胡椒（Piper nigrum Linn.）是一种经济价值极高的食品香料作物,是海南省第三大经济作物。胡椒瘟病具有极强的毁灭性和传播性,在20世纪70年代曾导致中国胡椒种植面积缩减20%,其病原物是辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）[1,2]。2009—2010年对我国胡椒主产区海南省胡椒病害发生情况调查发现,胡椒瘟病在海南省11个胡椒主要种植市（县）均普遍发生、危害严重[3,4],而且最近几年胡椒瘟病呈现蔓延加重趋势,是影响胡椒产业稳定发展的重要瓶颈之一。
孢子囊和游动孢子是P. capsici的再侵染源,可以通过气流和水流快速传播,造成病害蔓延流行。孢子囊的产生不仅是P. capsici在田间发生流行的关键前提,也是实验室科学研究的重要基础,尤其在侵染致病、遗传操作等相关研究上至关重要。在国外,P. capsici的孢子囊诱导技术报道较多,主要是在V8蔬菜汁培养基上黑暗培养后光照诱导孢子囊产生[5,6,7]。在国内,除了V8蔬菜汁培养基,黑麦培养基、大豆培养基、胡萝卜培养基等也被用于诱导P. capsici孢子囊[8,9,10,11],其诱导条件也不仅限于单独光照,兰成忠等[12]在光照诱导的基础上提出了抹伤诱导;但是未见研究胡椒瘟病病原菌孢子囊诱导技术的相关报道。受限于孢子囊诱导技术,目前胡椒瘟病的致病性接种也主要采用菌丝块伤口接种方法[13,14],尚未使用与P. capsici自然侵染一致的游动孢子接种法[6]。国内外通过光学显微镜、电子显微镜等手段研究发现P. capsici的孢子囊形态主要是倒洋梨形,也常见卵形、长卵形、球形、不规则形等性状[15,16,17,18],但是对其孢子囊发育及其内部游动孢子发育过程尚未见报道。
本研究在前人研究的基础上,分析不同诱导条件下胡椒瘟病菌孢子囊的产生情况,并通过光学显微镜和共聚焦显微镜进一步观察孢子囊和游动孢子的发育过程,从微观角度揭示胡椒瘟病菌的形态特征,为胡椒瘟病致病机制等相关研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 胡椒瘟病菌由本研究室从胡椒病株中分离纯化得到,于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）试管斜面培养基中室温保存。
1.1.2 培养基 胡椒瘟病菌保藏及活化使用PDA培养基：马铃薯200 g,切成小块,在800 mL去离子水中煮沸15 min,用双层纱布过滤,滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20 g,用去离子水定容至1000 mL,121 ℃灭菌20 min[2]。
1.1.3 荧光染料 激光扫描共聚焦显微观察使用2种荧光染料：（1）4°,6-二脒基-2-苯基吲哚(4°,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI),能够与双链DNA结合,在波长330~405 nm的紫外光下激发出波长461 nm的蓝光;（2）苯乙烯染料(N-(3- Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) phenyl) hexatrienyl) Pyridinium Dibromide, FM®4- 64FX),能够结合细胞质膜,在波长510~570 nm的绿光下激发出波长734 nm的红光,2种染料均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 胡椒瘟病菌孢子囊诱导 从保藏的试管斜面中挑取少量菌种转接入PDA培养基中,于28 ℃恒温培养箱中培养2 d,再次转接入新的PDA平板中,于28 ℃恒温培养箱中培养5 d,作为以下孢子囊诱导方法的出发菌种。
V8液体培养光照诱导：将胡椒瘟病菌接种在V8-A平板上,置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d,切成直径约1 cm的菌丝块浸入V8液体培养基中,28 ℃条件下暗培养7 d后,挑取菌丛用无菌去离子水清洗后浸入无菌去离子水中,在28 ℃条件下光照培养,24 h后开始取样,每隔12 h取样1次,做成临时装片,用光学显微镜检测孢子囊数量。
V8-A平板培养光照诱导：将胡椒瘟病菌接种在V8-A平板上,置于28 ℃恒温培养箱中暗培养7 d,然后在28 ℃条件下光照培养,24 h后开始取样,每隔12 h取样1次,用光学显微镜检测孢子囊数量。
V8-A平板培养光照和抹伤双重诱导：将胡椒瘟病菌接种在V8-A平板上,置于28 ℃光照生化培养箱中培养7 d,用无菌玻璃棒涂抹菌丝后再次置于28 ℃光照生化培养箱中培养,24 h后开始取样,每隔12 h取样1次,用光学显微镜检测孢子囊数量。
1.2.2 孢子囊光学显微镜观察 孢子囊数量分析：在载玻片上滴加无菌去离子水15 μL,挑取少量菌丝平铺于载玻片上,盖上盖玻片后置于奥林巴斯IX71倒置式显微镜载物台上,用200倍视野进行观察。每个处理设置3个样本重复,每个样本制作5个临时装片,镜检时选取菌丝分布均匀一致的视野利用cellSens Dimension软件统计单位面积（mm2）中的孢子囊数量。
孢子囊发育过程观察：在Φ15mm玻底培养皿中加入无菌去离子水50 μL,挑取少量菌丝放入培养皿中使菌丝平铺于玻底,四周放置吸足无菌水的脱脂棉保湿,盖上盖子后置于奥林巴斯IX71倒置式显微镜载物台上,用400倍视野利用cellSens Dimension软件进行观察并采集图像,每20 min采集一次,直至孢子囊成熟或游动孢子释放。
1.2.3 孢子囊染色及激光扫描共聚焦显微镜观察 细胞核酸的染色及其观察：DAPI染料用无菌去离子水配制成终浓度为10 mmol/L的母液,避光保存于-20 ℃冰箱中。将DAPI母液和无菌去离子水按照1∶5000体积稀释配置成染色液,染色液现配现用。挑取少量待检测菌丝浸入染色液中5 min,在无菌水中清洗3次后制成临时装片,置于Olympus Flv10智能激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。选取波长330~405 nm的激发光进行显微观察,使用Olympus Fluoview V4.2软件采集图像。
细胞膜染色及其观察：FM®4-64FX染料用无菌去离子水配制成终浓度为164 μmol/L的母液,避光保存于-20 ℃冰箱中。将FM®4-64FX母液和无菌去离子水按照1∶10体积稀释配置成染色液,染色液现配现用。挑取少量待检测菌丝浸入染色液中1 min,在无菌水中清洗3次后制成临时装片,置于Olympus Flv10智能激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。选取波长510~570 nm的激发光进行显微观察,使用Olympus Fluoview V4.2软件采集图像。
1.3 数据处理
采用SPSS 16.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）软件进行数据处理,采用单因素方差分析（one- way ANOVA）,费雪最小显著差异检验（Fisher’s least-significant difference test, LSD）（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 孢子囊诱导效果分析
分别采用3种不同的方法开展胡椒瘟病菌孢子囊诱导试验。显微镜下检测发现,3种诱导方法均能将胡椒瘟病菌诱导出大量孢子囊;其中V8-A平板培养光照和抹伤双重诱导方法（方法3）获得的孢子囊数量最多,其次是V8-A平板培养光照诱导方法（方法2）和V8液体培养光照诱导方法（方法1）,但是仅方法1和方法3之间有显著性差异（P<0.05）,其他处理间差异均不显著（表1）。
表1 3种不同方法诱导的孢子囊数量比较Tab. 1 Comparison of sporangia amounts induced by three different methods |
| 方法 Method | 培养基 Medium | 诱导方法 Induction methods | 孢子囊个数 Sporangia amounts per mm2 |
|---|---|---|---|
| 1 | V8 | 暗培养7 d后,光照2~3 d | 87.47±15.41a |
| 2 | V8-A | 暗培养7 d后,光照2~3 d | 101.72±18.33ab |
| 3 | V8-A | 全程光照培养,培养7 d后 抹伤处理,光照1~2 d | 122.00±21.35b |
注：同列中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column mean significant difference at the 0.05 level. |
2.2 孢子囊形态及其发育过程观察
图1 光学显微镜下孢子囊发育及其释放游动孢子过程A1~4：孢子囊发育过程;B1~4：孢子囊顶端继续发育成芽管;C1~4：孢子囊中的游动孢子释放过程。 Fig. 1 Sporangium development and zoospore releasing processes under light microscope A1-4: Sporangium development process; B1-4: Sporangia germinated directly and form a germ tube; C1-4: Zoospores released from sporangia. |
图2 共聚焦显微镜下孢子囊发育过程细胞核被DAPI染成蓝色,细胞膜被FM®4-64FX染成红色;A1~4：孢子囊内部被细胞膜分成多个小格;B1~4和C1~4：孢子囊小格中出现聚集的细胞核;D1~4：聚集的细胞核发育成众多的游动孢子。 Fig. 2 Sporangium development process under confocal microscope The nucleus dyed by DAPI stimulated blue light, the cell membrane dyed by FM ® 4-64FX stimulated red light; A1-4: The sporangium protoplast is separated into dozens of cells by the cell membrane; B1-4 and C1-4: Multiple nuclear DNA accumulated in the cells; D1-4: Many mononuclear zoospores formed in the matured sporangium. |
3 讨论
众所周知,常规培养条件难以获得大量的P. capsici孢子囊。近年来,P. capsici孢子囊诱导技术日渐成熟,已通过文献报道或者以专利形式公布了各种方法[8,9,10,11,12]。但是国内外研究的P. capsici菌株主要来源于温带的辣椒、茄子等作物,与来源于热带的胡椒瘟病菌在遗传学系统发育树上归属不同的分类亚群[19]。本研究将辣椒疫霉孢子囊诱导方式简单归为3类,即液体培养基中光照诱导、固体平板上光照诱导和固体平板上光照、抹伤双重诱导（表1）。研究发现使用V8或V8-A培养基培养时,3种诱导方法均可以获得大量的孢子囊,说明来源于热带的胡椒瘟病菌与温带的P. capsici在孢子囊诱导条件上差异不大。3种方法诱导的孢子囊数量分别为87.47、101.72和122.00个/mm2,总体差距不大,可约略视为同一水平;结合操作难易程度和易污染程度,建议开展遗传操作等研究时采用不易污染的液体培养基光照诱导方法,开展致病性接种等研究可采用易操作的其他2种方法。此外,在显微观察过程中发现,同一个玻片样本中的孢子囊发育进程并不完全一致,会出现不同发育阶段的孢子囊混杂的现象（尚未发表）;结合多次镜检结果,初步认为这3种方法中双重诱导法的孢子囊发育进程最整齐,但该结果还需要更多统计数据的支撑。
通过激光扫描共聚焦显微镜观察发现,胡椒瘟病菌孢子囊内部被膜结构分隔成数十个小格,然后在格子中累积成数倍于细胞核的DNA团,最后DNA团分散并发育成众多游动孢子（图2）。该结果在P. capsici中尚未见类似报道。陶恺报道的大豆疫霉（P. sojae）孢子囊内部同样是先由细胞膜将原生质体分隔成数十个彼此独立空间;而不同的是,每个独立空间只有一个细胞核,发育成单个游动孢子[22]。通过反复观察胡椒瘟病菌的孢子囊及其游动孢子的释放过程,发现每个孢子囊至少能释放出约200个游动孢子,远大于其膜结构分隔出的独立空间个数,认为胡椒瘟病菌的游动孢子发育过程与大豆疫霉可能存在差异（尚未发表）。但是,是否所有P. capsici的游动孢子发育过程均与胡椒瘟病菌一致,还需要后续更多的研究。
对于胡椒瘟病菌孢子囊发育的时间周期,本研究已做一些探索。通过显微镜对视野中的特定菌丝进行长时间定位监测发现,从菌丝末端膨大到发育成一个倒洋梨形的孢子囊大约需要8~12 h;但是完整监测一个孢子囊的发育全程难度极大,成功的样本数量不多,该结果还需要更多数据支撑。另外,监测到大量的孢子囊释放过程,发现该过程较为短暂,从游动孢子开始释放到孢子囊放空仅需要大约15~30 s;但是该过程受环境温度变化影响较大,迅速降温可将该过程缩短至10 s以内（尚未发表）。对于显微镜观察结果,值得注意的是,显微镜观测环境与孢子囊诱导环境、自然环境之间的差异可能影响观察结果。但是生动具体的微观观察结果对认识微生物形态变化都具有重要的指导意义。