处理 对番木瓜的保鲜实验,前期筛选了45、48、50、55、60 ℃热水处理5 min和7.5、15、30 μL/L精油熏蒸处理72 h,确定48 ℃热处理5 min和15 μL/L精油处理72 h为最适宜的处理条件。挑选无病虫害、大小相对一致、无机械损伤、成熟度为2~3线黄的果实,用清水洗净后晾干待用。
将果实随机分为4组,作如下处理：处理1：对照组,不处理;处理2：将果实置于48 ℃热水中浸泡处理5 min,取出后晾干;处理3：将果实置于香茅精油浓度为15 μL/L的密闭容器中,常温25 ℃下熏蒸处理72 h;处理4：先将果实置于48 ℃热水中浸泡处理5 min,晾干后转入香茅精油浓度为15 μL/L的密闭容器中,常温25 ℃下熏蒸处理72 h。
处理后,将每组果实分别装入0.02 mm厚的PE保鲜袋中,轻封袋口,25 ℃下贮藏。每2 d取样并测定相关指标,直至对照组果实成熟腐烂为止,共取样6次,取样部位为果实赤道圈的果皮以下1 cm果肉。每组处理15个果,重复3次。
1.2.2 品质指标测定方法 病情指数参考陈文等[13]的方法,将番木瓜果实炭疽病发病程度分为9个等级。0级：果实无病;1级：直径0.5 cm以下的分散零星小病斑不超过20个;2级：直径0.5 cm以下的小病斑在20个以上,或有一个病斑直径在1.0~1.5 cm;3级：最大病斑或病斑连成片直径在1.5~3 cm 间,病斑总面积不超过1/16果面积;4级：最大病斑直径3 cm以上,全果病斑面积不超过1/8果面面积;5级：1/8-1/4果面腐烂;6级：1/4~1/2果面腐烂;7级：1/2~2/3果面腐烂;8级：全果腐烂。番木瓜果实病情指数按公式（1）计算,处理后的防治效果按公式（2）计算。
$病情指数==\sum{\frac{(病害级别\times该级别果数)}{(病情最高级别\times 总果数)}}\times 100$
$防治效果=\frac{(对照果病情指数-处理果病情指数)}{(对照果病情指数)}\times 100\%$
失重率采用称重法测定,分别测定待测番木瓜贮藏前质量（M1,g）与测定当天质量（M2,g）。失重率按公式（3）计算：
$失重率=\frac{M_{1}-M_{2}}{M_{1}}\times 100%$
硬度的测定采用手持式硬度计,探头直径为 5 mm,每个待测果实在其赤道上选3个点,去皮后进行硬度测量,3次重复后的平均值为该处理的硬度（kg/cm2）[14]。
颜色采用色差计测定,每处理组随机选取3个番木瓜,每个果实赤道圈上选取3个点测定果皮上的a*、b*值。a*值从负值到正值,表示从绿转红。b*值从负值到正值,表示从蓝转黄[15]。
可溶性固形物（TSS）利用数字手持折光仪测定。
可滴定酸（TA）采用酸碱中和滴定法[13]测定,用体积分数1%酚酞做指示剂,以苹果酸质量进行折算,折算系数为0.067。
维生素C（Vc）含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[16]测定,称取2 g研磨后的番木瓜果肉待测样,用20 mg/mL草酸溶液浸提10 min,在8 000 ×g、25 ℃离心10 min后取上清液用于测定。
呼吸速率采用便携式O2/CO2测定仪测定[17]。
1.2.3 果肉中细胞壁降解酶的测定方法 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性采用PG试剂盒测定,称取0.3 g研磨后果肉粉末,加入3 mL提取液,16 000 ×g、4 ℃离心10 min后取上清液进行测定。以每克样本每小时分解果胶酸产生1 mg半乳糖醛酸为1个酶活力单位U,结果以U/g表示。
纤维素酶（CL）活性采用CL试剂盒测定,测定原理为利用蒽酮比色法测定CL催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。称取0.3 g研磨后果肉粉末,加入3 mL提取液,8000 ×g、4 ℃离心10 min后取上清液进行测定。以每克组织每小时催化产生1 mg葡萄糖定义为1个酶活力单位U,结果以U/g表示。
β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性使用β-GAL试剂盒测定,称取0.3 g研磨后果肉粉末,加入3 mL提取液,15 000 ×g、4 ℃离心10 min后取上清液进行测定。以每克组织每小时产生1 μmol对硝基苯酚定义为1个酶活力单位U,结果以U/g表示。
果胶酯酶（PE）采用PE试剂盒测定,称取3 g研磨后果肉粉末,加入6 mL提取液,12 000×g、 4 ℃离心15 min后取上清液进行测定。以每克组织每小时消耗1 μmol NaOH定义为1个酶活单位U,结果以U/g 表示。
1.3 数据处理
采用 Excel 2010软件整理数据并制图;采用SPSS 22.0软件,利用ANOVA进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 热处理复合香茅精油处理对番木瓜采后炭疽病病情指数的影响
图1可以看出,对照组和热处理组番木瓜果实在贮藏5 d时先开始发病,在5 d和7 d时,两者差异不显著。在贮藏9 d和11 d时,热处理组果实病情指数显著低于对照组,分别为15和33.7,防治效果分别为23.9%和32.58%。精油处理组从7 d开始发病后的病情指数分别为2.5、12.5和22.5,防治效果分别为50.67%、36.57%和55.06%。复合处理组从贮藏9 d时开始发病后,病情指数分别为3.7和8.4,防治效果分别为81%和83.2%。在贮藏9 d和11 d时,各处理组果实的病情指数显著低于对照组,且复合处理组防治效果最好。
2.2 热处理复合香茅精油处理对番木瓜失重率、硬度和颜色的影响
由图2A可知,番木瓜果实失重率随着贮藏时间延长而逐渐增大。整个贮藏期间,对照组的失重率与热处理组差异不显著,而与精油处理组和复合处理组之间差异显著。精油处理组和复合处理组的失重率差异不显著,并且在贮藏5 d时分别比对照组失重率降低了44.67%、41.49%。
由图2B可知,在整个贮藏期间,所有处理组的番木瓜果实硬度呈下降趋势,而精油处理组和复合处理组显著延缓了果实硬度的下降。在贮藏7 d时,对照组和热处理组的硬度分别下降到0.33、0.39 kg/cm2,之后硬度趋于稳定;在贮藏9 d时,精油处理组和复合处理组的果实硬度分别下降到0.61、0.95 kg/cm2。在贮藏中后期（7~11 d）,精油处理组和复合处理组果实硬度与对照组和热处理组之间差异显著,说明香茅精油处理可显著延缓果实硬度的下降,热处理对果实硬度没有显著影响,但热处理可协同精油处理对延缓番木瓜果实硬度下降起增效作用。
2.3 热处理复合香茅精油处理对番木瓜TSS、TA、固酸比和Vc含量的影响
由图3A可知,在整个贮藏期间,番木瓜果实可溶性固形物均呈先上升后下降趋势,所有处理组均在一定程度上延缓了番木瓜可溶性固形物的下降,而复合处理的延缓效果更好。尤其在贮藏7、9、11 d时,对照组的可溶性固形物含量分别为14.8%、14.6%和14.3%,而复合处理组分别为17.4%、17.2%和16.4%,分别比对照组高17.6%、17.8%和14.7%。
由图3B可知,番木瓜果实的可滴定酸质量分数在贮藏期间呈逐渐下降趋势。在贮藏中后期（5 d后）,对照组果实的可滴定酸质量分数从0.61%下降到0.54%,而复合处理组果实的可滴定酸质量分数从0.56%下降到0.43%,显著加快了番木瓜果实可滴定酸质量分数的下降。
由图3C可知,在整个贮藏期间,热处理组、精油处理组和复合处理组果实固酸比整体上呈逐渐上升趋势,而对照组呈先上升后下降趋势。对照组果实固酸比从贮藏3 d时的34下降为贮藏11 d时的26.5,而热处理组、精油处理组和复合处理组分别从33.3、24.8和27.7上升到41.4、35.9和38.1。因而在贮藏中后期,所有处理组均显著提高了果实固酸比。
由图3D可知,在整个贮藏期间,番木瓜果实的Vc含量呈先上升后下降趋势。在贮藏9 d时,热处理组和精油处理组果实Vc含量分别达到峰值51.6 mg/100 g和51.9 mg/100 g。在贮藏7 d时,对照组和复合处理组果实Vc含量分别达到峰值51.3 mg/100g和55.7 mg/100 g,且在贮藏7、9、11 d时,复合处理组的Vc含量分别比对照高8.45%、10.57%和11.42%,二者之间差异显著。
2.4 热处理复合香茅精油处理对番木瓜呼吸速率的影响
由图4可知,对照组和复合处理组番木瓜果实的呼吸速率均呈先上升后下降趋势,复合处理显著抑制果实的呼吸速率的上升,并延迟了果实呼吸峰值的出现。对照组果实呼吸速率在贮藏7 d时达到峰值849.2 mL/(kg·h),而此时复合处理组为412.9 mL/(kg·h),是对照组的48.6%。复合处理组果实的呼吸速率9 d时达到峰值707.9 mL/(kg·h)。
2.5 热处理复合香茅精油处理对番木瓜果实软化相关酶活性的影响
由图5A可知,对照组和复合处理组的番木瓜果实在贮藏期间,PG酶活性整体上呈逐渐上升趋势,从贮前的11.54 U/g分别上升到45.84 U/g和42.54 U/g,增幅分297%和268.4%。复合处理组的PG酶活性在果实贮藏期间始终低于对照组,且在贮藏第5 d和9 d时,复合处理组的PG酶活性分别比对照组低24.03%和26.39%,二者之间差异达显著水平。
由图5B可知,在采后贮藏期间,番木瓜果实中PE酶活性均呈先上升后下降趋势,对照组果实PE酶活性在贮藏7 d时达到峰值104.2 U/g,而复合处理组在贮藏9 d时达到峰值101.6 U/g。尤其在贮藏 3、5、7 d 时,对照组果实中PE酶活性分别为92.4、95、104.2 U/g,而复合处理组分别为85.8、84.8、88.6 U/g,复合处理显著高于对照。
由图5C可知, 番木瓜果实中CL酶活性随着贮藏期的延长均呈逐渐上升趋势,而复合处理对果实CL酶活性影响不大。在整个贮藏期间,复合处理果实CL酶活性与对照组差异不显著,对照组和复合处理组从66.7 U/g分别达到115.8、115.6 U/g。
由图5D可知,对照组和复合处理组的β-GAL酶活性在整个贮藏期间均呈上升趋势,从贮前4.4 U/g分别上升到11.5 U/g、10.6 U/g,增幅分别为162.56%和144.85%。在贮藏5、7、9、11 d时,复合处理组的β-GAL酶活性分别比对照组低12.78%、4.38%、10.98%和6.75%,二者之间差异显著。
3 讨论
热处理作为传统的果蔬保鲜手段,近年来热处理和其他技术结合应用成为研究热点。如贾文君等[18]和谢芳等[19]分别研究了 1-MCP结合热处理对台农芒果和番木瓜采后贮藏品质的影响,结果表明复合处理能更好提高果实的耐贮性,尤其在延缓果实硬度下降和颜色转变等方面有很好的保鲜效果。而精油处理因杀菌性强且绿色、安全无毒、设备方法简单,而愈发受到国内外研究者的关注。热处理和精油处理都可显著抑制多种病原菌生长,诱导果实防御系统,提高抗病性,降低果实病情指数。陈会珍[20]研究了热水处理（45 ℃,10 min）对猕猴桃的影响,发现可显著降低果实病情指数,并提高多种抗病相关酶活性,诱导了防御系统,提高果实抗病性;纪淑娟等[21]研究了香茅精油对炭疽菌、蒂腐菌等多种果蔬采后病原菌的抑制效果,发现可显著抑制多种病菌的菌丝生长和产孢;陈倩茹[22]研究发现香茅精油可显著抑制樱桃番茄黑腐病和灰霉病的发病率。本研究结果表明,热处理和精油处理都可显著降低番木瓜果实的病情指数,而复合处理的抑制效果更为显著。
可溶性固形物、可滴定酸的含量以及固酸比是衡量果实保鲜效果的重要指标,可以反映果实中营养物质的消耗速度和程度[23]。在番木瓜果实的贮藏过程中,可溶性固形物的含量先上升后下降,可能原因是果实后熟过程中,淀粉等大分子物质分解成小分子可溶性物质,导致果肉中可溶性固形物含量上升。而后,果实中小分子可溶性物质的代谢速率开始大于大分子物质的降解速率,导致可溶性固形物含量开始下降[24]。本研究也得出同样的结论,番木瓜果实中可溶性固形物呈先上升后下降趋势,而复合处理显著延缓了可溶性固形物的下降。果实采后可滴定酸含量逐渐下降,可能原因是果实后熟过程中,一部分有机酸用于呼吸作用,另一部分转化为糖分[25]。本研究结果表明,复合处理显著促进了果实贮藏中后期可滴定酸含量的下降,但综合来看显著提高了果实的固酸比,有利于果实风味品质的保持。果实中Vc含量不仅是衡量营养品质高低的指标,而且与果实抗氧化密切相关。Vc含量过低,会导致果实中自由基积累,从而促进果实成熟衰老[25]。在本实验番木瓜果实的整个贮藏过程中,复合处理有效提高Vc含量,保持了果实的营养品质,并延缓了果实衰老进程。
硬度是果实成熟软化的重要而直观参数,在果实贮藏过程中,硬度会逐渐变小,导致果实软化,果实软化后营养物质快速流失且极易受到微生物侵染,导致果实不耐贮运和抗病性下降[26]。Maqbool等[12]研究发现肉桂精油和香茅精油可显著延缓香蕉和番木瓜果实硬度的下降,显著推迟了果实的成熟;而热处理对赣南脐橙[27]、猕猴桃[20]和无核白鸡心葡萄[28]等果实的硬度没有影响,这与本研究结果一致,但热处理可协同精油处理对延缓番木瓜果实硬度下降起增效作用。这可能是由于热处理促进果皮对于精油的吸收,使精油更好作用于果实。番木瓜是典型的呼吸跃变型果实,跃变型果实的呼吸速率和呼吸高峰与果实软化和成熟衰老进程关系密切。本研究结果表明,复合处理可显著减缓果实的呼吸速率并延迟呼吸峰值的出现。有研究表明果实成熟过程中硬度下降的快慢与果实的呼吸速率、细胞壁降解酶关系密切,如胡留申等[29]研究了硬肉桃品种中川中岛白桃和双久红桃成熟过程中呼吸速率和细胞壁降解酶活性及其硬度的关系,发现果实硬度与呼吸速率呈显著相关,与PG酶和CX酶活性呈极显著相,而与PE酶活性则不具有显著相关性。在本实验中,将硬度的变化趋势结合呼吸速率和PE酶活性的变化可以发现,番木瓜果实成熟过程中硬度下降的快慢与呼吸速率和PE酶活性的高低有较高的相关性,并且呼吸速率和PE酶活性的高峰与果实硬度的最低点相对应。
软化是果实成熟的重要特征。国内外大量研究报道表明,与软化相关的酶类较多,起主要作用的有PG酶、PE酶、CL酶、β-GAL酶等。PG 酶可以催化果胶分子中D-半乳糖苷键的断裂,生成半乳糖醛酸,从而改变细胞壁结构,导致果实软化。而PE则一般被认为其主要作用是去除果胶分子上半乳糖醛酸羧基上的酯化基团,增加果胶在水中的溶解度,从而为PG酶作用提供更适宜的条件[30]。Ross等[31]认为PG是‘皇家嘎啦’苹果果实软化的关键酶;而魏建梅[32]研究了苹果果实采后软化机制,发现PG酶和PE酶在果实软化过程中起主要作用,且PE酶的作用强于PG酶。本研究结果发现,复合处理可显著降低PG酶、PE酶活性,并延迟了PE酶峰值的出现。CL酶对羧甲基纤维素、木葡聚糖和具有葡聚糖结构的物质表现活性,可作用于细胞壁的解体,从而导致果实软化[30]。CL酶在不同果实的软化中作用不同,如薛炳烨等[33]研究纤维素酶是甜樱桃和梅成熟软化中后期的主要作用酶,并且是‘肥城桃’果实硬度下降的启动因子。而石海燕等[34]研究芒果中的纤维素酶活性与果实硬度呈显著负相关。本研究结果表明,复合处理对番木瓜果实中CL酶活性没有显著影响,因而可推测CL酶不是番木瓜果实软化的主导酶。β-GAL酶可改变细胞壁的一些组分的稳定性,并通过降解具支链的多聚醛酸,从而使果胶降解或溶解[30]。赵胜锦[35]研究了在中国樱桃成熟过程中软化相关酶的变化,发现成熟早期中β-GAL酶极低,且其活性高峰迟于PG,推测β-GAL与PG同为中国樱桃软化的主导酶等。本研究中,复合处理可显著降低番木瓜果实中β-GAL酶活性,且其变化趋势与PG酶相似。
总之,热处理复合香茅精油处理对番木瓜果实有较好的保鲜效果,可明显降低番木瓜果实的病情指数和失重率,延缓果实硬度下降和颜色的转黄,提高果实中的TSS和Vc含量和果实固酸比,降低果实呼吸速率。复合处理可延缓番木瓜果实硬度的下降,其一是由于降低了果实呼吸速率,其二是降低果实软化相关酶PG酶、PE酶和β-GAL酶活性。