多花指甲兰（Aerides rosea）为兰科（Orchidaceae）指甲兰属附生草本植物,花型奇特,状似“狐尾”,花序密集,花大部白色,稍有紫色点缀其间,观赏价值高[1]。更重要的是,多花指甲兰极具芳香,独特的芳香性状也是多花指甲兰的重要价值之一。其含有醛类、芳香族类、酯类、酮类以及萜类化合物等多种挥发性物质,可广泛应用于化妆品、美容等行业[2],近年,一家日本公司公布了其香水专利,构成其产品成分的一种主要香味物质便来自于此[3]。同时,多花指甲兰也是重要的药用兰花,在印度东北部当地部落居民有使用指甲兰属植物治疗常见疾病的习俗,孟加拉国和泰国也有相关报道[4],国内研究人员也发现指甲兰属植物有作为抗癌药物潜能[5]。多花指甲兰不仅拥有花型、花色和香味等众多优良性状,是不可多得的优秀亲本资源[6],而且在医药业、化工业也广泛运用,具有重大开发潜能。多花指甲兰常附生于乔木上,由于过度的资源开采、旅游开发等生态破坏行为,以及对其附生树种的乱砍滥伐、野生植物非法贸易,导致多花指甲兰野生种群的生存面临极大威胁。CITES（《濒危野生动植物种国际贸易公约》）将指甲兰属的所有种列入其附录Ⅱ的保护对象。我国也将其列入国家重点野生植物保护名录（第二批次）。我们应积极对其采取相关保护措施[6]。但由于种质资源匮乏等原因,国内目前较少见到多花指甲兰的相关报道,花粉形态观察和花粉活力测定以及柱头可授性更是鲜有报道,还有极大的挖掘空间。
花粉和柱头具有较高的活性是杂交育种成功的关键,目前,国内外主要使用花粉染色法和花粉离体培养测定花粉活力。常见染色方法有醋酸洋红染色法、I2-IK染色法和TTC染色法。据文献报道,最符合真实值的方法为TTC染色法[7,8,9];而花粉离体培养是最能反映真实值的方法[10]。柱头可授性均利用联苯胺-过氧化氢法测定[11]。当前,仅有少数研究人员以市场上常见的几种兰花为材料进行了花粉形态、花粉活性以及柱头可授性的研究。褚怡等[11]研究了大花蕙兰和几种国兰的花粉活力和柱头可授性,喻兰等[12]对蝴蝶兰的花粉活力和柱头可授性进行了测定。罗远华等[13]以20个文心兰种质为材料,对花粉活力进行测定。这些研究明确了各材料最佳的授粉时机,为兰花的杂交育种、引种栽培提供了理论指导。本文在前人的基础上对多花指甲兰的花粉形态、花粉活力以及柱头可授性开展研究,以期为多花指甲兰的杂交引入、迁地保护以及后续的应用开发提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
材料来源于云南省澜沧县（99°29′ E~ 100°35′ E、22°01′ N~23°16′ N之间）,为野生种,目前种植于海南大学育苗基地（20°03′ N,110°19′ E）。使用试剂为氯化三苯基四氮唑（TTC）、I2-KI以及醋酸洋红染液。试验器材为镊子、解剖针、解剖刀、盖玻片、载玻片、10 mL离心管、恒温培养箱、光学显微镜（BA210-T）等。
1.2 方法
1.2.1 多花指甲兰花粉电镜扫描 采集花蕾期、盛花期、衰败期的多花指甲兰花粉（图1）,经离子溅射仪喷金后,置于场发射扫描电子显微镜下观察（S-4800）。选取各时期花粉在30×、100×、500×的视野下观察并对各开花时期花粉块的形态结构进行拍照记录。
1.2.4 柱头可授性检测 用联苯胺-过氧化氢法测定多花指甲兰柱头活性。联苯胺-过氧化氢反应液用1%联苯胺:3%过氧化氢:水=4:11:22配制,现配现用。取不同开花时期的新鲜雌蕊柱头,放入培养皿中,加入检测液使之没过柱头,反应10 min。在体视显微镜下观察气泡产生情况以及柱头变色情况。
1.3 数据处理
数据采用Microsoft office 2010及GraphPad Prism 8分析软件进行分析作图。
2 结果与分析
2.1 多花指甲兰花粉电镜扫描结果
图2 花蕾期花粉块与花粉粒的扫描电镜形态Fig. 2 Bud stage pollinium and grains under scanning electron microscope |
图3 盛花期花粉块与花粉粒的扫描电镜形态Fig. 3 Full-bloom stage pollinium and grains under scanning electron microscope |
图4 衰败期花粉块与花粉粒的扫描电镜形态Fig. 4 Decline stage pollinium and grains under scanning electron microscope |
表1 多花指甲兰花粉块与花粉粒不同开放时间的直径大小Tab. 1 Diameters of pollinium and pollen grains of A. rosea |
| 开放时间Flowering time/d | 花粉块平均直径Average diameter of pollen block/mm | 花粉粒平均直径 Average diameter of pollen grains | |
|---|---|---|---|
| 横径Transverse diameter/μm | 纵径Longitudinal diameter/μm | ||
| 花蕾期 | 0.881 | 32.544 | 22.740 |
| 盛花期 | 0.762 | 23. 910 | 15.255 |
| 衰败期 | 0. 667 | 16.020 | 8. 814 |
2.2 不同开花时期花粉的活力测定
研究发现,多花指甲兰最佳染色时长为12 h。实验结果表明,TTC染色液和醋酸洋红染色效果最接近离体萌发结果,而I2-KI染液会使整个视野变红,不利于观测;开花4~6 d的花粉染色效果最好,颜色最深,染色率最高（图5）,花蕾期染色较浅,呈粉红色,且染色数目较少,开花10 d的花粉几乎无法染色,染色极浅。整个花期花粉活力先上升到达最高值,之后下降,呈先升后降趋势。
2.3 不同开花时期柱头可授性研究结果
利用联苯胺-过氧化氢法测定多花指甲兰柱头可授性（表2）,结果显示3个时期的柱头在检测液中均冒出气泡,其中盛花期过氧化氢酶含量最高,气泡量最大,冒出最迅速,可授性最强。花蕾期次之;衰败期最少最缓慢,可授性最弱;但3个时期的柱头均未变色。
表 2 不同开花时期多花指甲兰柱头可授性检测Tab. 2 A. rosea stigma receptivity detection |
| 开花时间 Flowering time | 花蕾期 Bud stage | 盛花期 Full bloom period | 衰败期 Decline period |
|---|---|---|---|
| 可授性 | ++ | + |
注：“+”柱头具有可授性;“++”柱头具有较强可授性;“”柱头具有最强可授性。 | |
Note: “+”stigma have receptivity; “++”stigma have higher receptivity; “”stigma have highest receptivity. |
3 讨论
花粉为植物的生殖细胞,它能反映物种演化的一般规律,花粉的性状相对稳定,其微观态结构具有种间特异性,是植物分类的重要依据之一[17,18,19,20]。兰科植物花粉不同于其他植物,兰科植物花粉由成千上万的花粉粒通过类脂质集合而成。花粉粒由四分体组成的,四分体是构成花粉的基本单位。不同种属兰花花粉形态、表面纹饰不一。如蝴蝶兰花粉块为梨形,中间有大缝隙,花粉块可分为两半[12];杓兰属花粉表面都有圆形凹陷,外壁结构呈光滑或褶皱状[21]。多花指甲兰花粉近球形,表面具裂隙,无纹饰,类似蜂巢,未见萌发孔。由于花粉粒结合紧密,相互挤压,花粉粒呈不规则状。随着开花时间的延长,花粉粒粘合得更加紧密,花粉团体积也相应变小。花粉活性与柱头可授性是影响杂交结实率的关键因素,本研究发现,花粉染色在开花4~6 d效果最好,花蕾期次之,衰败期几乎无法染色。花粉活性与自身遗传特性有关,罗远华等[13]研究发现不同的文心兰种质花粉活力不同。同时还与环境温度、花期长短等多种因素有关,且兰花花粉团是由花粉粒依靠类脂质聚合而成的,分离困难,一定程度上增加了实验难度。结果表明,最接近真实值的花粉染色方法为TTC染色法和醋酸洋红染色法,I2-KI的测量值远大于其他3种方法。这是由于I2-KI是根据花粉粒积累淀粉的量来判断花粉活力,而三核期退化的花粉已有淀粉积累,遇碘呈蓝色反应另外,含有淀粉而被杀死的花粉粒遇I2-KI也呈蓝色,因此,此法不能准确表示花粉的活力。
开花10 d以后TTC染液和醋酸洋红染液几乎无法将花粉染色,而花粉萌发率依然较高,这很可能是因为开花后期花粉粒结合过于紧密,类脂质阻碍了染色液的进入,导致染色困难。兰花花粉属于二核型花粉,有厚实的外壁,寿命很长,易于保存[17],不会轻易失活。兜兰、蝴蝶兰等花粉活力均表现为先上升后下降的趋势[4,12],这与我们的研究结果一致。柱头可授性的结果显示多花指甲兰开花5 d可授性最好,但3个时期的柱头在检测液中均未变色,该现象在其他植物中也有出现,如苏芸芸[22]用同种方法研究了藿香的柱头可授性,亦只见气泡,未见柱头变色。多花指甲兰花粉活力最高时期与柱头可授性时期一致,可选择开花4~6 d时对多花指甲兰进行人工授粉。