琯溪蜜柚炭疽病的病原为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）,该菌在琯溪蜜柚整个生育期及果实采后均可为害[1]。目前,生产上防治该病主要依靠化学农药,从蜜柚抽发春梢开始至冬季清园结束,果农每隔20 d左右施用一次化学农药,大量使用化学农药不仅对生态环境和人畜健康造成危害,也导致果实农药残留和病原菌的抗药性逐年增加。因此,研究安全环保的病害防控方法对琯溪蜜柚的可持续生产具有重要意义。放线菌能产生抗生素及次生代谢产物,极具植物病害防控潜力,在植物病害防治中已得到有效的应用[2]。国内外已有柑橘炭疽病生防方面的相关报道,Lee等[3]研究发现,从八角茴香和荆芥中提取的精油能够抑制炭疽病菌的生长;汪茜等[4]研究了枯草芽孢杆菌1505菌株对柑橘采后炭疽病的防治效果,采用刺伤接种的防效为48.8%,自然发病的防效为46.3%;刘冰等[5,6]筛选到一株放线菌ML27菌株对柑橘炭疽病菌的抑制率为72.15%;汪文强等[7]利用烟管菌发酵液对柑橘炭疽病菌的抑菌率达71.1%;袁红旭等[8]从柑橘果实中分离到14株内生细菌可降低柑橘果实炭疽病的发病率;纪兆林等[9]分离到的地衣芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌对柑桔炭疽病菌菌丝有明显的抑制作用,可延缓柑桔采后炭疽病的发生;黄艳等[10]利用壳寡糖诱导柑橘果实中活性氧的变化来降低炭疽病的发病率。但是在柑橘属农产品上,尚未发现能抑制炭疽病菌达12 h以上的生物杀菌剂[11]。目前有关琯溪蜜柚炭疽病生物防治的研究报道较少。因此,本研究以琯溪蜜柚炭疽病菌作为靶标菌,从福建省漳州市不同地区的土壤中分离筛选生防效果较好的拮抗放线菌菌株,旨在为该病的生物防治提供更多的微生物资源。
1 材料与方法
1.1 材料
供试病原菌：琯溪蜜柚炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、琯溪蜜柚黑点病菌（Diaporthe citri）、琯溪蜜柚黑斑病菌（Phyllosticta citriasiana）、香蕉枯萎病菌4号小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, race 4）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum Schl. f. sp. vasinfectum）、水稻恶苗病菌（F. moniliforme）、玉米穗腐病菌（F. porliferatum）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、黄瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucurmerinum）、番茄枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）,由本研究室分离、鉴定、致病性测定及保存;番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）、多肉黑斑病菌（Alternaria alternata）、榕树炭疽病菌（C. gloeosporioides）、兰花茎腐病菌（F. oxysporum）,由福建省农业科学院植物保护研究所馈赠。供试土样采自福建省漳州市龙文区、芗城区、南靖县、平和县、云霄县、诏安县等地,共25份。
供试药剂：70%丙森锌可湿性粉剂,由拜耳作物科学（中国）有限公司生产,为果农防治琯溪蜜柚炭疽病常用药剂。
1.2 方法
1.2.1 放线菌的分离、纯化 采用稀释涂布分离法[12]分离放线菌。将土样置于通风干燥处自然风干,称取5 g土壤倒入放有灭菌玻璃珠的50 mL无菌水中,置于振荡培养箱（BS-1振荡培养箱,金坛市鸿科仪器厂）振荡30 min后,吸取1 mL混悬液,用无菌水梯度稀释,分别吸取10-4、10-5、10-6稀释液0.1 mL均匀涂布在高氏一号琼脂平板上,后置于28 ℃生化培养箱（上海培因实验仪器有限公司）中培养,挑取培养性状不同的单菌落转入高氏一号培养基上纯化培养,纯化3次后,置于4 ℃冰箱中保存,备用。
1.2.2 拮抗放线菌的筛选 发酵液制备[2]：将100 mL高氏一号液体培养基加入250 mL三角瓶中,121 ℃高压灭菌30 min,待冷却后接入4 mm的菌饼（从1.2.1中纯化保存的放线菌）5块,于28 ℃、150 r/min振荡培养7 d,在无菌条件下将发酵液吸到灭菌离心管中,8 000 r/min离心30 min,吸取上清液,置于-20 ℃冰箱中备用。
拮抗菌的筛选：采用平板对峙法[13]对1.2.1中所分离到的放线菌进行抑菌活性筛选,靶标菌为琯溪蜜柚炭疽病菌。
抑菌谱测定：采用菌丝生长速率法[12]测定1.2.1节筛选获得的强活性菌株对供试病原真菌的抑菌能力。
孢子萌发抑制试验：将稀释10倍的菌株FX28（1.2.1筛选获得的强活性菌株）发酵滤液和病菌孢子悬浮液滴入凹玻片中,置于28 ℃恒温培养箱保湿培养,设空白发酵液与无菌水的混合液作为对照。分别于12 h和24 h观察病菌孢子的萌发情况[14]。
1.2.3 防治效果测定 取新鲜琯溪蜜柚幼果,用75%酒精表面消毒,无菌水冲洗3次,采用刺伤接种的方法,取菌株FX28发酵上清液5 mL均匀涂抹于幼果伤口及其周围果面,涂抹后放入塑料盒置于28 ℃恒温箱中。24 h后在伤口处接种20 µL炭疽病菌孢子液（105个孢子/mL）,接种后放入塑料盒（相对湿度约90%）置于28 ℃恒温箱,测定菌株FX28的预防效果;将炭疽病菌孢子液20 µL接种于幼果伤口及其周围,24 h后在伤口处及其周围涂抹5 mL发酵上清液,测定菌株FX28的治疗效果。设70%丙森锌300倍液为药剂对照,设无菌水为空白对照,每处理15个果实,重复3次。接种后每天观察1次,计算病情指数和防治效果。果实发病程度分级标准参照汪茜等[5]的方法。
$烂果率=\frac{腐烂果数}{总果数}×100%$
$病情指数=\frac{\sum(各级腐烂果数×该级代表值)}{总果数×最高级代表值}×100$
$防效=\frac{对照病情指数-处理病情指数}{对照病情指数}×100$
1.2.4 FX28菌株的鉴定 形态特征观察：采用插片法,待菌丝长上盖玻片后,取菌丝生长适中的盖玻片置于光学显微镜下,观察FX28菌株气生菌丝、基内菌丝、孢子丝和孢子的形态特征[15]。
分子生物学鉴定[13, 17]：采用细菌基因组提取试剂盒提取菌体总DNA,以Ezup柱式抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]和细菌通用引物27F: 5°-AGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3°和1492R: 5°-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3°,由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL PCR反应体系：Taq PCR Master Mix 12.5 μL,模板DNA 2 μL（100 ng/μL）,10 μmol/L引物各1 μL,加ddH2O至总体积达25 μL,阴性对照用ddH2O代替模板DNA。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃修复延伸10 min,于4 ℃下保存。在含有GelRed染料的1%琼脂糖凝胶中回收扩增产物条带,经连接、转化和鉴定后,阳性克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测定的基因序列登录NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对,并从GenBank数据库获得相关分离物的16S rDNA序列,然后用邻位加入法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树。
1.3 数据处理
采用Excel软件整理实验数据,采用DPS软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 拮抗放线菌初筛
表1 16株放线菌对琯溪蜜柚炭疽病菌菌丝生长的抑制作用Tab. 1 Inhibiting effect of 16 actinomycete strains against C. gloeosporioides |
| 菌株 Strain | 抑菌带 Inhibition zone/mm | 菌株 Strain | 抑菌带 Inhibition zone/mm |
|---|---|---|---|
| FX2 | 13.3±0.3d | FX40 | 14.0±0.5c |
| FX8 | 12.1±0.7f | FX45 | 12.5±0.2e |
| FX10 | 12.1±0.6ef | FX53 | 12.5±0.1e |
| FX15 | 12.6±0.2e | FX76 | 13.2±0.3d |
| FX22 | 12.3±0.1ef | FX80 | 13.7±0.4cd |
| FX28 | 15.3±0.3a | FX81 | 14.7±0.4b |
| FX32 | 12.3±0.4ef | FX95 | 12.3±0.2ef |
| FX39 | 13.7±0.1cd | FX100 | 12.5±0.2e |
注：表中数据为平均值±标准差;同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Data in the table are mean ± SD. Different lowerwase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.2 活性菌株FX28的抑菌谱
抑菌谱测定结果表明,菌株FX28对14种供试病原真菌均有不同程度的抑制作用,其中对琯溪蜜柚炭疽病菌、辣椒枯萎病菌和番茄叶霉病菌作用最强,抑制率达85.8%以上;对榕树炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的抑制率分别为74.9%、75.0%、75.0%;对水稻恶苗病菌、玉米穗腐病菌、辣椒疫霉病菌的抑制作用相对较弱,抑制率在23.7%~30.8%之间;且菌株FX28对不同病原菌的抑制作用存在显著差异（表2）。
表2 活性菌株FX28发酵液对14种病原真菌的抑菌活性Tab. 2 Inhibition activity of FX28 against 14 species of pathogens |
| 病原菌 Pathogen | 抑制率 Inhibition rate/% |
|---|---|
| 琯溪蜜柚炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides | 86.4±0.9a |
| 蜜柚黑点病菌Diaporthe citri | 62.4±4.5d |
| 蜜柚黑斑病菌Phyllosticta citriasiana | 60.9±2.4d |
| 番茄枯萎病菌 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici | 75.0±1.2b |
| 辣椒枯萎病菌 F. oxysporum Schl. f. sp. vasinfectum | 85.9±0.8a |
| 黄瓜枯萎病菌 F. oxysporum f. sp. cucurmerinum | 75.0±1.5b |
| 香蕉枯萎病菌 F. oxysporum f. sp. cubense, race 4 | 60.2±2.0d |
| 水稻恶苗病菌F. moniliforme | 30.8±3.4e |
| 玉米穗腐病菌F. porliferatum | 23.7±0.5f |
| 辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici | 30.5±2.6e |
| 番茄叶霉病菌Fulvia fulva | 85.8±2.2a |
| 多肉黑斑病菌Alternaria alternata | 69.5±4.2c |
| 榕树炭疽病菌C. gloeosporioides | 74.9±1.2b |
| 兰花茎腐病菌F. oxysporum | 60.9±3.4d |
注：表中数据为平均数±标准差;同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Data in the table are mean ± SD. Different lowerwase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.3 菌株FX28对琯溪蜜柚炭疽病菌的抑菌效果
2.3.2 菌株FX28对琯溪蜜柚炭疽病菌孢子萌发的抑制作用 孢子萌发抑制结果表明,培养12 h后,对照的炭疽病菌孢子萌发率为91.7%,菌株FX28发酵液处理的孢子萌发率为0,抑制率为100%;24 h后,对照炭疽病菌孢子全部萌发,菌株FX28发酵液处理的孢子少量萌发,萌发率为3.0%,抑制率为97.0%（图3）。
2.4 菌株FX28对琯溪蜜柚炭疽病的防治效果
预防作用测定结果表明,对照大部分果实腐烂,烂果率为91.1%,病情指数为50.1;菌株FX28发酵液处理的果实烂果率为20.0%,病情指数为8.2,其预防效果为83.8%;70%丙森锌处理的预防效果为85.7%,略高于菌株FX28发酵液处理。治疗作用测定结果表明,菌株FX28发酵液处理的果实烂果率为28.9%,病情指数为14.1,其治疗效果为71.1%,略低于70%丙森锌处理,处理间无显著差异（表3）。但随着时间延长,对照果实的腐烂面积逐渐扩大,而感病果实经菌株FX28发酵液和70%丙森锌处理后,果实腐烂面积没有继续扩大。
表3 拮抗菌FX28发酵液对琯溪蜜柚炭疽病的防治效果Tab. 3 Control effect of fermented broth about FX28 against C. grandis anthracnose disease |
| 处理 Treatment | 预防作用Preventive effect | 治疗作用Curation effect | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 烂果率 Fruit rot incidence/% | 病情指数 Disease index | 预防效果 Preventive effect/% | 烂果率 Fruit rot incidence/% | 病情指数 Disease index | 治疗效果 Curation effect/% | |
| 菌株FX28 | 20.0±6.7b | 8.2±0.7b | 83.8±1.5a | 28.9±3.9b | 14.1±0.7b | 71.1±0.8a |
| 70%丙森锌 | 17.8±3.9b | 7.2±0.4b | 85.7±0.9a | 24.5±3.9b | 13.1±0.4b | 72.9±1.7a |
| 对照 | 91.1±3.9a | 50.1±2.6a | 91.1±3.9a | 50.1±2.6a | ||
注：表中数据为平均数±标准差;同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Data in the table are mean ± SD. Different lowerwase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.5 菌株FX28的分类鉴定
图4 菌株FX28的形态特征A：气生菌丝和孢子丝（箭头表示螺旋孢子链）;B：孢子。 Fig. 4 Morphology of strain FX28 A: Mycelial in air and mycelial formed by spores (Arrows indicate spiral spore chains); B: Spore. morphology |
表4 菌株FX28的培养特征Tab. 4 Cultural characteristics of strain FX28 |
| 培养基 Medium | 气生菌丝 Aerial mycelium | 基内菌丝 Substrate mycelium | 可溶性色素 Soluble pogment | 丰茂度 Abundance |
|---|---|---|---|---|
| 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 | 紫红色 | 暗红色 | 浅黄粉色 | 生长旺盛 |
| 高氏一号琼脂培养基 | 鲜艳粉 红色 | 深粉红色 | 紫红色 | 生长旺盛 |
| 无机盐淀粉琼脂培养基 | 深粉红色 | 中等粉红色 | 浅粉色 | 生长旺盛 |
| 察氏琼脂 培养基 | 粉白色 | 浅紫红色 | 浅紫色 | 生长良好 |
| 甘油-天门冬酰胺琼脂 | 强烈红色 | 鲜艳 粉红色 | 浅粉色 | 生长旺盛 |
| 燕麦粉琼脂培养基 | 浅粉色 | 浅黄粉色 | 浅粉色 | 生长良好 |
| 葡萄糖天门冬素培养基 | 肉粉色 | 粉色 | — | 生长良好 |
| 酵母膏麦芽膏琼脂培养基 | 暗红色 | 深红色 | — | 生长旺盛 |
注：“—”表示无可溶性色素。 | |
Note: “—” indicates no soluble pigment. |
2.5.2 生理生化特性 研究结果表明,菌株FX28可以利用甘油、蔗糖、麦芽糖、肌醇、葡萄糖、D-阿拉伯糖、鼠李糖、D-甘露醇、α-半乳糖、D-木糖作为碳源生长,不能利用棉子糖、D-果糖。可利用L-赖氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸、L-色氨酸作为氮源生长,不能利用L-谷氨酸。能使淀粉水解、明胶液化、牛奶凝固而不胨化,不能使硝酸盐还原、纤维素和色氨酸分解,也不能产生H2S和黑色素。
2.5.3 16S rDNA序列分析 FX28菌株PCR扩增得到1条约1295 bp的条带。FX28菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源性比对,发现FX28菌株与深红紫链霉菌（Streptomyces violaceorubidus）的同源性最高,相似度在99%以上。选择与菌株FX28同源性较高的10株菌构建系统发育树（图5）,结果表明,菌株FX28的16S rDNA序列与深红紫链霉菌（S. violaceorubidus）NR 042309.1聚在一个分支,亲缘关系最近,结合菌株FX28的形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果,初步确定菌株FX28为深红紫链霉菌（S. violaceorubidus）。
3 讨论
琯溪蜜柚炭疽病不仅在田间引起果实腐烂,而且在贮藏过程中,对琯溪蜜柚的危害也很严重。目前,琯溪蜜柚炭疽病的防治主要采用化学杀菌剂,而化学杀菌剂对人畜的毒副作用和残留问题至今难以有效解决。生物防治对环境友好,且病害不易产生抗药性,是植物病害防治的发展趋势。目前,生产上用于防治病害的农用抗生素中大部分是由链霉菌属（Streptomyces）产生[18]。研究结果表明,菌株FX28对琯溪蜜柚炭疽病菌菌丝具有较强的抑制作用,该菌株属链霉菌属,通过培养特征、形态特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析等,初步确定该菌株为深红紫链霉菌（S. violaceorubidus）。该菌株对供试的大部分病原真菌均有较强的抑制活性,能否作为农用抗生素的新来源,还需进一步研究。另外,从应用生防菌的角度而言,需优化该菌株的培养条件,特别是产生抗菌代谢物的培养条件。
目前,国内外已有深红紫链霉菌的相关报道,周璇[19]研究发现深红紫链霉菌具有较强的有机物分解功能,可影响红壤微生物的数量,提高红壤呼吸速率的峰值。甘龙站等[20]分离到一株具有极强的抗癌、抗糖尿病活性及中等抗菌活性的深红紫链霉菌。Asmaa等[21]从污水处理系统中分离到3株深红紫链霉菌,可抑制污水中的病原体。Adeline等[22]从油棕的空果壳堆肥中分离到一株能加快堆肥速度且抑制灵芝属（Ganoderma）致病菌的深红紫链霉菌。Wadetwar等[23,24]从印度那格浦尔（Nagpur）地区土壤中分离到一株深红紫链霉菌,对其发酵工艺优化后可大规模生产胞外抗生素。而深红紫链霉菌应用于防治果树病害尤其是琯溪蜜柚炭疽病的研究未见相关报道。本研究分离得到的深红紫链霉菌菌株生长繁殖速度快,抑菌谱广,对琯溪蜜柚炭疽病菌菌丝的抑制率达86.4%,24 h后对孢子的萌发抑制率为97.0%。吴思梦等[14]用黄色链霉菌发酵液对柚子炭疽病孢子萌发抑制率为61.54%。研究发现深红紫链霉菌的抑菌作用机制表现为菌丝分枝增多、变粗、顶端膨大、扭曲、易断裂,且菌丝内原生质凝聚,细胞内含物紊乱,与前人研究结果一致[13]。深红紫链霉菌发酵上清液对琯溪蜜柚炭疽病的预防效果和治疗效果分别为83.8%和71.1%,而汪茜等[4]用生防细菌防治柑橘采后炭疽病的防效为48.8%。后续将对深红紫链霉菌在田间的定殖能力、适应性、稳定性以及防治效果等相关方面进行研究。目前国内外未见深红紫链霉菌用于琯溪蜜柚炭疽病防治方面的相关报道。因此,以深红紫链霉菌为菌源开发用于防治琯溪蜜柚炭疽病的新型生防制剂及生物有机肥具有良好的发展前景。