马铃薯Y病毒科（Potyviridae）是仅次于双生病毒科（Geminiviridae）的第二大植物病毒科和第一大植物RNA病毒科[1,2]。根据病毒基因组结构成分、序列相似性、寄主范围和传播媒介等差异,2019年病毒学组设立的国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）修订的分类系统将该科病毒划分为12个属：分别为槟榔病毒属（Arepavirus）、黑梅Y病毒属（Brambyvirus）、菜豆金黄花叶病毒属（Bevemovirus）、大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）、芹菜潜伏病毒属（Celavirus）、甘薯病毒属（Ipomovirus）、拓橙病毒属（Macluravirus）、禾草病毒属（Poacevirus）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）、花叶病毒属（Roymovirus）、黑麦草花叶病毒属（Rymovirus）和小麦花叶病毒属（Tritimovirus）,共计225个确定种和3个暂定种[3]。马铃薯Y病毒科病毒大多寄主范围广泛,多数病毒成员的寄主范围从一个种至几个科不等,传播途径包括媒介、机械创伤或种子等进行传播,给农业生产造成了严重的经济损失[4]。芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）是造成农作物经济损失最严重的马铃薯Y病毒属中的重要成员[5]。TuMV寄主范围十分宽广,至少可威胁到43科156属的318种植物,不但会对大白菜、萝卜、芥菜、油菜等十字花科蔬菜构成严重威胁,同时也是世界范围内传播最广、破坏性最强的侵染芸蔓属植物的病毒。感染了TuMV的植株会产生明脉、花叶皱缩等病症,严重时植株畸形和全株坏死[6]。槟榔坏死环斑花叶病毒（Areca necrotic ring spot virus, ANRSV）是最近在海南槟榔主栽区新发现的一种病毒,为马铃薯Y病毒科的一个新属——槟榔病毒属[7]。ANRSV感染槟榔的症状表现为植株叶中部及底部叶片出现坏死环斑,导致植株整体树势不佳,叶片稀疏,并伴有底部叶片下垂现象,严重影响槟榔的花果质量和数量[8]。
除大麦黄花叶病毒属外,马铃薯Y病毒科病毒都由一个8.0~11.0 kb的正单链RNA分子组成,包含一个大的开放阅读框（open reading frame, ORF）和一个由P3编码序列中的RNA聚合酶滑移而产生相对较短的ORF,在病毒自身蛋白酶作用下产生10~12种成熟蛋白[9]。马铃薯Y病毒科（Potyviridae）大多数病毒基因组中部和C端为保守区结构特征,编码9种成熟蛋白（P1、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP）[6]。VPg（Viral Protein Genome-linked）是马铃薯Y病毒科病毒基因组编码的一种非结构蛋白,大小一般在22~24 kDa之间,通过与病毒基因组5′端共价结合,在病毒RNA的复制和翻译等过程中起关键作用[10,11]。研究该蛋白的功能对于解析马铃薯Y病毒科病毒致病机制具有重要意义。目前对于马铃薯Y病毒科VPg的研究主要集中在VPg与宿主蛋白因子如eIF4E、eIF4AE、eIF4G、PABP等的相互作用在病毒蛋白的翻译过程中发挥的重要作用,而VPg与病毒诱导症状产生的研究还未见报道[12]。本研究利用马铃薯X病毒载体（Potato virus X, PVX）异源表达系统在本生烟中分别过表达了TuMV和ANRSV的VPg蛋白,通过分析VPg蛋白表达对PVX病症表型和植物活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累的影响,以解析VPg是否为TuMV和ANRSV的重要致病因子[13]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料、载体与菌株 马铃薯X病毒PVX载体（pgR107）由剑桥大学David Baulcombe教授惠赠。大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101（pSoup）购自上海唯地生物技术有限公司。TuMV和ANRSV的cDNA由本实验室保存,病毒基因组全长序列Genbank登录号分别为MK241971和MH425894。本生烟草（Nicotiana benthamiana）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供,在温控培养室中生长,光照12 h/d,温度20 ℃,相对湿度50%~60%。
1.1.2 试剂 FastPure Plant Total RNA Isolation Kit (Ploysaccharides & Polyphenolics-rich) RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）购自天根生化科技（北京）有限公司、DL2000 Marker、限制性内切酶（Sma I）、In-Fusion连接酶、PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自宝生物工程（大连）有限公司;Prime STAR Max Premix（2×）高保真DNA聚合酶、FastPure Plant Total RNA Isolation Kit快速DNA聚合酶、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit和FastPure Plasmid Mini Kit均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。SDS-PAGE相关试剂、预染蛋白Marker和Western blot相关试剂均购自Boster公司,Strep-Tactin® XT High Capacity亲和层析柱购自德国IBA公司;ONE-HOUR WesternTM Kit购自金斯瑞生物科技公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据TuMV VPg (Genbank accession: MH200604.1)和ANRSV VPg 基因编码序列(Genbank accession: MH425894)以及PVX(pgR107)载体的多克隆位点,采用In-Fusion无缝克隆策略,将3′端融合了Strep蛋白标签的TuMV VPg 和ANRSV VPg 基因编码序列插入到PVX(pgR107)载体的Sma I多克隆位点。引物序列分别为VPg-Tu-F: CTAGCATC GATTCCC ATG GCGAAAGGTA AGAGGCAAAGG,VPg-Tu-R: C CCGGGTTAT TTCTCGAA AATAAAGAGCTTGACG CCCACCGAGG TGCGACTTGGA GGGCTAGGTGGCGGTCTTGGAGGT GGAAAAAGCTTGACGCC CACCGAGGTT CGCGAGGGC TCGTGGTCCAC TGGGA CGAG;VPg-AR-F: TCGAT TCCCGGG ATG GCAGCAA AGAAA AAGAGAGCATCA, VPg-AR-R: CCCGGGTTA TTTCTCGAA AATAAAGAG CTTGA CGCCCACCGAGG TGCGACTTGG AGGGCT AGGTG GCGGTC TTGG AGGTGG AAAAAG CTTGACGC CCACCGAG GTTCG CGAGGGAAG GTATTAAAAA CAGCCGGG。标记斜体的碱基为用于In- Fusion克隆的PVX(pgR107)载体接头序列,标记为下划线的碱基分别为TuMV VPg和ANRSV VPg的基因序列,加粗的碱基为Strep标签序列。引物由上海Invitrogen公司合成。
1.2.2 TuMV VPg和ANRSV VPg基因的克隆 分别以TuMV和ANRSV基因组cDNA为模板,利用设计的引物VPg-Tu-F/R和VPg-AR-F/R,使用Prime STAR Max Premix（2×）高保真DNA聚合酶分别扩增含有Strep标签序列TuMV VPg和ANRSV VPg的编码基因片段。PCR反应体系（50 μL）：Primer STAR Max Premix（2×）25 μL,上、下游引物（20 μm/uL）各1 μL,模板2 μL,ddH2O 21 μL。PCR反应的条件为：98 ℃变性30 s,50 ℃退火15 s;72 ℃延伸30 s,循环25次后,72 ℃ 5 min终延伸;PCR完成后,扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳观察。
1.2.3 重组病毒表达载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的构建 首先利用Sma I单酶切PVX载体pgR107,电泳后经FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit DNA胶回收试剂盒回收载体大片段,并进一步按照In-Fusion试剂盒说明书将其分别与TuMV VPg、ANRSV VPg编码基因片段进行拼接,构建pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu重组病毒表达载体（图1）。In-Fusion反应体系为：5×In-Fusion HD Enzyme 2 μL,PVX（pgR107）单酶切产物5 μL,TuMV-VPg或ANRSV-VPg 3 μL。反应条件为50 ℃温育1 h。将反应产物转化至DH5α感受态细胞,涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB固体培养基上37 ℃培养过夜。利用PVX多克隆位点序列设计引物（上游引物为PX-F: 5′-TGCAAACTAGATGCAGAAACC-3′,下游引物为PX-R: 5′-GCAGTTTTTGTGGTAGTTGA GG-3′）进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系为：2× Rapid Taq Master Mix酶（Vazyme）10 μL,上下游引物各1 μL,菌液2 μL,ddH2O2 7 μL。PCR的反应条件为：首先95 ℃预变性3 min;然后95 ℃变性15 s,50 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,循环30次;最后72 ℃终延伸5 min。将鉴定为阳性的单克隆菌液送上海生物科技有限公司测序验证。
1.2.4 农杆菌转化和渗透注射接种本生烟 分别将经测序鉴定正确的重组表达载体pPVX-VPg- AR和pPVX-VPg-Tu质粒0.5 μL（0.1~1 μg/μL）利用电击法转化农杆菌GV3101（pSoup）感受态细胞,涂布于含利福平（Rif）和卡那霉素（Kan）的YEB平板上,倒置放于28 ℃培养箱2~3 d。挑取10个转化后阳性单克隆菌落分别放于100 μL含Rif+Kan的LB培养基中,置于摇床200 r/min 28 ℃培养3 h。利用PVX载体引物PX-F和PX-R,进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系及条件同重组载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的鉴定一致。将鉴定正确的含有pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu农杆菌工程菌株分别过夜培养,5000 r/min离心10 min收集菌体,利用接种缓冲液[10 mmol/L MgCl2,2.50 mmol/L MES (pH=5.7)和100 μmol/L乙酰丁香酮(AS)]将菌体重悬OD600值为0.4,置于暗处静置2 h,最后用去掉针头的注射器对约3周龄的本生烟草叶片进行注射接种。同时以含有ANRSV的外壳蛋白（coat protein, CP）PVX表达载体PVX-CP-AR和PVX空载体的农杆菌工程菌株为对照进行接种[14]。对接种后的本生烟叶片进行定期观察,并记录发病情况。
1.2.5 RT-PCR检测 采用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取分别感染了PVX-VPg-AR、PVX-VPg-Tu和PVX-CP-AR的本生烟叶片总RNA,并利用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit进行反转录。利用PVX载体引物PX-F和PX-R,对TuMV VPg和ANRSV VPg进行PCR检测。PCR反应体系及条件同重组载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的鉴定一致。
1.2.6 本生烟总蛋白的提取与Strep-Tactin层析纯化 称取16 g感染了PVX-VPg-AR、PVX-VPg- Tu和PVX-CP-AR的本生烟,加液氮将叶片磨碎后立即放入蛋白提取缓冲液。蛋白提取缓冲液体系为：10 mol/L Tris-HCl（pH=8）,1% KCl,1% MgCl2·6H2O,0.1% EDTA（0.5 mol/L）,1 mol/L DTT（DL-Dithiothreitol）,1% P40,1% Cooktool of protein inhibitor。经5000 r/min离心30 min和0.22 μm滤膜过滤获得烟草总蛋白提取液,并加入Strep-Tactin®XT High Capacity Purification纯化柱分离纯化带Strep标签的重组蛋白,具体方法和步骤参考德国IBA公司的Strep-Tactin®XT High Capacity Purification层析柱说明书。
1.2.7 重组蛋白 Western blot鉴定 将上述Strep-Tactin层析纯化产物进行SDS-PAGE凝胶电泳,利用StrepMAB-Classic-HRP抗体（IBA）进行Western blot检测。
1.2.8 DAB和NBT染色法检测H2O2和O2-自由基 将本生烟叶片浸入盛有pH 3,浓度为1 mg/mL的DAB染色液一次性培养皿中,并用锡纸遮光处理,放入抽真空泵抽真空20 min。然后放入28 ℃,80~100 r/min的摇床中12 h进行染色处理,最后用乙酸:甘油:乙醇（1:1:3）在沸水中漂白15 min,并拍照。对于NBT染色法,先将0.01%NBT溶解于10 mmol/L KH2PO4（pH=7.8）和10 mmol/L NaN3中,接着将叶片浸入染色液并进行遮光处理,放入抽真空泵抽真空20 min。然后放入28 ℃,80~100 r/min的摇床中4 h进行染色处理,最后用乙酸:甘油:乙醇（1:1:3）在沸水中漂白15 min,并拍照。
2 结果与分析
2.1 重组载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu的鉴定
利用设计的引物VPg-Tu-F/R和VPg-AR- F/R,分别以TuMV和ANRSV基因组cDNA为模板,PCR扩增获得了融合有Strep标签序列和PVX载体接头序列的VPg-Tu（576 bp）和VPg-AR（627 bp）片段。利用In-Fusion 试剂盒将这2个扩增片段拼接到PVX载体Sma I多克隆位点,并转化大肠杆菌。菌液PCR鉴定结果表明：PVX载体均插入了预期大小的外源片段VPg-Tu和VPg-AR（图2）。进一步测序结果显示,插入的目标序列正确,阅读框架无误,说明成功构建了pPVX-VPg- AR和pPVX-VPg-Tu载体。
图2 pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu重组载体构建菌液PCR鉴定M：DL 2000 Marker;1：阳性对照（模板为PVX载体的质粒）;2：阴性对照（ddH2O）;3：pPVX-VPg-Tu菌液;4：pPVX-VPg-AR菌液。 Fig. 2 Identification of pPVX-VPg-AR and pPVX-VPg-Tu vector by colony PCR M: DL 2000 Marker; 1: Positive control (pgR107); 2: Negative control (ddH2O); 3: PVX-VPg-Tu colonies; 4: PVX-VPg-AR colonies. |
2.2 PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu感染本生烟后的病症特点
利用农杆菌渗透注射技术,将分别含有重组的PVX病毒载体PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的农杆菌渗透缓冲液注射到4~5叶期的本生烟植株叶片,PVX-CP-AR和PVX为对照。接种7 d后发现：在接种PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的植株上新长出的新叶分别出现了轻微的叶片卷曲,叶面突起与凹陷的现象,而对照PVX-CP-AR和PVX侵染的植株则无病症出现。接种l4 d后开始,感染PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的植株都表现出严重的叶畸形和叶片皱缩病症,而侵染了PVX-CP-AR和PVX的植株系统叶片仅出现轻微卷曲症状;接种23 d后,感染PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的本生烟系统叶片部分区域褪绿并产生严重坏死现象,而对照被PVX-CP-AR和PVX侵染的烟草幼苗植株的病症则只是叶片卷曲和皱缩（图3）。因此,PVX介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白的表达诱导了本生烟坏死病症产生。
2.3 VPg-AR和VPg-Tu mRNA的RT-PCR鉴定
分别提取感染PVX-VPg-Tu、PVX-VPg-AR、PVX-CP-AR和PVX植株叶片总RNA进行RT-PCR检测,结果表明：与接种PVX对照植株样品相比,利用VPg-Tu、VPg-AR和CP-AR基因特异引物都能在对应的样品中检测到预期大小的特异条带（576、627、942 bp）,表明PVX载体介导了VPg-AR和VPg-Tu的mRNA在本生烟中表达（图4）。
图4 本生烟中VPg-AR和VPg-Tu mRNA的RT-PCR鉴定M：DL2000 DNA Marker;1：感染PVX-VPg-Tu本生烟;2：PVX-VPg-Tu质粒;3：阴性对照（ddH2O）;4：感染PVX-VPg-AR本生烟;5：PVX-VPg-AR质粒;6：阴性对照（ddH2O）;7：感染PVX-CP-AR本生烟;8：PVX-CP-AR质粒;9：阴性对照（ddH2O）;10：感染PVX本生烟;11：PVX质粒;12：阴性对照（ddH2O）。 Fig. 4 Identification of VPg-Tu and VPg-AR mRNA by RT-PCR M: DL2000 DNA Marker; 1: PVX-VPg-Tu-infected N. benthamiana; 2: PVX-VPg-Tu plasmid; 3: Negative control (ddH2O); 4: PVX-VPg-AR-infected N. benthamiana; 5: PVX-VPg-AR plasmid; 6: Negative control (ddH2O); 7: PVX- CP-Tu-infected N. benthamiana; 8: PVX-CP-AR plasmid; 9: Negative control (ddH2O); 10: PVX-infected N. benthamiana; 11: PVX plasmid; 12: Negative control (ddH2O). |
2.4 VPg-AR和VPg-Tu重组蛋白Western blot分析
通过提取感染了PVX-VPg-AR、PVX-VPg- Tu、PVX-CP-AR和PVX的本生烟总蛋白,经Strep-Tactin®XT High Capacity亲和层析柱纯化融合Strep标签的CP-AR、VPg-AR和VPg-Tu重组蛋白,层析产物的Western blot分析发现：在感染了PVX-CP-AR、PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu的本生烟里分别检测到了预期大小的CP-AR（35.82 kDa）VPg-AR（27.17 kDa）和VPg-Tu（24.96 kDa）蛋白条带,表明PVX载体成功介导了VPg-AR和VPg-Tu在本生烟中的表达（图5）。
图5 VPg-AR和VPg-Tu重组蛋白Western blot分析M：蛋白分子标准;1：感染了PVX的本生烟总蛋白亲和层析产物;2：感染了PVX-CP-AR的本生烟总蛋白亲和层析产物;3：感染了PVX-VPg-AR的本生烟总蛋白亲和层析产物;4：感染了PVX-VPg-Tu的本生烟总蛋白亲和层析产物。 Fig. 5 Western blot analysis of expression of VPg-AR and VPg-Tu in N. benthamiana plants infected with PVX-VPg-Tu or PVX-VPg-AR M: Standard of protein molecular; 1: Affinity chromatography products from N. benthamiana plants infected with PVX; 2: Affinity chromatography products from N. benthamiana plants infected with PVX-CP-AR; 3: Affinity chromatography products from N. benthamiana plants infected with PVX-VPg-AR; 4: Affinity chromatography product from N. benthamiana plants infected with PVX-VPg-Tu. |
2.5 PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu感染本生烟诱导ROS的大量积累
图6 DAB染色检测分别感染PVX-VPg-AR和PVX-VPg-Tu本生烟中活性氧积累Fig. 6 Identification of accumulation of reactive oxygen species (ROS) in N. benthamiana infected with PVX-VPg-AR or PVX-VPg-Tu using DAB staining The arrows show the areas of ROS accumulation. |
3 讨论
VPg蛋白在整个马铃薯Y病毒属中病毒间的序列相似性只有50%左右,除具有一个核定位信号（nuclearlocalization signal, NLS）和三磷酸核苷结合基序外,不存在明显的保守结构域或者基序[15]。VPg三维结构显示VPg本质上是一个杂乱无序的蛋白,正是这种结构的杂乱无序性,使得VPg蛋白具备了与其他蛋白结合的能力,从而在病毒侵染的过程中与各种病毒蛋白HCPro、CP、P1、P3等及寄主因子eIF4E、eIF（iso）4E、PABP等形成相互作用网络,以发挥多种不同的作用[16]。目前VPg研究的功能主要有：（1）参与病毒翻译过程。大量的研究发现马铃薯Y病毒属病毒编码的VPg与寄主植物eIF4E互作,可以降低eIF4E与寄主植物mRNA帽子结构结合的能力,使该核糖体更易与病毒RNA结合从而翻译病毒的蛋白;还有研究证明VPg通过与eIF4E的互作来增强翻译起始因子与TEV RNA的亲和性,从而促进无帽子结构的病毒RNA的复制和翻译,说明VPg是病毒侵染过程中的一个调节因子,它通过促进病毒RNA和翻译产物的积累来促进病毒的增值。（2）VPg参与病毒复制过程。VPg蛋白可以共价连接到病毒RNA的5′端,在马铃薯Y病毒属病毒复制过程中可能起到引物作用,从而起始病毒RNA的复制过程。（3）VPg影响病毒的移动。TuMV VPg能够与寄主编码的一种富含半胱氨酸的蛋白互作,将VPg中影响二者互作的关键位点进行突变然后将突变的病毒接种植物,结果发现病毒的胞间及系统移动受阻;此外,下调表达编码这个富含半胱氨酸蛋白的基因能够抑制病毒的系统侵染及病毒粒子的积累[3]。
本研究利用马铃薯X病毒载体PVX异源表达系统在本生烟中分别过量表达了TuMV和ANRSV VPg蛋白,结果发现VPg-AR和VPg-Tu的过量表达诱导本生烟产生叶片坏死病症[17]。进一步利用DAB和NBT染色法在坏死症状叶片中检测到ROS的大量积累。ROS是植物应对外界生物和非生物环境刺激的反应过程中产生的一个重要信号分子,主要包括,如超氧阴离子（O2-）、羟自由基（•OH）、过氧化氢（H2O2）等[18,19]。在正常情况下,植物体内的ROS处在一个较低水平,且ROS的代谢保持动态平衡,不会对植物产生伤害[20]。当植物遭受病原物感染胁迫时,ROS的积累超过抗氧化剂防护系统清除能力,就会产生氧胁迫损伤叶绿体、线粒体等细胞器,产生病征,严重时诱导细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）导致植物的严重伤害或死亡[21]。因此,VPg除在病毒复制、翻译和运动中发挥功能以外,可能还是一个病症决定因子,参与TuMV和ANRSV诱导的植物坏死症状形成。
已有研究表明,植物病毒诱导坏死症状与病毒基因和过氧化氢酶（catalase, CAT）互作有关[22]。CAT是植物遭受非生物胁迫时细胞内所产生的活性氧清除系统中的主要的抗氧化酶,可清除植物体内产生的H2O2,从而保护细胞不受伤害[23]。在被子植物中存在CAT1、CAT2和CAT3三种主要同工酶。CAT1主要负责清除光呼吸产生的H2O2,CAT2则清除氧化胁迫产生的H2O2,CAT3主要清除乙醛酸循环体中产生的H2O2[24]。研究发现黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）CMV-HL株系感染拟南芥后诱导产生的坏死病症与病毒2b蛋白可以与拟南芥CAT3相互作用有关,它们之间的互作影响了CAT3清除植物体内ROS的功能,从而导致了病毒诱导产生坏死病斑[21, 25]。相类似,番茄叶卷曲Palampur病毒（Tomato leaf curl Palampur virus, ToLCPalV）编码的AV2蛋白可以与本生烟CAT2相互作用,导致CAT2转录本的下调和活性氧（ROS）的积累,进而加速感染ToLCPalV的本生烟草出现系统性坏死病症[26]。本研究发现VPg可能是TuMV和ANRSV诱发坏死病症产生一个决定因子,因此后续将利用酵母双杂交和双分子荧光互补等方法研究TuMV和ANRSV VPg是否也与CAT存在互作关系,以解析VPg参与的病毒诱导症状形成机制。