木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界三大薯类之一,是重要的粮食作物、工业原料和生物质能源,也是我国热区重要的经济作物[1],并作为“先锋作物”在服务国家“一带一路”倡议中作出突出贡献[2]。木瓜秀粉蚧（Paracoccus marginatus Williams and Granara de Willink）是一种世界检疫性害虫[3],主要以若虫和雌成虫刺吸植物汁液,造成绿叶变黄,卷曲,掉落,严重为害时可导致植株死亡[4,5]。当前木瓜秀粉蚧在我国木薯主栽区的发生为害日趋严重[6],对当地木薯产业的持续健康发展构成严重威胁[7]。因此,寻求经济有效的木瓜秀粉蚧防控措施已成为当前木薯产业发展中亟待解决的重要课题。
植物次生代谢物质不仅可以直接趋避、抑制害虫取食,还可减少害虫产卵和引诱天敌等[8,9],在植物防御害虫中发挥重要作用。酚类、丙二醛和单宁是在作物抗虫性研究中涉及较多的三类次生代谢物。酚类物质在植物中起到抗氧化的作用[10,11],并且在高浓度的情况下可以抑制害虫取食或致其死亡,从而提高植物抗虫水平。丙二醛是植物细胞膜发生膜脂过氧化的重要指标物质之一,能与细胞内的组分发生反应而引起膜结构的严重损伤[12,13]。单宁又称原花青素,能够直接抑制害虫中肠消化酶活性,干扰其正常取食,并对害虫的生长发育与繁殖有显著的抑制作用[14]。而目前尚无次生代谢物质在木薯抗虫中的作用的相关报道。因此,本研究拟通过测定分析木瓜秀粉蚧为害前后不同木薯品种叶组织中总酚、丙二醛、单宁的含量差异,以期为从次生代谢物质层面深入探讨木薯抗虫性机理和深度挖掘优异抗虫木薯种质资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试木薯品种 供试感虫木薯品种‘BRA900’‘SC205’‘面包’‘瑞士T7’,抗虫木薯品种‘C1115’‘缅甸种’[15]均由中国热带农业科学院热带品种资源研究所国家木薯种质资源圃提供。
1.1.2 供试木瓜秀粉蚧 供试木瓜秀粉蚧（P. marginatus）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所特色热带作物害虫研究组提供,是室内用感虫木薯品种‘BRA900’继代饲养的实验种群。
1.1.3 供试试剂 用于酚类、丙二醛和单宁含量测定的相关试剂邻苯二酚、无水碳酸钠、Folin试剂、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、单宁、氯化铁等均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 木瓜秀粉蚧接种与木薯叶片取样 选取温室大棚内种植约3个月、长势一致的‘BRA900’‘SC205’‘面包’‘瑞士T7’‘C1115’和‘缅甸’木薯植株,将发育一致的木瓜秀粉蚧雌成虫按30头/叶分别接种于植株中部叶片的背面,并用湿润棉花缠绕叶柄基部以防止粉蚧迁移。分别于木瓜秀粉蚧为害前,为害1、4、8 d后采集叶片用于次生代谢物质含量的测定。每个品种设3盆重复,每个处理时间设3个重复。
1.2.2 木薯叶组织中次生代谢物质含量测定 （1）叶组织中总酚含量测定。参考陈青等[16]的方法,并加以改进。称取0.1 g木薯叶片于研磨器中,加入1 mL 95%乙醇在冰浴中研磨成匀浆状,于4700 r/min离心15 min,取上清液,弃残渣,用95%乙醇定容至2 mL,置于-80 ℃冰箱保存备用。测定时,将样品液稀释10倍,取1 mL样品稀释液于试管中,加入1 mL 0.25 mol/L Folin试剂,摇匀,静置10 min后加入1 mL 10% Na2CO3溶液振荡。静置1 h后用紫外分光光度计测定OD760值,根据标准曲线和样品吸光度计算总酚含量,每处理重复3次。
总酚含量(mg/g)=[OD760×稀释倍数×提取液体积(mL)]/[样品鲜重(g)×106]×103
（2）叶组织中丙二醛含量测定。参考陈青等[16]的方法,并加以改进。称取0.1 g木薯叶片于研磨器中,加入1 mL蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆状,于4700 r/min离心30 min,取上清液,弃残渣,用蒸馏水定容至2 mL,置于-80 ℃冰箱保存备用。测定时,吸取0.4 mL提取液于试管中,加入0.6 mL 含0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液,于沸水浴中加热10 min,迅速冷却,4700 r/min离心20 min。取上清液于532、600、450 nm波长下测定OD值,以蒸馏水为空白对照,重复3次。
丙二醛含量(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)- 0.56×OD450
（3）叶组织中单宁含量测定。参考陈青等[16]的方法,并加以改进。称取0.1 g木薯叶片于研磨器中,加入1 mL蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆状,60 ℃水浴12 h,4700 r/min离心30 min,取上清液,弃残渣,加入0.6 mL蒸馏水,80 ℃水浴20 min,离心取上清液,重复3~5次,直至滤液与FeCl3稀溶液混合不再产生绿色或蓝色为止。最后用蒸馏水定容至4 mL,摇匀为待测液。将待测液稀释4倍后取1 mL加入0.1 mL Folin显色剂,4 mL 5% Na2CO3溶液,静置30 min后用紫外分光光度计测定OD580值。根据标准曲线查找OD值对应的单宁浓度,计算单宁的含量。每处理重复3次。
X=(c×V×D)/m×100%)×103
式中,X为提取液中单宁的含量（mg/g）;c为样品液中单宁的浓度（mg/mL）;V为样品液的定容体积（mL）;D为样品液的稀释倍数;m为样品质量（mg）。
1.3 数据处理
采用Excel 2010软件进行数据整理,利用SPSS软件Duncan’s法对木瓜秀粉蚧为害前后不同木薯品种叶组织中次生代谢物质含量进行多重比较,显著性水平P=0.05。
2 结果与分析
2.1 木瓜秀粉蚧为害前后抗、感木薯品种叶组织中总酚含量差异分析
图1结果表明,木瓜秀粉蚧为害后抗、感木薯品种叶组织中的总酚含量存在显著差异。木瓜秀粉蚧为害1、4、8 d后,感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’和‘瑞士T7’叶组织中的总酚含量与为害前（0 d）相比无显著性差异（P>0.05）,抗虫木薯品种‘缅甸’总酚含量分别较为害前提高了345.2%（1 d）、346.2%（4 d）、345.2%（8 d）,抗虫木薯品种‘C1115’总酚含量分别较为害前提高了328.9%（1 d）、327.1%（4 d）、327.4%（8 d）。在粉蚧为害前抗虫木薯品种总酚含量显著低于感虫木薯品种,而粉蚧为害1、4、8 d后,抗虫木薯品种‘缅甸’和‘C1115’的总酚含量均显著高于感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’‘瑞士T7’。进一步相关性分析表明,木薯对木瓜秀粉蚧的抗性与总酚含量的增加幅度呈显著正相关（R=0.898,P=0.018）。
图1 木瓜秀粉蚧为害前后抗、感木薯品种叶组织中总酚含量不同大写字母表示相同品种不同时间差异显著（P<0.05）,不同小写字母表示相同时间不同品种间差异显著（P<0.05）。 Fig. 1 Total phenol content in leaves of resistant and susceptible cassava cultivars before and after damaged by P. marginatus Different uppercase letters indicate significant difference in the same cultivar at different time (P<0.05), and different lowercase letters indicate significant difference among different varieties at the same time (P<0.05). |
2.2 木瓜秀粉蚧为害前后抗、感木薯品种叶组织中丙二醛含量差异分析
图2结果表明,木瓜秀粉蚧为害后抗、感木薯品种叶组织中的丙二醛（MAD）含量存在显著差异。木瓜秀粉蚧为害1、4、8 d后,感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’和‘瑞士T7’叶组织中丙二醛含量与为害前相比无显著性差异（P>0.05）,抗虫木薯品种‘缅甸’叶片丙二醛含量显著降低至为害前的9.7%（1 d）、9.4%（4 d）、8.3%（8 d）,抗虫木薯品种‘C1115’丙二醛含量显著降低至为害前的54.4%（1 d）、39.1%（4 d）、23.9%（8 d）。粉蚧为害前,抗虫木薯品种丙二醛含量与感虫木薯品种无显著差异,而粉蚧为害后,抗虫木薯品种‘缅甸’和‘C1115’叶片的丙二醛含量均显著低于感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’和‘瑞士T7’。通过相关性分析表明,木薯对木瓜秀粉蚧的抗性与丙二醛含量的降低幅度呈显著负相关（R=-0.813,P=0.027）。
图2 木瓜秀粉蚧为害前后抗、感木薯品种叶组织中丙二醛含量不同大写字母表示相同品种不同时间差异显著（P<0.05）,不同小写字母表示相同时间不同品种间差异显著（P<0.05）。 Fig. 2 MAD content in leaves of resistant and susceptible cassava cultivars before and after damaged by P. marginatus Different uppercase letters indicate significant difference in the same cultivar at different time (P<0.05), and different lowercase letters indicate significant difference among different varieties at the same time (P<0.05). |
2.3 木瓜秀粉蚧为害前后抗、感木薯品种叶组织中单宁含量差异分析
图3结果表明,木瓜秀粉蚧为害后抗、感木薯品种叶组织中单宁含量存在显著差异。木瓜秀粉蚧为害1、4、8 d后,感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’和‘瑞士T7’叶组织中单宁含量与为害前相比显著降低（P<0.05）,而抗虫木薯品种‘缅甸’的单宁含量比为害前提高了141.3%（1 d）、142.5%（4 d）、142.5%（8 d）,抗虫木薯品种‘C1115’的单宁含量比为害前提高了170.9%（1 d）、173.4%（4 d）、174.7%（8 d）。粉蚧为害前抗虫木薯品种的单宁含量显著高于感虫木薯品种,而为害1、4、8 d后,抗虫木薯品种‘缅甸’和‘C1115’的单宁含量均显著高于感虫木薯品种‘BRA900’‘面包’‘SC205’和‘瑞士T7’。通过相关性分析表明,木薯对木瓜秀粉蚧的抗性与单宁含量的增加幅度呈显著正相关（R=0.757,P=0.041）。
图3 木瓜秀粉蚧为害前后抗、感木薯品种叶组织中单宁含量不同大写字母表示相同品种不同时间差异显著（P<0.05）,不同小写字母表示相同时间不同品种间差异显著（P<0.05）。 Fig. 3 Tannin content in leaves of resistant and susceptible cassava cultivars before and after damaged by P. marginatus Different uppercase letters indicate significant difference in the same cultivar at different time (P<0.05), and different lowercase letters indicate significant difference among different varieties at the same time (P<0.05). |
3 讨论
研究表明,较高的酚类物质含量能够有效防御害虫取食。武德功等[22]研究发现不同抗虫水平的苜蓿品种被蚜虫为害后,总酚含量均显著增加,并且蚜虫为害后抗虫苜蓿品种的总酚含量始终高于低抗和感虫品种。李庆等[23]研究发现辣椒被侧多食附线螨为害后,抗性品种叶组织中总酚含量显著增加,而在非抗性品种中则显著下降。张会英[24]通过研究发现,橡胶树种质对六点始叶螨的抗性与叶组织中总酚含量显著正相关。本研究发现木瓜秀粉蚧为害前,抗虫木薯品种的总酚含量略低于感虫木薯品种,而木瓜秀粉蚧为害后抗虫木薯品种总酚含量显著高于感虫品种,并且木薯品种抗虫性与总酚含量的增加幅度呈显著正相关,说明抗虫木薯上总酚介导的防御方式为诱导型防御。
丙二醛是细胞膜脂过氧化的产物,丙二醛含量增加会导致细胞膜、蛋白质和DNA结构的损伤,从而影响细胞的正常功能甚至导致细胞凋亡[25],因此,丙二醛含量可以反映植物抗生物和非生物逆境反应的强弱[26]。黄伟等[27]研究发现抗、感蚜水平不同的苜蓿品种被苜蓿蚜为害后,丙二醛含量均增加,但感蚜品种丙二醛含量的增加幅度明显高于抗蚜品种。梁郸娜等[28]研究发现不同抗蚜水平的黄瓜品种被瓜蚜为害后,抗蚜黄瓜品种的丙二醛含量显著低于感蚜品种。陈青等[16]研究发现西瓜对瓜蚜的抗性与丙二醛含量显著负相关。本研究结果也表明,木瓜秀粉蚧为害前,抗、感虫木薯品种的丙二醛含量并无显著差异,而木瓜秀粉蚧为害后抗虫品种的丙二醛含量显著低于感虫品种,并且木薯叶组织中丙二醛含量的降低幅度与木薯对木瓜秀粉蚧的抗性呈显著负相关,这可能与抗虫木薯对造成机体损伤的丙二醛具有较强的清除能力有关,上述结果也与梁郸娜等[28]、陈青等[16]的研究结果一致。
单宁与植物抗虫性关系密切,是在作物防御害虫取食中发挥直接作用的次生代谢物质[29]。植物单宁能够影响害虫的寄主选择性[23]。庞保平等[30]研究发现,南美斑潜蝇的寄主选择性与蔬菜叶组织中的单宁含量显著正相关,菜豆和茼蒿单宁含量较低,是南美斑潜蝇最喜欢产卵和取食的寄主,而甘蓝和番茄单宁含量高,是其选择性最差的寄主。黄保宏等[31]也研究发现,朝鲜球坚蚧对8种寄主植物的产卵和取食选择性与寄主单宁含量显著正相关。Ropek等[32]发现抗虫蚕豆品种能够有效抵御蚕豆蚜为害与其叶组织中含有较高的单宁含量有关。张会英[24]研究发现,橡胶树种质抗螨性与橡胶叶组织中单宁的含量及其在六点始叶螨为害后的增加幅度显著正相关。孙杨等[33]研究发现,蓟马为害后抗虫芦笋品种的单宁含量均显著高于感虫和高感品种,且呈正相关关系。贾彦霞等[34]研究发现,西花蓟马为害后,抗虫辣椒品种的单宁含量显著增高,表明单宁含量与抗虫性相关。本研究表明,木瓜秀粉蚧为害前,抗虫木薯品种的单宁含量略高于感虫木薯品种,而木瓜秀粉蚧为害后,抗虫木薯的单宁含量显著提高,而感虫木薯的单宁含量则显著降低,并且木薯品种抗虫性与单宁含量的增加幅度显著正相关,说明抗虫木薯上单宁介导的防御方式兼具组成型和诱导型防御的特征。
本研究结果表明,木薯叶片的次生代谢物质,如酚类、丙二醛和单宁在木薯品种对木瓜秀粉蚧的防御反应中发挥重要作用,可为木薯抗虫种质资源的深度挖掘与创新利用提供理论和材料基础。然而,具有抗虫功能的植物次生代谢物质种类繁多,当前三大植物次生代谢物,包括含氮化合物（nitrogen compounds）,如生物碱（alkaloids）[35]和生氰苷（cyanogenic glycosides）等[36];萜类（terpenoids）化合物,如棉酚、姜烯[37,38];酚醛类（phenolics）,如茶多酚、单宁等[39]均已被证实具有体内外的杀虫活性,因此,上述化合物是否也介导了木薯对木瓜秀粉蚧的抗性需进一步挖掘与验证。本研究仅从总酚、丙二醛、单宁与木薯抗虫性的相关性初步探讨了木薯的抗虫机理,并且这3种物质是否为发挥主导抗虫作用的次生代谢物质,以及它们如何发挥抗虫功能、如何影响木瓜秀粉蚧的取食和发育繁殖等均需进一步深入研究。