植物细胞色素P450是一种加单氧氧化酶,可切割进入底物活性位点并与血红素铁结合的氧分子的双键断裂,将其中的一个氧原子添加到底物的氧化位点,使底物发生氧化[1,2]。植物P450蛋白能结合和催化分子体积不同、结构多样的底物,并能催化多种类型的化学反应,如烷基的羟化、烯基的环氧化、烃基的氧化、氮/硫/氧位的脱烷基化、氮位的羟化和氧化、硫位的氧化、氧化性脱氨、氧化性的碳碳键断裂等,因而也被称为万能的生物催化剂[3]。P450蛋白广泛参与植物特化化合物,如萜类、苯丙烷类及含氮化合物的合成和代谢过程[4],对这些次生代谢产物的结构多样性起关键作用[5]。苯丙烷的生物合成途径中,己报道的P450蛋白超过16个,如肉桂酸-4-羟化酶（C4H,CYP73）、类黄酮-3ʹ-羟化酶（F3ʹH,CYP73B）、类黄酮-3ʹ,5ʹ-羟化酶（F3ʹ5ʹH,CYP75A）、2-羟基异黄酮酶（IFS,CYP93C）、松柏醛-5-羟化酶（coniferylalcohol 5-hydroxylase,CYP84）等[1];萜类化合物生物合成中单萜（monoterpene）、倍半萜（sesquiterpenes）、双萜（diterpenes）、三萜（triterpenoids）等都可成为P450蛋白的底物,如拟南芥中CYP71A和CYP71R专一性地参与了单萜的代谢,CYP71AV、CYP71BA、CYP71BL、CYP706B参与倍半萜代谢,CYP71Z、CYP76M、CYP99A、CYP720B参与双萜代谢,CYP708A和CYP716A参与三萜代谢[1]。棕桐酸、油酸、亚油酸等长链脂肪酸的合成也有P450蛋白参与进行羟化反应[2, 6],表明P450蛋白在植物特化代谢中尤其是萜烯类、苯丙烷类的合成与转化的重要作用正在模式植物中得到逐步明晰。
茉莉花[Jasminum sambac (L.) Aiton]为福州市市花,属于木犀科素馨属灌木,原产于南亚和中亚地区[7]。茉莉花是福州传统名茶“茉莉花茶”窨制的香原[8],同时也是香料工业提取精油浸膏的重要原料[9]。茉莉花香气物质主要为单萜、倍半萜、苯丙烷/苯环类（benzenoids/phenylpropanoids）和其他微量物质[10,11]。尽管对于茉莉花的香气成分以及个别合成酶、水解酶有过诸多研究[12,13],也报道过栽培环境因素对花香的影响以及不同品种间的成分差异[14,15],但是有关茉莉花香气成分尤其是芳樟醇、乙酸苄酯等优势成分的代谢途径的了解并不全面。本研究基于前期茉莉花、叶转录组数据（GenBank登录号GHOY00000000）[16],获得若干在花朵中高量表达且与香气释放规律一致的P450基因。本研究选择其中一个表达量最高的P450序列（c61299_g1）,克隆其编码序列并且分析其时空表达模式,并了解其亚细胞定位并在酵母中进行异源表达,为其功能研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以三年生双瓣茉莉花为材料。选择刚开放不久的花朵用于基因编码序列克隆,选择第2天会开放的黄花苞、当天会开放的紧实白花苞、盛开的花朵（开放8 h）、衰老的花朵（开放36 h左右）、嫩叶、老叶、嫩茎等7种组织用于分析基因在不同组织中的表达水平（图1）。分析基因在花朵在开放过程中的表达水平时,从17：00（紧实白花苞）到第3天15：00（花朵衰老发紫）,每隔2 h采集花朵。所有样品用剪刀剪下后用铝铂纸包好投入液氮中,然后保存在-80 ℃超低温冰箱中。
1.1.2 表达载体、菌株及培养基 Gateway系统植物表达载体pK7FWG2.0（35 S启动子,GFP报告基因）、真核表达载体pDRTxa、农杆菌（Agrobacterium tunmefaciens）GV3101株系、酵母（Saccharomyces cerevisiae）By4742株系[17]为本实验室保存。感受态大肠杆菌（E. coli）DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。
用于酵母培养的SD+KHL液体培养基配置参见伍炳华等[17]方法。SD+KHL固体培养基为液体培养基基础上添加20%（W/V）琼脂粉。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及cDNA获得 称取约0.1 g组织（不同器官组织或不同开放时期花苞和花朵）,参照TranZol UP试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）方法进行RNA进行提取。使用超微量紫外分光光度计（Nano drop 2000）测定所提取RNA的浓度,并使用电泳检测其完整性。使用EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）获得第一链cDNA,反转录体系按说明书要求。用于获得扩增编码序列的cDNA反转录程序为42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 s。用于荧光定量的cDNA的反转录程序为42 ℃ 15 min,85 ℃,5 s。
1.2.2 茉莉JsCYP71A编码序列扩增 转录组中需克隆的目标P450基因序列仅为3ʹ端序列,因此采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法,根据转录组中P450基因序列,设计RACE引物（表1）扩增其5ʹ端序列。PCR的扩增体系按说明书要求。PCR程序：94 ℃ 30 s,92 ℃ 5 min,5个循环;94 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,5个循环;94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,1个循环;94 ℃ 30 s,67 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,25个循环。PCR结束后,将PCR产物使用AxyPrepTM PCR Clean up Kit（Axygen）纯化回收、连接到pEASY-blunt Cloning Vector载体（北京全式金生物技术有限公司）,并转化感受态DH5α,菌液PCR检测阳性后送测序。将获得的5ʹ序列与转录组中的序列进行拼接,获得编辑全长序列,根据序列设计引物验证其编辑序列。PCR的扩增体系按说明书要求。PCR程序：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min。将获得的PCR产物连接克隆载体,转化感受态,菌液PCR检测阳性后送测序（铂尚生物技术有限公司）。
表1 茉莉JsCYP71A基因克隆、荧光定量以及载体构建所采用的引物Tab. 1 Primers used for gene cloning, qPCR analysis and vector construction of JsCYP71A in J. sambac |
| 引物名称 Primer name | 序列（5°-3°） Sequence (5°-3°) | 目的 Purpose |
|---|---|---|
| JsCYP71A-5RACE- out | GCCGTATGGGGAC CAGATGATGTCAG | 5°RACE序列 扩增 |
| JsCYP71A-CDS-F | ATGGCCGGCTCCA AGTCGTCCACC | CDS扩增 |
| JsCYP71A-CDS-R | TCAAAGGGCATCG AGAACGAGTGG | |
| Q-JsCYP71A-F | GGGAGCGGGTTCT TGATGAA | JsCYP71A荧光定量引物 |
| Q-JsCYP71A-R | GATCTAGCTCCTC GGTTGCC | |
| Q-JsActin-F | TCTCTATGGTAACA TTGTCCTG | JsActin荧光定量引物 |
| Q-JsActin-R | ATCCAGACACTGT ACTTCCTCT | |
| TOPO- JsCYP71A-F | caccATGGCCGGCTC CAAGTCGTCCACC | 构建TOPO入门载体 |
| TOPO-JsCYP71A-R | AAGGGCATCGAGA ACGAGTGG | |
| pDR-JsCYP71A- BamH-F | gagagaGGATCCATGG CCGGCTCCAAGTCGTCCACC | 构建pDRTxa真核表达载体 |
| pDR-JsCYP71A- Sal-R | gagagaGTCGACAAGG GCATCGAGAACGAG TGG |
1.2.3 生物信息学分析 将测序之后得到的核酸序列用生物软件网的SMS在线工具（http://www.bio-soft.net/sms/index.html）中的DNA Figures进行序列翻译,Protein Figures进行多重序列比对;运用NCBI中的BLASTX进行P450间的同源性比对;使用NCBI中的Conserved Domain Search Service（CD Search）进行结构域分析;用MEGA4软件分析茉莉花P450基因与其他物种中P450基因的亲缘关系;使用Protparam在线软件,对P450蛋白分子量、等位点（pI）、正负电荷量等数据进行预测。
1.2.5 植物表达载体的构建及转化 为分析JsCYP71A的亚细胞定位,将JsCYP71A构建植物表达载体pK7FWG2.0,设计特异性引物（表1）,将JsCYP71A基因的编码序列连接到TOPO入门载体（pENTR/SD/D-TOPO, Invitrogen）连接完成后测序正确的TOPO-JsCYP71A与pK7FWG2.0植物表达载体进行LR反应（Gateway LR Clonase II Enzyme mix, Invitrogen）,使得JsCYP71A基因的编码序列置于35S启动子下,并与GFP融合。将测序正确的pK7FGW2.0-JsCYP71A通过冻融法转入农杆菌GV3101株系,PCR检测无误后备用。TOPO反应和LR反应体系及程序参见其说明书。
1.2.6 亚细胞定位分析 使用烟草叶片和茉莉花原生质体分析JsCYP71A的亚细胞定位。使用烟草叶片时,将验证转化成功的阳性克隆菌液使用含相应抗生素的LB液体培养基（含50 mg/L的庆大霉素、利福平、壮大霉素）28 ℃、200 r/min的条件下振荡培养过夜,再取出适量菌液接种于50 mL LB液体培养基中继续培养至OD600值为0.8~1.0。5000 r/min离心10 min收集菌体,加入重悬液（1/2 MS+200 μmol/L乙酰丁香酮+10 mmol/L MES）,暗培养3 h用无菌注射器向叶背面轻柔地注入菌液,暗培养24~30 h。使用茉莉花原生质体进行亚细胞定位分析时,茉莉花原生质体的提取和转化方法见前期研究[20]。用激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）观察判断GFP是否表达,观察GFP时Ex=488 nm,Em=507 nm,观察叶绿素时Ex=488 nm,Em=681 nm。
酵母总蛋白的提取参考伍炳华等[17]的方法。介于P450蛋白的亚细胞定位特点,将总蛋白用Storage buffer（20 mmol/L Tris-Cl,0.1 mmol/L EDTA,10% glycerol,100 mmol/L KCl,1 mmol/L DTT,pH 7.5）稀释到40 mL,100 000 ×g,4 ℃超速离心45 min,获得含有包涵体蛋白沉淀并用100 μL缓冲液和20 µL蛋白酶抑制剂溶解。
1.2.8 SDS-PAGE电泳及茉莉JsCYP71A蛋白的Western Blot检测 将酵母中提取的总蛋白和包涵体蛋白按照Super-Bradford蛋白定量试剂盒（Bio-Rad）测定蛋白浓度,然后进行SDS-PAGE电泳检测（碧云天生物技术）。蛋白样品10 μg,Marker 6 µL,在10 V,30 mA条件下进行电泳。SDS-PAGE电泳结束后切除浓缩胶,将获得的胶进行染色、脱色,观察考马斯亮蓝染色结果。在凝胶的适当位置做好标记,置于转移Buffer（2.9 g/L甘氨酸,5.8 g/L Tris,0.7 g/LSDS,20%甲醇）中。剪裁与胶大小相同的6张滤纸和1张膜（3 M）,在转移槽中从下往上依次放入3张滤纸、膜、胶、3张滤纸,每层之间不能有气泡,在0.8 mA/cm下转移蛋白1.5 h。转膜完成后,取出膜做好标记,用去离子水漂洗1次、TTBS（8.8 g/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）,0.05% Tween-20）漂洗3次（每次5 min,水平摇床）。将膜依次通过漂洗、封闭、结合一抗（anti-his mouse monoclonal antibody）、结合二抗（goat anti-mouse IgG（H+L）,HRP Conjugate）、漂洗等几个流程[17]。在洗好的膜上均匀涂布200 µL的显影液放入显影仪器（Bio- rad,molecular imagerⓇ ChemiDoc TM XRS+）中进行显影。
2 结果与分析
2.1 茉莉JsCYP71A基因CDS序列克隆的结果
图2 茉莉花JsCYP71A基因的5ʹRACE序列（A）和编码序列扩增（B）产物凝胶电泳图M1：DL2000 DNA marker;M2：DL5000 DNA marker;1：5ʹRACE扩增片段;2：JsCYP71A基因CDS序列扩增产物。 Fig. 2 Electrophoresis of amplification products of 5 'RACE (A) and coding sequence (B) of JsCYP71A in J. sambac M1: DL2000 DNA marker; M: DL5000 DNA marker; 1: Amplification product of 5ʹRACE of JsCYP71A; 2: Amplification product of the coding sequence of JsCYP71A. |
此序列的CDS长度为1545 bp,编码514个氨基酸残基（图3）。用Protparam在线软件预测P450基因分子总量为58.5 kDa,等电点为6.75,分子式为C2675H4193N683O748S21。正负电氨基酸的残基数相差不大,带正电的氨基酸64个,带负电的氨基酸65个。其不稳定系数为44.52,属于不稳定蛋白。
2.2 茉莉JsCYP71A基因序列分析
表2 茉莉花JsCYP71A与其他物种P450蛋白氨基酸序列的相似度Tab. 2 Comparison of deduced amino acid sequences of JsCYP71A from J. sambac with P450 proteins in other species |
| 物种 Species | 蛋白 Protein | 相似度 Identities/% | 登录号 Accession No. |
|---|---|---|---|
| 油橄榄 | cytochrome P450 71A1-like | 85 | XP_022886217.1 |
| 小果咖啡 | cytochrome P450 71A1-like | 78 | XP_027124985.1 |
| 苦瓜 | cytochrome P450 71A1-like | 79 | XP_022152553.1 |
| 大麻 | trimethyltridecatetraene synthase | 77 | XP_030490803.1 |
| 河岸葡萄 | trimethyltridecatetraene synthase-like | 76 | XP_034696142.1 |
图5 茉莉花JsCYP71A与其他物种中P450蛋白的氨基酸多重序列比较Oe：油橄榄（XP_022886217.1）;Hi：紫花枫林木（PIN02944.1）;Ca：小叶咖啡（XP_027124985.1）;Cf：长穗鹅耳枥（KAE7999040.1）;黑色直线为JsCYP71A氨基酸的功能域。 Fig. 5 Alignment of amino acid sequences of JsCYP71A and other P450 proteins in other species Oe: Olea europaea var. sylvestris (XP_022886217.1), Hi: Handroanthus impetiginosus (PIN02944.1), Ca: Coffea arabica (XP_027124988.1), Cf: Carpinus fangiana (KAE7999040.1); The black line marked the functional motif of JsCYP71A. |
2.3 茉莉JsCYP71A基因的空间和时间表达特征
采用实时荧光定量PCR分析了茉莉JsCYP71A基因在不同组织中表达水平。结果显示,JsCYP71A基因在白花苞中的相对表达量最高,达到38.39,其次是衰老的花朵,再其次为嫩茎和老叶,在黄花蕾和嫩叶中的表达量最低,其中JsCYP71A基因在黄花苞的表达量仅有0.13（图6）。
在花朵开放释香过程中,JsCYP71A基因在夜间（如第1天的21：00—3：00,第2天的19：00— 23：00）表达量高,在白天（如第1天03：00— 17：00,第2天01：00—15：00）表达量低。第1天19：00—23：00这段时间为P450表达量的增长期,其相对表达量在首日晚上23：00点之后达到最高,为120.74,随后开始下降,然后保持低表达量,第2天19：00又开始升高,在21：00左右达到第2次高峰,为101.43,而后开始下降,之后维持较低水平（图7）。
2.4 茉莉JsCYP71A的亚细胞定位
从图8可知,根据烟草叶片中荧光的位置可以判断JsCYP71A在细胞质中表达未在叶绿体中表达,与GFP对照相比,可发现JsCYP71A未在细胞核中表达,即在细胞质中表达;进一步在茉莉花原生质体中进行验证可发现,JsCYP71A的亚细胞定位区域为细胞质中,因此茉莉JsCYP71A的亚细胞定位为细胞质。
图8 茉莉花JsCYP71A在烟草叶片细胞和茉莉花花瓣原生质体中的亚细胞定位A：JsCYP71A在烟草叶片中的亚细胞定位;B：GFP对照在烟草叶片中的亚细胞定位;C：JsCYP71A在茉莉花瓣原生质体中的亚细胞定位;D：GFP对照在茉莉花瓣原生质体中的亚细胞定位。 Fig. 8 Subcellular localization of JsCYP71A in leaf cells of Nicotiana benthamiana and petal protoplast of J. sambac A: Subcellular localization of JsCYP71A in leaf cells of Nicotiana benthamiana; B: Subcellular localization of GFP control in leaf cells of Nicotiana benthamiana; C: Subcellular localization of JsCYP71A in the protoplast of jasmine petals; D: Subcellular localization of GFP control in jasmine petal protoplast. |
2.5 茉莉JsCYP71A在酵母中的表达
根据BSA标准曲线（Y=2.9031X-0.1064,X为酶标仪测定的数据,Y为稀释的BSA标准品浓度）换算转化了JsCYP71A基因以及空载体后酵母中分离的包涵体蛋白浓度分别为0.820 µg/µL和1.255 µg/µL。
SDS-PAGE胶体考马斯亮蓝染色结果显示从转化了P450的酵母菌液中提取的包涵体蛋白条带均匀分散,条带清晰,表明总蛋白和包涵体蛋白成功得到提取并在凝胶中进行了很好的分离（图9A）。
图9 转化JsCYP71A的酵母包涵体蛋白SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色(A)及Western Blot检测(B)图中EV表示空载体;图A中的Marker指示范围为10.5~175 kDa;图B中Marker指示范围为12~120 kDa。 Fig. 9 Coomassie bright blue stain (A) and Western Blot (B) of protein extracted from yeast transformed with JsCYP71A after SDS-PAGE electrophoresis EV represents empty vector, the range of Marker in A is 10.5-175 kDa and in B is 12-120 kDa. |
JsCYP71A蛋白通过生物信息学分析大小为59.39 kDa（包含6个His）,Western Blot结果显示,转化了JsCYP71A基因的酵母的总蛋白中在60 kDa处附近出现了条带（图9B）,表明提取的总蛋白中确实含有目标JsCYP71A蛋白,即JsCYP71A在酵母中成功表达。
3 讨论
细胞色素P450是高等植物中最大的酶蛋白家族[1],动物中的P450成员一般少于100,但开花植物P450家族庞大,一般超过250个,如在拟南芥（Arabidopsis thaliana）为245个、番茄（Lycopersicon esculentum）457个、水稻（Oryza sativa）343个、葡萄（Vitis vinifera）416个[1]。本研究中,JsCYP71A基因长度1545 bp,编码514个氨基酸,氨基酸序列中有P450超级家族特征序列和脯氨酸富集区、Helix C、Helix K、Meander 以及Heme-binding 结构域基序,初步说明本研究克隆的这个基因是P450基因。
JsCYP71A与同一科植物油橄榄CYP71A相似性和同源性最高。CYP71亚族很多成员参与萜类物质的合成,如CYP71D和CYP71A成员参与薄荷属植物单萜柠檬烯形成后各衍生物的合成[22,23,24],CYP71B参与了葡萄莎草酮（rotundone）的氧化合成[25],烟草CYP71D参与倍半萜capsidol的合成[26,27]等。此外,JsCYP71A与大麻和河岸葡萄中TMTT（一种半萜）合成酶的相似度较高,TMTT和DMNT是一种在植物防御中十分重要的半萜,在棉花[28]、拟南芥[29,30]、玉米[31]等重要作物中均有报道,这些结果均暗示茉莉JsCYP71A可能具有相似的参与萜类代谢的功能。进一步的遗传进化分析结果表明JsCYP71A与拟南芥CYP82G1亲缘关系最近,拟南芥CYP82G1催化橙花叔醇与香叶基芳樟醇分别转化为挥发性的萜烯同系物DMNT（C11）与TMNT（C16）,这二者均为夜间开花的花香物质,也能影响外界刺激调控半萜的合成[29,30]。进一步提示JsCYP71A可能参与了萜类的合成。
茉莉花香气的主要组成分为芳樟醇、法呢烯、乙酸芳香酯、甲苯酸甲酯苄酯,其中芳樟醇属于单萜类化合物,占茉莉花单萜类香气物质总含量的90%以上[12],是茉莉花的特征香气组成[34],其含量的变化对茉莉花香气和精油的品质有重要影响。拟南芥中的研究表明芳樟醇生成后,可通过氧化反应生成各类环吡喃型（cyclic pyranoid）或呋喃型化合物的氧化衍生物（furanoid oxygenated derivatives）,这些物质可分为挥发性和溶解性两类,其中芳樟醇及其挥发性氧化物是香气的主要成分[35],另一大部分溶解性芳樟醇氧化物以糖苷轭合物的形式存在于植物组织内[36]。这些反应的催化酶属于细胞色素P450家族,包括CYP76C1、CYP76C2、CYP76C3、CYP76C4、CYP71B31[33, 35][35, 37-38]。相比之下,关于P450在茉莉花萜类香气,特别是芳樟醇合成后代谢的研究尚较少,本研究中JsCYP71A在茉莉花中具有明显的花特异性,并与芳樟醇这类萜类的释放规律具有一致性,暗示JsCYP71A可能参与了萜类的代谢。