GDS-80手持基因枪在橡胶树遗传转化上应用的参数优化与配件改进

范璟璋; $\boxed{\hbox{华玉伟}}$; 范月婷; 辛士超; 戴雪梅; 黄天带; 黄华孙; 李季

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.004

热带作物学报 >

2021 , Vol. 42 >Issue 9: 2458 - 2467

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.004

组学与生物技术

GDS-80手持基因枪在橡胶树遗传转化上应用的参数优化与配件改进

范璟璋 ¹ ,
$\boxed{\hbox{华玉伟}}$ ² ,
范月婷 ³ ,
辛士超 ² ,
戴雪梅 ² ,
黄天带 ^,²^,^* ,
黄华孙 ^,²^,^* ,
李季 ²

展开

1.海南大学热带作物学院,海南海口 570228
2.农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/中国热带农业科学院橡胶研究所,海南海口 571101
3.华中师范大学附属息县高级中学,河南息县 464300

* 黄天带,E-mail： zhuanjiyinyuzhong@163.com;

黄华孙,E-mail： xjshhs@163.com。

范璟璋（1994—）,男,硕士,研究方向：分子植物育种。

Copy editor: 谢龙莲

收稿日期: 2021-01-12

修回日期: 2021-02-24

网络出版日期: 2021-11-01

基金资助

国家自然科学基金项目(31770717)

国家自然科学基金项目(31872708)

中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630022019013)

中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(1630022018001)

版权

收起

Parameter Optimization and Accessory Improvement of GDS-80 Handheld Gene Gun for Rubber Tree Genetic Transformation

FAN Jingzhang ¹ ,
$\boxed{\hbox{HUA Yuwei}}$ ² ,
FAN Yueting ³ ,
XIN Shichao ² ,
DAI Xuemei ² ,
HUANG Tiandai ^,²^,^* ,
HUANG Huasun ^,²^,^* ,
LI Ji ²

Expand

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture & Rural Affairs, Haikou, Hainan 571101, China
3. Xixian Senior Middle School Affiliated to Central China Normal University, Xixian, Henan 464300, China

* HUANG Tiandai,E-mail： zhuanjiyinyuzhong@163.com;

HUANG Huasun,E-mail： xjshhs@163.com.

Received date: 2021-01-12

Revised date: 2021-02-24

Online published: 2021-11-01

Copyright

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Fold

摘要

GDS-80手持基因枪是美国Wealtec公司2009年推出的基因传递系统,具有操作简便、高效的特点。已报道的橡胶树基因枪转化研究都是使用台式基因枪。本文首先利用考马斯亮蓝轰击滤纸去除明显不适合的参数,接着以绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,轰击巴西橡胶树体细胞胚以及愈伤组织,用荧光显微镜观察绿色荧光,探究适合橡胶树的轰击参数。而且比较了Image J软件和肉眼统计荧光斑点数及GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪的差异。结果表明：对于橡胶树体细胞胚和愈伤组织,仅依靠原厂配件难以获得较好的转化效果。本文设计了直径3 cm（与轰击范围相同）,高度2.5 cm,孔径60目的过滤网。同时改进装试验材料的培养皿,用刀片在培养皿的中心割出一个直径3 cm的圆圈,轰击胚状体时,将上述设计的过滤筛网正向卡在圆圈上,胚状体放入过滤网中,轰击时将培养皿用试管架架高,压力就从筛网及底部的空洞分解,微弹完全轰击到试验材料。轰击胚状体最优参数为：轰击压力为60 psi,针状调节阀为3圈,目标间隔盘为6 cm。轰击愈伤时将材料放到普通培养皿中心的轰击范围内,反向盖上过滤筛网。最优轰击参数为：轰击压力为50 psi,针状调节阀为4圈,目标间隔盘为6 cm。本文采用Image J软件进行荧光斑点计数,准确率与肉眼相当,但较肉眼省时。GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪转化效率相当,但GDS-80手持基因枪每打一枪比PDS-1000/He台式基因枪快12 min。研究结果为橡胶树遗传转化提供了高效的基因枪转化体系,为转基因研究提供了一个高效的统计荧光数的软件。

关键词： 巴西橡胶树; GDS-80; 基因枪; GFP基因; Image J

本文引用格式

范璟璋 , $\boxed{\hbox{华玉伟}}$ , 范月婷 , 辛士超 , 戴雪梅 , 黄天带 , 黄华孙 , 李季 . GDS-80手持基因枪在橡胶树遗传转化上应用的参数优化与配件改进[J]. 热带作物学报, 2021 , 42(9) : 2458 -2467 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.004

Abstract

GDS-80 handheld gene gun is a gene delivery system launched by Wealtec Company in 2009, which is easy to operate and efficient. All the published researches on the transformation of Hevea brasiliensis by gene gun are based on desktop gene gun. In this paper, Coomassie Brilliant Blue was firstly used to bombard filter paper to screen out obviously not suitable parameters, and then the green fluorescent protein (GFP) gene was used as the reporter gene to bombard the somatic embryos and callus of H. brasiliensis, finally the green fluorescence was observed by fluorescence microscope to explore the suitable bombardment parameters for H. brasiliensis. The difference in fluorescent spot numbers calculated by Image J software and naked-eye and the difference between GDS-80 handheld gene gun and PDS-1000/He desktop gene gun was compared. The results showed that it was difficult to obtain good transformation efficiency by using original accessories for somatic embryos and callus of H. brasiliensis. In this paper, a filter screen with a diameter of 3cm (same as the bombardment range), the height of 2.5 cm and pore diameter of 60 mesh was designed. At the same time, a petri dish containing the experimental materials was improved. A circle with a diameter of 3cm was cut out in the center of the petri dish by a blade. The filter screen designed above was clamped on the circle with forwarding direction, and the embryos were put into the filter screen. When bombarding, the petri dish was put on the test tube rack, and the pressure would decompose from the mesh and the cavity at the bottom, and the micro bullet would completely bombard the embryos. The optimal parameters for embryos were as follows: bombardment pressure 60 psi, needle-shaped regulating valve 3 circles, and target spacing plate 6 cm. When the callus was bombarded, the material was placed in the center of a traditional petri dish and covered by the designed filter screen reversely. The optimal bombardment parameters for callus were as follows: bombardment pressure 50 psi, needle-shaped regulating valve 4 circles, and target spacing disc 6 cm. In this paper, Image J software was used to count fluorescent spots. The accuracy was equivalent to that counted by naked eyes, but it saved time. The transformation efficiency of the GDS-80 handheld gene gun was similar to that of the PDS-1000 / He desktop gene gun, but the GDS-80 handheld gene gun was 12 minutes faster than PDS-1000 / He desktop gene gun for one shot. The research results would provide an efficient gene gun transformation system for H. brasiliensis genetic transformation and a efficient software to count fluorescent spots.

Key words： Hevea brasiliensis; GDS-80; gene gun; GFP gene; Image J

橡胶树学名Hevea brasiliensis,又名巴西橡胶树、三叶橡胶树,隶属大戟科（Euphorbiaceae）橡胶树属（Hevea Aubl.）,是天然橡胶的主要来源,原产于南美亚马逊河流域,是一种重要的战略物资,与钢铁、煤炭、石油并列为我国的四大工业原料。橡胶树具有遗传背景狭窄、高度杂合化、育种周期长等特点,使得巴西橡胶树育种进展非常缓慢^[1],而采用转基因技术将外源基因导入到橡胶树组织中,能有效提高育种效率,缩短育种周期。对巴西橡胶树的转基因研究已有报道^[2],大部分为农杆菌介导的转化。Arokiaraj等^[3]首次通过根癌农杆菌介导法转化橡胶树花药脱分化愈伤组织,获得3棵转化新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）和β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）的转基因植株。Jayashree等^[4]以花药脱分化愈伤组织为受体,用农杆菌介导法将gus基因和sod基因成功转入橡胶树中,在转基因后代中能稳定表达。随后,Arokiaraj等^[5]和Jayashree等^[4]分别将人血清白蛋白基因（HSA）和橡胶树超氧歧化酶基因（HbSOD）导入橡胶树,分别获得16棵和3棵转基因植株。Blanc等^[6,7]建立了比较有效的根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,获得了374棵转基因植株,同时,成功将铜锌超氧歧化酶基因（CuZnSOD）导入橡胶树,Leclercq等^[7]在2012年发表了第1篇有关转基因橡胶树植株表型和所转基因的功能进行系统研究的文章。黄天带等^[8]于2010年在我国率先建立了以花药脱分化愈伤组织为受体的农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,获得10个转基因株系。2015年以胚状体为农杆菌侵染受体,获得转基因植株^[9]。Lestari等^[10]在橡胶树中过表达1个拟南芥ERF1（ethylene response factor 1）的橡胶树同源基因Hb ERF- IXc5,这与以往报道ERF1过表达植株矮化严重的现象明显不同,表明Hb ERF-IXc5的功能可能有别于经典的植物ERF1。Jayashree等^[11]在橡胶树中过表达IPP甲羟戊酸合成途径的关键酶HMGR基因（hmgr1）,所有转基因植株的茎围和胶乳产量均高于对照植株,胶乳产量最高可达对照的5倍,表明通过转基因手段培养高产甚至超高产橡胶树的前景诱人。最近,中国热带农业科学研究院橡胶研究所的科研人员^[12]将体外组合的Cas9/sg RNA核蛋白导入橡胶树原生质体中,实现了对橡胶树靶标基因FT和TFL1的有效编辑,有望将无外源DNA导入的基因编辑技术应用到橡胶树遗传改良中。

基因枪法,又称为生物弹法、微粒轰击法,是通过高速的金属颗粒将外源基因导入细胞中的一种转化技术。它是继农杆菌介导转化法之后又一种应用最广泛的遗传转化技术^[13]。基因枪转化不受受体对农杆菌敏感性、外植体类型、基因型限制,筛选过程不需要抑菌。尤其是研究瞬时表达比农杆菌更有优势。Arokiaraj等^[14]首次使用基因枪法转化橡胶树花药脱分化愈伤组织,获得第1株转基因橡胶树。王颖等^[15]用基因枪轰击橡胶树花药脱分化愈伤组织,将GAI矮化基因导入巴西橡胶树,获得PCR阳性胚状体。以上2个研究均使用台式基因枪。GDS-80低压基因传递系统（也称手持基因枪）,是美国Wealtec公司在2009年推出的基因传递工具,由低压氦气或氮气驱动,气流被压缩入主机。当扣动扳机时,气流会被加速到一个极高的速度携带生物粒子进入到靶细胞,从而完成外源基因的导入过程。相比于台式基因枪,GDS-80手持基因枪具有以下特点：（1）低压（10-80 psi）可执行,对细胞损害极小;（2）氦气或氮气均可完成;（3）低噪音,不用戴耳罩;（4）可高压灭菌;（5）步骤简单,省时省力,省去涂微弹和干燥2个步骤;（6）节约耗材,不需要可裂膜和载体膜;（7）体积小,省空间。本研究首先利用考马斯亮蓝初步确定GDS-80手持基因枪的基本参数,再用包裹金粉的质粒微弹轰击橡胶树胚状体及愈伤组织,研究最重要的参数对转化效率的影响,然后比较Image J软件和肉眼统计荧光斑点数及GDS-80手持基因枪与PDS-1000/He台式基因枪的差异。本研究建立的GDS-80手持基因枪轰击橡胶树体系,为橡胶树基因功能验证、转基因改良提供新的高效技术。

1 材料与方法

1.1 材料

巴西橡胶树‘热研7-33-97’次生胚状体及‘热垦525’愈伤组织由本实验室培养获得。GDS-80手持基因枪,购自美国Wealtec公司,0.6 µm直径金粉。转化载体pJIT163-hGFP（Wang）由中国农业科学院水稻研究所王克剑团队馈赠^[16],载体见图1。

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图1 pJIT163-hGFP（Wang）示意图

Fig. 1 Sketch of pJIT163-hGFP (Wang)

1.2 方法

1.2.1 考马斯亮蓝初筛称量0.05 g考马斯亮蓝固体,溶解于50 mL 100%乙醇中。竖直方向向枪管中注入考马斯亮蓝溶液到样本孔中。4.5 mm枪管连接GDS-80枪口到目标间隔盘上,设置氦气压力为1550 psi,气流速度10~15 L/min。在滤纸上3个不同的位置扣动扳机3次,然后更换滤纸。考虑到金粉及质粒制成的微弹价格昂贵,且微弹制备耗时耗力,而考马斯亮蓝经济实惠,制备简单,因此通过考马斯亮蓝先过滤明显不适合的参数,再用微弹进一步优化转化参数。测试轰击距离、轰击压力、针状调节阀、上样量等关键参数对轰击效果的影响。

1.2.2 ‘热垦525’愈伤组织的诱导采集‘热垦525’花序,取出雄蕊,在愈伤诱导培养基诱导初级愈伤组织,然后转入体胚诱导培养基,诱导易碎胚性愈伤组织并维持。愈伤诱导培养基参考Hua等^[17]的文献,体胚诱导和易碎胚性愈伤组织维持培养基参考戴雪梅等^[18]的M2培养基。

1.2.3 ‘热研7-33-97’胚状体的诱导采集‘热研7-33-97’花序,取出雄蕊,在愈伤诱导培养基诱导愈伤组织,然后转入体胚诱导培养基,诱导初生胚,接着进入次生胚循环增殖阶段,将胚状体切成3 mm × 3 mm的胚块,诱导次生胚。具体参考Hua等^[17]的方法。

1.2.4 轰击设备的改进轰击胚状体时,在60 psi压力下,按照说明书直接轰击,由于轰击压力过大以及气流动力很足使得胚状体被打成碎片并分散到培养皿及间隔盘,而以愈伤为轰击对象,在50 psi的压力下,愈伤就四处飞溅。这种情况,可看到部分微弹轰击到培养皿而不是试验材料,浪费微弹、降低转化效率的同时增加了污染风险。针对此现象,设计了直径3 cm（与轰击范围相同）,高度2.5 cm,孔径60目的过滤网（图2A,图2B）,轰击愈伤时将愈伤置于常规培养皿轰击范围,筛网面朝上遮盖试验材料,防止材料被吹散（图2C,图2D）可取得较好效果。但在轰击胚状体过程中发现,因为压力集中在过滤网范围,材料分散的现象虽然仍存在,但较无筛网遮盖有明显降低。因此进一步改进装试验材料的培养皿,用刀片将培养皿中间3 cm轰击范围割开,漏出3 cm空洞（图2E）,轰击时将上述设计的过滤网卡在3 cm空洞处,试验材料装于过滤筛网,轰击时将培养皿架高（图2F）,压力就会从筛网及底部的空洞分散,微弹可以与试验材料充分接触,提高转化效率。

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图2 轰击配件的改进

A：过滤筛网正面;B：过滤筛网俯视图;C：未用过滤筛网遮盖,蓝色圆圈为轰击范围;D：过滤筛网遮盖;E：培养皿轰击部位挖空;F：过滤筛网卡在培养皿镂空处,架在试管架上进行轰击。

Fig. 2 Improvements to bombardment accessories

A: Front view of the filter screen; B: Top view of the filter screen; C: Not covered with a filter screen, the blue circle is the bombardment range; D: Cover with filter screen; E: Bombardment range was cut; F: The filter screen is stuck in the hollow of the petri dish, and it is placed on the test tube rack for bombardment.

1.2.5 橡胶树组织手持基因枪转化体系建立根据以上GDS-80手持基因枪轰击滤纸的试验,以pJIT163-hGFP质粒作样本,轰击橡胶树‘热垦525’愈伤和‘热研7-33-97’次生胚,微弹的制备方法参照GDS-80说明书。将3 µL质粒DNA包裹于6 mg金粉表面,重新悬浮到48 µL 100%乙醇中。愈伤轰击后转入M2培养基^[18],胚状体轰击后转入体胚诱导培养基^[17]。20 h后在Leica（Leica/M205FA）荧光体视显微镜下观察,统计绿色荧光斑点数。以胚状体为轰击对象,轰击距离6 cm、不遮盖,各压力推荐圈数时,设置30、40、50、60、70 psi 5种不同轰击压力,固定轰击压力后,测试轰击距离,过滤筛网遮盖（图2D,处理时简称遮盖）与不遮盖（图2C,简称不遮盖）及培养皿底部漏气对转化效率的影响（图2F,简称底部漏气）。以愈伤组织为轰击对象,轰击压力为50 psi,针状调节阀推荐圈数,过滤筛网遮盖（图2D）时,比较轰击距离对转化效率的影响。每个处理打3枪。

1.3 数据处理

采用Image J、Excel 2003软件处理试验数据,采用DPS软件作统计分析。

2 结果与分析

2.1 考马斯亮蓝溶液轰击滤纸

2.1.1 轰击距离对轰击效果的影响在轰击压力固定为50 psi、针状调节阀使用推荐圈数4圈及样本体积固定为10 µL时,使用3、6、9 cm的轰击距离,探究最适轰击距离。结果表明,当轰击距离为3 cm（图3A）和6 cm（图3B）时,考马斯亮蓝溶液的轰击范围适中,均匀度好,颜色较清晰;当轰击距离为9 cm时,枪口离样本太远,气流动力不足,使考马斯亮蓝溶液打到滤纸上后较分散,轰击范围很大,虽然均匀度好但颜色不清晰,表明轰击力度不足（图3C）。所以后续试验以3 cm和6 cm作为候选轰击距离。

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图3 不同距离目标间隔盘的试验结果

Fig. 3 Experimental results of target spacers at different distances

A: 3 cm; B: 6 cm; C: 9 cm.

2.1.2 轰击压力对轰击效果的影响固定轰击距离为6 cm,上样体积为10 µL时,改变轰击压力,使用相应的针状调节阀推荐圈数,筛选适宜的轰击压力。结果表明,当轰击压力为20、30 psi时,轰击范围小,且均一度差;当轰击压力为40、50、60 psi时,轰击范围大,均匀度较好（图4）。因此,上述条件下,轰击压力≥40 psi时轰击效果较好,本试验淘汰20 psi,后续试验以50 psi进行优化。

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图4 不同轰击压力下的试验结果

Fig. 4 Experimental results under different bombardment pressures

A: 20 psi; B: 30 psi; C: 40 psi; D: 50 psi; E: 60 psi.

2.1.3 针状调节阀圈数对轰击效果的影响以轰击压力50 psi为例,上样体积为10 µL,轰击距离为6 cm时,比较针状调节阀不同圈数（不超过推荐圈数范围）对轰击效果的影响,确定最适圈数。结果表明：1圈时,气流动力很小,导致考马斯亮蓝聚集,所以深色颗粒多,均匀度差,被轰击范围最小（图5A）;当圈数逐渐增加到2、3、4圈时（图5B,图5C,图5D）,气流动力逐渐增加,打到滤纸上的范围逐渐增加,分散性越来越好,在不超过推荐圈数的范围时,均匀度与分布均匀校正参考结果相近,最适圈数为4圈（图5D）。因此,使用不同轰击压力时针状调节阀采用推荐圈数即可获得理想的试验结果。

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图5 针状调节阀对考马斯亮蓝轰击效果影响

A：1圈;B：2圈;C：3圈;D：4圈。

Fig. 5 Effect of needle control valve on coomassie brilliant blue bombardment

A: 1 circle; B: 2 circles; C: 3 circles; D: 4 circles.

2.1.4 上样体积对轰击效果的影响上样体积是轰击参数的关键因素,同样轰击效果采用较低上样体积有助于降低试验成本。固定轰击压力为50 psi,针状调节阀为4圈以及目标间隔盘距离为6 cm时,研究样本体积对轰击效果的影响。结果表明,随着样本体积的增加,滤纸轰击范围越来越大,均匀度也越来越好,颜色也从模糊到清晰。5 µL上样量轰击范围小,颜色浅,表明此上样量作为微弹上样量轰击范围太小,力度也不足（图6A）;10 µL上样量轰击范围在可接受范围,均匀度好,颜色为清晰的淡蓝色,表明力度较理想（图6B）;15、20 µL虽然轰击范围比10 µL大,但颜色也明显比10 µL深,所以以此作为微弹上样量会造成轰击力度过大（图6C,图6D）。因此最适上样量为10 µL。

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图6 不同样本体积的试验结果

Fig. 6 Experimental results of different sample volumes

A: 5 µL; B: 10 µL; C: 15 µL; D: 20 µL.

2.2 基因枪轰击橡胶树次生胚及愈伤组织

2.2.1 轰击压力对体胚转化效率的影响轰击压力是影响转化效率最重要的因素。根据考马斯亮蓝试验结果,使用官方配件,选择6 cm目标间隔盘和针状调节阀推荐圈数,研究不同轰击压力对GDS-80手持基因枪将质粒打入橡胶树胚状体效率的影响。当轰击压力为30 psi时,由于轰击压力过小,胚状体完整性好,微弹几乎无法到达胚状体;随着轰击压力的增强,轰击后在显微镜下观察的GFP荧光数随之增加,60 psi效果最好。但轰击压力过高时（70 psi）,GFP荧光数略有减少。当轰击压力为30~50 psi时,产生的气流动力较小,气流速度较低,橡胶树胚状体完整性较好,质粒只有部分能进入胚状体中,所以只有少部分荧光数;当轰击压力增加至60 psi时,产生较大的气流动力,导致橡胶树胚状体破碎,使得质粒与胚状体有更多的接触面积及可能性,所以在显微镜下观察的荧光数随之增加;而当轰击压力增加到70 psi时,气流动力足够大,橡胶树胚状体更加破碎,胚块四处飞溅,太小的胚块不能做后续试验,且压力太大导致破碎太快,质粒与胚状体接触变少,所以在显微镜下观察的数目减少（表1）。

表1 不同轰击压力对胚状体转化效率的影响

Tab. 1 Effect of different bombardment pressures on the transformation efficiency of embryos

轰击压力 Bombardment pressure/psi	目标间隔盘距离 Target spacer distance/cm	荧光数 Fluorescence numbers
30	6	33.00±31.31^c
40	6	168.80±98.89^b
50	6	166.20±38.35^b
60	6	329.80±88.87^a
70	6	75.60±24.20^c

	注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
	Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

2.2.2 轰击距离、改进轰击设备、受体对转化效率的影响对于次生胚来说,当轰击压力为60 psi,针状调节阀使用推荐圈数3圈,上样体积10 µL时,3 cm目标间隔盘的荧光数比6 cm目标间隔盘多,达显著水平（表2）,但胚状体会被打成较小碎片,不利于后续体胚发生,因此6 cm更适合作为胚状体转化的轰击距离。

表2 轰击设备改进后的试验方案及结果

Tab. 2 Experimental program and results after bombardment equipment improvement

材料 Material	目标间隔距离 Target spacer distance/cm	轰击压力 Bombardment pressure/psi	推荐圈数 Recommended number of laps	改进方式 Improvement mode	荧光数 Fluorescence numbers
胚	3	60	3	遮盖	574.00±121.54^b
	3	60	3	不遮盖	368.00±102.23^c
	6	60	3	遮盖	263.40±20.21^c
		60	3	不遮盖	76.60±19.33^d
		60	3	底部漏气	834.40±147.77^a
愈伤	3	50	4	遮盖	147.40±17.34^b
愈伤	6	50	4	遮盖	635.00±143.62^a

	注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
	Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

使用过滤筛网遮盖胚状体,无论轰击距离为3 cm或6 cm,筛网遮盖处理的绿色荧光斑点数都显著高于无筛网遮盖（表2,图7）。主要是由于无筛网遮盖时胚状体在高速气压的作用下吹散到培养皿和间隔盘后散落在培养皿,造成微弹的浪费,而筛网遮盖胚状体后,胚状体吹散的范围局限在筛网内,微弹浪费情况明显改善。底部漏气时,荧光数目在所有处理中最多,效果最好,且胚状体打碎的碎片大部分都大于2 mm×2 mm（表2,图7）。

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图7 胚状体及易碎愈伤组织轰击效果

A：60 psi,6 cm,3圈,不遮盖;B：60 psi,3 cm,3圈,遮盖;C：60 psi,6 cm,3圈,底部漏气;D：50 psi,3 cm,4圈,遮盖;E：50 psi,6 cm,4圈,遮盖。

Fig. 7 Bombardment effect of embryos and fragile calli

A: 60 psi, 6 cm, 3 circles, no cover; B: 60 psi, 3 cm, 3 circles, cover; C: 60 psi, 6 cm, 3 circles, hollow petri dish; D: 50 psi, 3 cm, 4 circles, cover; E: 50 psi, 6 cm, 4 circles, cover.

因此,把过滤筛网装在培养皿轰击范围镂空处,然后装载胚状体到过滤筛网,扣上6 cm目标间隔盘,用60 psi的轰击压力,针状调节阀使用推荐圈数,10 µL轰击体积可获得理想的转化效率。然而对于易碎胚性愈伤来说,由于愈伤颗粒很小,预试验表明50 psi轰击压力无过滤筛网遮盖时愈伤飞溅到培养皿、目标间隔盘、基因枪,以及目标间隔盘外的工作台,造成对愈伤细胞的损害、污染风险大大增加、受体不完整、收集散落四处的愈伤组织费时费力。对于胚状体最好的底部漏气处理则不适合易碎胚性愈伤组织,由于愈伤组织颗粒太小,在压力作用下,愈伤从筛孔处透过培养皿镂空处泄露到外面。而50 psi、过滤筛网遮盖可获得较理想的试验结果,愈伤组织仅在筛网内部散落,较易收集,且通过更换高压灭菌的筛网可控制污染。在50 psi压力下,6 cm目标间隔距离的转化效率显著高于3 cm。主要原因是同样压力下短距离瞬时压力高于长距离,造成材料被迅速吹散。而6 cm轰击距离转化效率虽然比体胚底部漏气效果稍差,但是也能获得较好的转化效率（表2,图7）。

2.2.3 Image J软件统计绿色荧光斑点数准确率

建立植物遗传转化体系时,需要使用GFP等报告基因以便计算转化效率,而影响转化效率的因素很多,因此,建立转化体系的过程需要耗费大量时间和精力统计绿色荧光斑点。理想的图形分析软件有望把科研工作者从繁重的显微观察及计数中解放出来。Image J图像分析软件是美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）开发的免费科学图像分析工具,可计算阳性点密度和数量。准确率是衡量软件最重要的标准。本研究通过肉眼统计的绿色荧光斑点数与Image J软件统计的绿色荧光斑点数间的误差为2.78%~ 9.82%,误差在接受范围,表明Image J软件用于统计绿色荧光数结果可信。而肉眼统计93、144、224个绿色荧光斑点,用时分别为1、2、3 min,而Image J软件用时均为0.5 min（表3）,随着绿色荧光斑点数的增加,人工花费的时间延长,而Image J软件用时均为0.5 min,大大提高效率。因此,Image J软件具有高效、准确的特点,可用于统计绿色荧光斑点数。其中图8和表3是以图7A、图7B、图7E为例来比较Image J软件和人工统计数据所花费的时间以及准确性。

表3 肉眼与Image J软件统计绿色荧光斑点数差异

Tab. 3 Difference of green fluorescent spots between counting by naked eyes and Image J

处理 Treatments	统计方式 Statistical methods	荧光数 Fluorescence numbers	误差 Deviation	误差百分比 Deviation percentage/%	时长 Time/min
60 psi,3 cm,3圈,不遮盖	肉眼	93	4	4.30	1.0
60 psi,3 cm,3圈,不遮盖	Image J	89	4	4.30	0.5
60 psi,3 cm,3圈,遮盖	肉眼	144	-4	2.78	2.0
60 psi,3 cm,3圈,遮盖	Image J	148	-4	2.78	0.5
50 psi,3 cm,4圈,遮盖	肉眼	224	22	9.82	3.0
50 psi,3 cm,4圈,遮盖	Image J	202	22	9.82	0.5

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图8 转换后的计数图片

Fig. 8 Converted count image

2.2.4 手持基因枪GDS-80与台式基因枪PDS- 1000/He转化效率与工作效率比较台式基因枪PDS-1000/He是近年来使用最广的基因枪,广泛应用于植物基因工程、动物基因工程、基因治疗和基因免疫等^[19]。通过比较PDS-1000/He和GDS-80的转化效率和耗时差异,结果表明,二者的转化效率无显著差异。而台式基因枪PDS-1000/ He与手持基因枪GDS-80从材料摆放到完成打枪所需时间,每打一枪,GDS-80比PDS-1000/He快12 min（表4）。GDS-80需要将选好的材料转移到过滤筛网中,在筛网中尽量摆放紧密不能有太大孔隙,历时大约55 s,然后吸取微弹加到上样孔,迅速按下扳机开始轰击植物组织,历时5 s左右,由于气流动力足够大,材料会破碎,最后收集材料转移到培养基所需时间60 s,所以每枪所需时间大约2 min;而台式基因枪PDS-1000/He在选材料时直接摆放在培养皿中心,省去了转移时间,接着需要将微弹均匀涂在微弹载体的内圈上,然后迅速盖上培养皿盖子,静置10 min,让其自由挥发,在此期间用无菌镊子取出可裂膜并在70%异丙醇中轻蘸几下进行灭菌,将湿润的可裂膜放在可裂膜固定帽内,旋紧,将装有微弹的载体支架及终止屏放入载体组件内,旋紧,最后将培养皿放在托盘上的中间圆圈内,关闭轰击室门,按下抽真空建（Vac）,当真空表读数达到28 inches Hg时。调键置于“保持（Hold）”档,按下射击键（Fire）,直到听到“砰”一声结束射击,按下放气（Vent）键,使真空表读数归零,完成打枪过程,取出材料即可,整个过程大概持续14 min。由此可以看出,相比GDS-80而言,PDS-1000/He不仅操作繁琐,且用时更长,而二者的转化效率相当,因此手持基因枪GDS-80在工作效率占显著优势。

表4 手持基因枪GDS-80与台式基因枪PDS-1000/He的转化效率与工作效率比较

Tab. 4 Comparison of transformation efficiency and work efficiency between handheld gene gun GDS-80 and desktop gene gun PDS-1000/He

仪器 Apparatus	打枪次数 Shot	荧光数 Fluorescence number	荧光数均值±标准差 Fluorescence numbers mean±SD	用时 Time/min	用时均值±标准差 Time mean±SD/min
手持基因枪	1	853	744.67±107.02^a	1.5	1.77±0.25^b
	2	639		2.0
	3	742		1.8
台式基因枪	1	401	691.67±372.81^a	13.5	14.17±0.76^a
	2	1112		14.0
	3	562		15.0

	注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05)。
	Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

3 讨论

基因枪的发展经历了3代,第1代是1990年美国DuPont公司推出的PDS-1000台式基因枪,解决了农杆菌不敏感的单子叶植物的转化问题。但高压气体需要抽真空,压缩机工作时噪音大,高气压使得台式基因枪只能转化细胞而不能转化活体。且其体积大,不能灵活应用于田间地头^[20]。第2代是美国Bio-rad公司1996年推出的Helios手持式基因枪,摒弃了抽真空压缩机,气体压力小（仅100~600 psi）,体积小,方便携带,大大拓宽了基因枪的应用范围,可以对活体动物的肌肉、皮肤直接进行转化,但由于气体压力小,无法穿透成熟叶片的细胞壁,限制了其在植物中的应用^[21]。第3代是美国Wealtec公司推出的GDS-80手持式基因枪,使用氦气或氮气于低压状态加速生物分子至极高的速度,完成基因传送,解决了气压与粒子速度的矛盾。超低压（10~ 80 psi）推动,不仅没有牺牲微粒子反而大大增加了微粒子的传输动量,因此能够成功应用于仅在低压状态下才能完成的动物活体器官转化,而且相比第2代手持式基因枪,GDS-80射出的携基因微粒子因为其本身的高动量,能够像台式基因枪发射出的粒子一样穿透植物细胞壁进入植物细胞完成转化。GDS-80基因枪“子弹”的制备也从干式转为湿式,节省了烘干的时间,简化了流程。且可应用于核糖核蛋白（RNP）基因组编辑。由于不需要载体膜和可裂膜,降低了试验成本。本研究使用GDS-80进行橡胶树转化,操作简单,转化效率与Bio-rad公司的台式基因枪PDS-1000/ He相当。

GDS-80手持基因枪的配件包含GDS-80主机、4.5/10 mm直径枪管、枪套、输气管、O型环、气压表调节阀与流量计、目标间隔盘、UTS-10通用目标间隔套件,对于橡胶树再生能力最强的次生胚和易碎胚性愈伤组织,使用官方配件无法获得理想的转化效率和效果,仅使用目标间隔盘由于压力太大,胚状体很快被打成小碎片,愈伤仅少量接触到微弹后就被吹散到培养皿和目标间隔盘内部及外部,后面的微弹打在培养皿上,影响后续体胚发生、浪费微弹、转化效率低、污染率高;使用UTS-10通用目标间隔套件,胚状体仍然被打得太碎,愈伤被打飞后局限在轰击范围,转化效率较目标间隔盘好转。但是UTS-10通用目标间隔套件只有1套,容易造成污染。因此亟需针对橡胶树受体材料的特点,研制适合橡胶树受体材料的配件。针对胚状体,需要解决2个问题,一是材料被吹散后分散到较大范围,二是压力太大材料被打成小碎片;针对愈伤组织,需要解决第1个问题。本研究做了2个配件,一是设计了直径3 cm（与轰击范围相同）,高度2.5 cm,孔径60目的过滤网;二是将装材料的培养皿轰击范围镂空。针对胚状体,将过滤网底部卡到培养皿镂空处,将胚状体装到过滤网,盖上目标间隔盘进行轰击,由于过滤网及培养皿中部均可漏气,微弹轰击到胚状体后,多余的气体从过滤网和培养皿排掉,胚状体不至于太碎,也不会飞太远;针对愈伤组织,只需将过滤筛网倒扣在轰击材料上,盖上目标间隔盘进行轰击,由于过滤网可漏气,可将压力传递到愈伤组织,愈伤组织飞溅到过滤网同时也接受轰击。过滤网可高温高压灭菌,可根据试验需要定制所需数量,解决了污染问题。利用自主研制的配件,胚状体转化效率提高了近10倍,愈伤由几乎无法转化提高到每轰击一次有635个绿色荧光斑点。

建立遗传转化体系时,需要通过报告基因以可视的方式直观地表现转化效率。而影响转化效率的因素很多,每打一枪或农杆菌侵染一个外植体,需要统计成百上千的斑点,耗时耗力,且容易出错。本文研究了图形分析软件Image J与肉眼统计的差异,发现Image J统计结果准确率在接受范围内,但统计速度显著快于肉眼。该软件已广泛应用于显微图像分析^[22]。该软件应用于转化体系的建立,将把科研人员从繁重的显微观察和计数中解放出来,加快转化体系的研发。

4 结论

本文研究了影响GDS-80轰击橡胶树胚状体和易碎愈伤组织的参数,GDS-80基因枪轰击橡胶树胚状体最佳参数为使用自制的底部漏气培养皿,套上定制的过滤网,过滤网底部朝上,装载胚状体,轰击压力为60 psi,针状调节阀使用推荐圈数,目标间隔盘距离为6 cm,样本体积为10 µL,此条件下次生胚破碎效果也最好;轰击易碎愈伤组织的参数为使用定制的过滤网遮盖愈伤组织,轰击压力为50 psi,针状调节阀使用推荐圈数,目标间隔盘距离为6 cm,样本体积为10 µL。Image J软件可用于转化体系优化时统计绿色荧光斑点。本研究用GDS-80手持式基因枪获得了与台式基因枪相当的瞬时转化结果,既丰富了基因枪轰击橡胶树的方法,因操作方便也将加速橡胶树基因功能验证及转基因育种研究。

参考文献

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