莲雾（Syzygium samarangense）,又称洋蒲桃,属桃金娘科乔木,是著名的热带水果之一。莲雾全年枝叶繁多,叶片凋落到地面形成较好的有机质来源,丰富了细菌群落的孕育。据不完全统计,自然环境下土壤微生物中的细菌群落可达106~ 109个/g,约占70%以上,由于细菌群落的大量存在,因此在维持土壤微生态中发挥着主要的作用[1,2,3]。细菌群落的多样性和丰富度的增加,不仅有助于维持土壤微生态的稳定性[4,5,6],同时还促进植物对营养元素的吸收。莲雾在进行反季节催花时,为了提升产量和品质,通常以施用有机肥为主。但频繁、过量施用有机肥会破坏土壤细菌群落的平衡[7,8]。因此,为了科学施用有机肥,达到精准施肥、提质增效的目的,开展不同类型有机肥及其施用浓度对莲雾园区土壤细菌群落结构影响的研究具有重要意义。
目前,涉及细菌群落多样性研究的主要方法是传统培养方法与分子技术。由于自然界中超过99%的细菌无法进行人工培养或人工培养难以成活[9,10],因此,基于传统培养方法进行研究存在一定的局限性[11,12,13]。分子技术方法发展至今,对土壤细菌群落的多样性进行研究分别有变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）、末端限制性长度多态性（T-RFLP）、Sanger测序和焦磷酸测序等技术手段[14,15]。由于Illumina MiSeq高通量测序技术对数据量的测序深度较高,相对于其他分子方法能够较全面地解析土壤细菌群落的情况。因此,本文基于Illumina MiSeq高通量测序技术,分析不同有机肥施用量对莲雾园区土壤细菌群落多样性的影响,为合理科学施用有机肥提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 试验处理
选取长势一致的莲雾,即将开展反季节催花时,进行如下处理：CK（不进行任何处理）、GML（羊粪有机肥,低浓度,2 kg/株）、GMM（羊粪有机肥,中浓度,4 kg/株）、GMH（羊粪有机肥,高浓度,6 kg/株）、BML（香蕉茎秆有机菌肥,低浓度,2 kg/株）、BMM（香蕉茎秆有机菌肥,中浓度,4 kg/株）、BMH（香蕉茎秆有机菌肥,高浓度,6 kg/株）。其中,羊粪有机肥中有机质≥35%,香蕉茎秆有机菌肥中N+P2O5+K2O≥5%、有机质≥45%、菌剂:香蕉茎秆有机肥=1:20。
1.2 样品采集
选取植株冠幅下距主干70~80 cm、深度10~15 cm处的土层进行样品采集,每个处理随机采集3~4个土样,开展微生物总DNA的提取和土壤理化性质测定。
1.3 土壤理化性质测定
参照《土壤理化分析与剖面描述》进行全氮（TN）、速效磷、速效钾、有机质、pH等土壤理化性质的测定[16]。
1.4 样品总DNA提取
采用Power Soil® DNA Isolation Kit （MOBIO, USA）试剂盒,参照试剂盒使用说明书进行土壤微生物总DNA的提取和定性定量检测。
1.5 PCR扩增及高通量测序
根据细菌16S rRNA V3-V4区保守序列合成338F/806R引物,以土壤微生物总DNA为模板,进行PCR扩增并回收PCR产物。委托上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。
1.6 数据处理
2 结果与分析
2.1 莲雾园区土壤理化性质
由表1可知,不同施肥处理下的莲雾园区土壤,除含水量不存在显著性差异外,全氮（TN）、速效磷、速效钾、有机质含量及pH均存在显著差异（P<0.05）。此外,不同类型和浓度的施肥处理可使土壤中速效磷和速效钾的浓度显著低于对照（P<0.05）。
表1 土壤样品的理化性质Tab. 1 Physical and chemical properties of soil samples |
| 处理 Treatments | 全氮 TN/(g·kg-1) | 速效磷 Available P/(mg·kg-1) | 速效钾 Available K/(mg·kg-1) | 有机质 Organic matter/(g·kg-1) | 含水量 Water content/% | pH |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 1.76±0.04a | 24.22±0.61a | 22.65±0.62a | 31.38±0.72b | 2.15±1.02a | 3.89±0.02abc |
| GML | 1.19±0.09 c | 8.59±0.04c | 9.99±0.47bc | 24.64±0.87d | 1.78±0.98a | 3.93±0.07ab |
| GMM | 1.82±0.09 a | 4.46±0.11de | 10.66±0.67b | 34.43±0.91a | 2.93±1.04a | 3.92±0.08ab |
| GMH | 1.77±0.06a | 3.84±0.06e | 9.33±0.46cd | 34.97±0.60a | 2.88±1.41a | 3.95±0.06a |
| BML | 1.83±0.09 a | 9.26±0.13c | 8.66±0.83d | 32.77±1.08b | 2.48±1.54a | 3.80±0.02c |
| BMM | 1.46±0.04 b | 5.01±0.12d | 6.66±0.32e | 25.05±0.75d | 1.67±1.12a | 3.83±0.03bc |
| BMH | 1.58±0.05 b | 17.43±1.07b | 7.33±0.07e | 29.62±0.77c | 2.98±1.09a | 3.85±0.08abc |
注：同列数据不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05). |
2.2 莲雾园区土壤细菌群落OTU及多样性分析
表2 土壤样品中细菌群落相对丰度与多样性指数Tab. 2 Bacterial community richness and diversity indices of soil samples |
| 处理 Treatments | 有效序列数 Sequence number | 操作分类 单元OTU | ACE指数 ACE index | Chao1指数 Chao1 index | Shannon-Wiener指数 Shannon-Wiener index | Simpson指数 Simpson index | 覆盖率 Coverage |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 31 172a | 1425c | 1741.00±56.93c | 1762.00±69.94b | 5.5900±0.1277bc | 0.0121±0.0007c | 0.9883±0.0017ab |
| GML | 35 977a | 1613a | 1939.33±20.03a | 1911.67±18.77a | 5.8100±0.0100a | 0.0097±0.0002de | 0.9893±0.0014ab |
| GMM | 37 546a | 1611a | 1961.33±40.15a | 1975.33±76.74a | 5.6533±0.0586bc | 0.0116±0.0009cd | 0.9893±0.0011ab |
| GMH | 32 497a | 1518b | 1878.33±92.12ab | 1873.67±91.54ab | 5.5533±0.0321c | 0.0145±0.0014ab | 0.9878±0.0010b |
| BML | 35 089a | 1635a | 1968.33±29.01a | 1969.67±69.34a | 5.7933±0.0666a | 0.0093±0.0010e | 0.9886±0.0023ab |
| BMM | 38 427a | 1507bc | 1796.33±32.13bc | 1780.00±55.51b | 5.5133±0.1060c | 0.0154±0.0010a | 0.9909±0.0005a |
| BMH | 36 422a | 1617a | 1937.67±15.01a | 1970.00±20.22a | 5.7033±0.0551ab | 0.0133±0.0018bc | 0.9892±0.0022ab |
注：相似性水平为97%;同列数据不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Similarity level is 97%; Different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05). |
基于分析表征细菌丰富度的ACE指数、Chao1指数,以及指示细菌多样性的Shannon- Wiener和Simpson指数可知,在羊粪有机肥GML和GMM处理后的土壤细菌群落多样性和丰富度均高于对照,其中GML（低浓度羊粪有机肥）处理后细菌群落丰富度最高,但GMH处理低于对照;在香蕉茎秆有机菌肥处理下,虽然BML（低浓度香蕉茎秆有机菌肥）处理后细菌群落丰富度最高,与羊粪有机肥处理结果相似,但细菌群落丰富度最低的表现为BMM,且低于对照。
综上所述,不同施肥处理下莲雾园区土壤细菌群落多样性和丰富度大小顺序为：BML= GML>GMM=BMH>CK>GMH=BMM。由于BML和GML两种处理均无显著性差异,无法比较出BML和GML处理对莲雾根际土壤细菌群落多样性的影响程度。从整体上看,在低浓度（2 kg/株）处理下,羊粪有机肥和香蕉茎秆有机菌肥对莲雾园区土壤细菌群落的影响显著高于其他处理。
2.3 莲雾园区土壤细菌群落结构组成分析
通过Silva数据库比对发现,样品中的细菌群落包含28门分类（图2A）,所有土壤样品中细菌群落结构的组成存在一定的相似性。其中,酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和变形菌门（Proteobacteria）占比最高,以上3种细菌群落约占土壤总细菌群落的73.47%~81.03%,在莲雾园区细菌群落结构中起着主要作用。与对照相比,GML、GMM、GMH、BML和BMH处理下,酸杆菌门占比最高,分别为33.22%、35.46%、32.25%、27.54%和33.48%,而在对照和BMM处理中,变形菌门占比最高,分别为27.30%和27.89%。酸杆菌门群落的大量存在与莲雾园区偏酸性的砖红壤类型密切相关[22]。由于不同施肥方式及其不同浓度处理导致土壤理化性质发生改变,对土壤各个优势菌群的影响存在一定的差异（如BMM）。
为进一步细化分析细菌群落结构间的差异,在属分类学水平上开展分析,共检测出418个属（如图2B）。除GML处理外,在其余的6个处理中（含CK）,绿弯菌门下的一个分属JG37-AG-4所占比例最高,其中CK、GMM、GMH、BML、BMM、BMH处理的占比分别为13.00%、12.36%、15.89%、9.50%、16.21%、14.30%。而在GML处理中,优势菌属为酸杆菌门下的一个分属Subgroup_2,其占比为11.57%。
由不同施肥处理的土壤细菌OTU维恩图（图3）可知,3种施肥处理类型,细菌OTU总量为2443个,而共有OTU为1719个,占比70.4%;CK、GM和BM处理特有的OTU数量分别为20、67和80个,占比分别为0.8%、2.7%和3.3%。表明不同浓度羊粪有机肥和香蕉茎秆有机菌肥处理莲雾园区土壤细菌群落结构具有一定的相似性和差异性。
2.4 莲雾园区土壤细菌群落空间差异物种（Biomarker）分析
图4 3种处理组的细菌群落空间差异物种LEfSe分析LDA值分布柱状图Fig. 4 Distribution histogram of LDA value of LEfSe analysis of bacterial community spatial differences among three different treatment groups |
图5 3种处理组的细菌群落空间差异物种LEfSe分析进化分枝图分枝中绿色节点表示在CK组中起到重要作用的微生物类群;红色节点表示在BM组中起到重要作用的微生物类群;蓝色节点表示在GM组中起到重要作用的微生物类群;黄色节点表示在3种不同组中均没有起到重要作用的微生物类群。 Fig. 5 Evolutionary branching map of LEfSe analysis of bacterial community spatial differences among three different treatment groups The green nodes in the branches indicate the microbial groups that play an important role in the CK group; The red nodes in the branches indicate the microbial groups that play an important role in BM group; The blue nodes in the branches indicate the microbial groups that play an important role in the GM Group; The yellow nodes in the branches indicate the microbial groups that do not play an important role in the three groups. |
3 讨论
反季节莲雾不仅可以满足消费市场的需求,还可以增加果农的经济收入,显著提高果农的经济效益。莲雾在进行反季节催花调控时,为了提高产量和品质,降低反季节生产对植株的损伤,需要施用催花肥,促进植株生长。催花肥的施用量或施用类型都会改变土壤理化性质,从而对莲雾园区土壤细菌群落多样性产生影响[8]。目前,莲雾催花肥的施用类型中,主要有无机肥、有机肥、微生物菌肥等。本文对施用羊粪有机肥和添加无机肥、菌剂的香蕉茎秆有机菌肥的莲雾园区土壤细菌群落进行分析,发现不同施肥处理对土壤理化指标的影响存在显著差异。
细菌群落的丰度和多样性对土壤微环境的稳定性起着不可或缺的作用。人工施肥或添加外源菌剂等方式致使外界因素发生变化时,土壤细菌群落会随之发生变化[23,24,25,26]。本文基于Illumina MiSeq高通量测序技术,分析羊粪有机肥和香蕉茎秆有机菌肥对莲雾园区土壤细菌群落多样性的影响,发现表征土壤细菌丰富度的ACE、Chao1指数,以及指示细菌多样性的Shannon-Wiener和Simpson多样性指数大小顺序为BML=GML> GMM=BMH>CK>GMH=BMM。同时与对照相比,发现土壤细菌群落会随着施肥类型和浓度的变化而发生显著性变化,与前人研究结果相一致[27,28]。无论是羊粪有机肥还是香蕉茎秆有机菌肥,低浓度（2 kg/株）施用时,土壤细菌群落的多样性显著高于同类型肥料的其他处理浓度,但在低浓度处理下的2种肥料之间无显著差异。从多样性和丰富度的角度分析,施用低浓度（2 kg/株）的有机肥（含羊粪有机肥和香蕉茎秆有机菌肥）有利于提高土壤细菌群落的稳定性,与前人研究结果大致一致[29,30]。
门分类水平分析表明,酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和变形菌门（Proteobacteria）是不同施肥处理莲雾园区土壤中的优势菌门,与前期研究结果大致相同[31]。其中,酸杆菌门（Acidobacteria）占比最大,与试验地区砖红壤的酸碱度存在一定的相关性,酸杆菌门在土壤生态循环中具有重要作用[32]。绿弯菌门（Chloroflexi）细菌是一种含有绿色色素的细菌门类,其丰富度与土壤的保水性和植株的生物量存在显著正相关[33,34]。变形菌门（Proteobacteria）是细菌中最大的一门,包括病原菌和固氮菌等。属分类水平分析表明,在BML、GMM、BMH、CK、GMH、BMM等6个处理中,绿弯菌门下的一个分属JG37-AG-4所占比例最高,而在GML处理中,优势菌属为酸杆菌门下的一个分属Subgroup_2占比最大。表明不同施肥类型和施肥浓度处理下的莲雾园区土壤细菌群落结构存在一定的相似性和差异性。基于LEfSe分析,对照组（CK组）、羊粪有机肥处理组（GM组）和香蕉茎秆有机菌肥处理组（BM组）中,共检测到37个具有显著差异的物种,其中CK组20个,GM组11个,BM组6个。表明不同类型施肥处理形成了不同施肥特有的细菌组成,这一结果与维恩图分析结果相一致。