热带水果作为我国的重要经济作物,其种类繁多,营养丰富,品质优良,近年来随着种植面积和产量逐渐增大,相关产业已占据国民经济的重要地位。热带地区病虫害发生日益严重,农药使用量也逐年增加,而农药残留超标不仅对食品安全造成一定影响,也会导致人类健康和环境受到威胁[1⇓-3]。因此,亟需对热带水果中的农药残留进行准确的测定,以保证我国热带水果的安全生产。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 香蕉、芒果、菠萝、哈密瓜均为市售,-20 ℃下保存备用。
噻唑磷（纯度98%）、戊唑醇（纯度98%）、螺虫乙酯（纯度99%）、嘧菌酯（纯度99.5%）和氯虫苯甲酰胺（纯度98%）5种农药标准品,德国Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇、乙腈（色谱纯）,Fisher试剂公司;氯化钠、无水硫酸镁均为分析纯,广州化学试剂厂;PSA吸附剂（乙二胺-N-丙基硅烷,分析纯）,Biocomma公司。实验用水均为超纯水。
1.1.2 仪器与设备 超高压液相色谱系统（美国Waters公司）,AB SCIEX API4000+质谱系统（美国AB SCIEX公司）,高速匀浆机（德国IKA公司）,GL-10C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）,多管旋涡混合器（北京同德有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 色谱检测条件 ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm×1.7 μm,美国Waters公司）,柱温40 ℃,进样量10 μL,流速为0.25 mL/min,流动相A为0.1%甲酸水,B为甲醇,梯度洗脱。洗脱程序：0~2 min,保持95%A;2~4 min,95%A变为5%A;4~5 min,保持5%A;5~7 min,5%A变为95%A。
1.2.2 质谱检测条件 电喷雾正离子（ESI+）扫描,多反应监测（MRM模式）,喷雾电压5500 V,毛细管温度600 ℃。优化后的相关质谱参数见表1。
表1 5种农药的主要质谱参数Tab. 1 UPLC-MS/MS parameters of five pesticides |
| 化合物 Compounds | 母离子 Parent ion (m/z) | 子离子 Daughter ion (m/z) | 去簇电压 Declustering potential/V | 碰撞能量Collision energy/V |
|---|---|---|---|---|
| 噻唑磷 | 284.0 | 227.8 | 69.17 | 13.98 |
| 104.0 | 29.84 | |||
| 戊唑醇 | 308.1 | 70.1 | 96.78 | 45.97 |
| 124.8 | 26.13 | |||
| 螺虫乙酯 | 374.2 | 270.0 | 116.2 | 32.72 |
| 216.1 | 44.92 | |||
| 嘧菌酯 | 404.2 | 372.0 | 96.60 | 18.06 |
| 344.1 | 32.69 | |||
| 氯虫苯甲酰胺 | 484.1 | 285.9 | 109.51 | 17.95 |
| 452.9 | 24.93 |
使用甲醇配制1000 μg/mL的5种农药单标溶液作为储备液,保存时间为6个月。继而用甲醇配制10 μg/mL的混合标准母液,使用时间为一周内。使用时用甲醇稀释制成系列混合标准溶液,现配现用。
1.2.3 基质效应实验 准确称取10.0 g匀浆后的水果样品于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈后匀浆2 min,加入5 g氯化钠和6 g无水硫酸镁,涡旋1 min后在4000 r/min下离心5 min,取上清液加1 g PSA和3 g无水硫酸镁,继续涡旋1 min离心5 min,取上清液过膜备用。
根据国家标准GB 2763—2019中5种农药在水果中的农药最大残留限量,选取其中的最小值0.02 mg/kg（即0.01 μg/mL）作为最低试验浓度,依次增加5倍和10倍（即0.05 μg/mL和0.5 μg/mL）来分析农药浓度对基质效应的影响。用不同基质液将10.00 μg/mL的混合标准母液配制成0.01、0.05、0.5 μg/mL的基质配制标准溶液,每种基质每个浓度做3组平行。
根据以下公式[17]计算样品的基质效应（ME）：
ME=B/A×100%
式中,A为溶剂标峰面积;B为基质标峰面积。
1.3 数据处理
数据采集、谱图分析、数据定量等均采用Analyst软件（AB SCIEX）,通过化合物的质量数、保留时间等信息对检测结果进行自动检索,从而对农药进行定性,采用Office Excel 2010软件对数据进行整理和分析。
2 结果与分析
2.1 线性范围、检出限、回收率及精密度
在仪器最佳工作条件下,用0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL混合标准溶液测定。如 表2所示,5种农药在0.005~0.5 μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数 r>0.999,5种农药的检出限（LOD）为0.16~1.12 μg/kg,定量限（LOQ）为0.53~4.00 μg/kg。5种农药的LOQ都低于GB 2763—2019规定的最低残留限量值,满足国家标准的相关要求。分别以不含5种农药的香蕉、芒果、菠萝、哈密瓜作为空白样品,进行0.01、0.1、1 mg/kg 3个水平的添加回收试验,结果见表3,平均回收率为76%~130%,相对标准偏差为0.2%~12.9%（n=5）。表明该方法符合农药残留检测要求。
表2 5种农药的线性回归方程、检出限和定量限Tab. 2 Standard curve, LOD and LOQ of five pesticides |
| 化合物 Compounds | 线性范围 Linearity range/(µg·mL-1) | 线性回归方程 Linear equation | 相关系数 Correlation coefficient (r) | LOD/(µg·kg-1) | LOQ/(µg·kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|
| 噻唑磷 | 0.005~0.5 | Y = 7.30×107 X+7.70×105 | 0.9998 | 1.10 | 4.00 |
| 戊唑醇 | 0.005~0.5 | Y = 1.39×108X+9.46×105 | 0.9990 | 0.20 | 0.67 |
| 螺虫乙酯 | 0.005~0.5 | Y = 4.43×106 X-5.03×103 | 0.9996 | 1.04 | 3.47 |
| 嘧菌酯 | 0.005~0.5 | Y = 7.68×107 X+1..25×105 | 0.9995 | 0.16 | 0.53 |
| 氯虫苯甲酰胺 | 0.005~0.5 | Y = 1.59×106 X+1.23×104 | 0.9996 | 1.12 | 3.73 |
表3 5种农药的添加回收率及相对标准偏差（n=5）Tab. 3 Recoveries and RSD of five pesticides (n=5) |
| 化合物 Compounds | 基质 Matrix | 添加水平Added /(mg·kg-1) | 化合物 Compounds | 基质 Matrix | 添加水平Added /(mg·kg-1) | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.01 | 0.1 | 1 | 0.01 | 0.1 | 1 | ||||||||||
| 回收率Recovery /% | RSD /% | 回收率 Recovery /% | RSD /% | 回收率Recovery /% | RSD /% | 回收率Recovery /% | RSD /% | 回收率 Recovery /% | RSD /% | 回收率 Recovery /% | RSD /% | ||||
| 噻唑磷 | 香蕉 | 94 | 7.4 | 97 | 6.1 | 103 | 2.1 | 螺虫乙酯 | 菠萝 | 91 | 10.2 | 102 | 7.1 | 83 | 4.7 |
| 芒果 | 108 | 8.1 | 91 | 4.4 | 104 | 1.9 | 哈密瓜 | 83 | 3.0 | 82 | 4.8 | 93 | 1.3 | ||
| 菠萝 | 102 | 0.7 | 93 | 10.1 | 85 | 6.5 | 嘧菌酯 | 香蕉 | 83 | 7.7 | 110 | 3.7 | 104 | 2.6 | |
| 哈密瓜 | 89 | 0.2 | 109 | 0.6 | 102 | 0.2 | 芒果 | 122 | 3.6 | 110 | 7.6 | 107 | 2.5 | ||
| 戊唑醇 | 香蕉 | 130 | 0.5 | 105 | 2.5 | 101 | 2.5 | 菠萝 | 82 | 3.2 | 97 | 8.6 | 98 | 6.5 | |
| 芒果 | 76 | 5.3 | 84 | 1.5 | 108 | 3.7 | 哈密瓜 | 92 | 4.6 | 93 | 4.7 | 100 | 2.9 | ||
| 菠萝 | 101 | 2.1 | 90 | 3.2 | 90 | 8.5 | 氯虫苯 甲酰胺 | 香蕉 | 83 | 8.2 | 101 | 5.0 | 105 | 3.7 | |
| 哈密瓜 | 117 | 7.1 | 98 | 1.2 | 100 | 1.8 | 芒果 | 99 | 6.2 | 102 | 12.9 | 107 | 4.0 | ||
| 螺虫乙酯 | 香蕉 | 86 | 2.6 | 90 | 5.0 | 108 | 5.5 | 菠萝 | 100 | 10.8 | 84 | 1.2 | 94 | 7.1 | |
| 芒果 | 99 | 11.7 | 83 | 4.5 | 117 | 4.1 | 哈密瓜 | 107 | 6.2 | 103 | 8.8 | 98 | 5.8 | ||
2.2 香蕉基质中5种农药基质效应
由图1可看出,基质为香蕉,浓度为0.01 μg/mL时,5种农药的基质效应为65.7%~127.5%,噻唑磷和嘧菌酯无基质效应,戊唑醇为中等基质抑制作用,螺虫乙酯和氯虫苯甲酰胺为中等基质增强作用,戊唑醇的基质效应最强;浓度为0.05 μg/mL时基质效应为100.2%~130.3%,其中氯虫苯甲酰胺为中等基质增强作用,其余4种农药无基质效应;浓度为0.5 μg/mL时基质效应为126.3%~ 138.5%,5种农药均呈中等基质增强作用,氯虫苯甲酰胺的基质效应最强。5种农药中,除氯虫苯甲酰胺随浓度的增加其基质效应逐渐增强外,其余农药的基质效应随浓度变化不明显。
2.3 芒果基质中5种农药基质效应
芒果基质中5种农药的基质效应如图2所示。浓度为0.01 μg/mL时,5种农药的基质效应为63.0%~178.8%,戊唑醇为中等基质抑制作用,嘧菌酯和氯虫苯甲酰胺为中等基质增强作用,螺虫乙酯为较强基质增强作用,噻唑磷无基质效应;浓度为0.05 μg/mL时,基质效应为107.0%~ 154.7%,氯虫苯甲酰胺为中等基质增强作用,螺虫乙酯为较强基质增强作用,其余3种农药无基质效应;浓度为0.5 μg/mL时基质效应为129.1%~ 150.7%,除螺虫乙酯为较强基质增强作用外,其余农药均为中等基质增强作用。5种农药中,螺虫乙酯在3个浓度均表现最强基质效应;噻唑磷和氯虫苯甲酰胺随浓度的增加其基质效应逐渐增强,螺虫乙酯随浓度的增加其基质效应逐渐减弱,其余农药的基质效应随浓度变化不明显。
2.4 菠萝基质中5种农药基质效应
基质为菠萝时,从图3可看出,当浓度为0.01 μg/mL时,5种农药的基质效应为56.6%~ 137.9%,噻唑磷和嘧菌酯和氯虫苯甲酰胺均无基质效应,戊唑醇为中等基质抑制作用,螺虫乙酯为中等基质增强作用,戊唑醇的基质效应最强;浓度为0.05 μg/mL时基质效应为96.5%~120.2%,其中氯虫苯甲酰胺为中等基质增强作用,其余4种农药均无基质效应;浓度为0.5 μg/mL时基质效应为115.3%~131.8%,除螺虫乙酯无基质效应外,其余农药均为中等基质增强作用,嘧菌酯的基质效应最强。5种农药中,除氯虫苯甲酰胺随浓度的增加其基质效应逐渐增强外,其余农药的基质效应随浓度变化不明显。
2.5 哈密瓜基质中5种农药基质效应
图4给出了基质为哈密瓜时的结果。浓度为0.01 μg/mL时,5种农药的基质效应为62.8%~ 127.4%,戊唑醇为中等基质抑制作用,螺虫乙酯为中等基质增强作用,其余3种农药均无基质效应,戊唑醇的基质效应最强;浓度为0.05 μg/mL时基质效应为101.7%~121.4%,氯虫苯甲酰胺为中等基质增强作用,其余农药均无基质效应;浓度为0.5 μg/mL时基质效应为124.9%~134.9%,5种农药均为中等基质增强作用,其中嘧菌酯的基质效应最强。5种农药中,噻唑磷、嘧菌酯和氯虫苯甲酰胺随浓度的增加其基质效应逐渐增强外,其余农药的基质效应随浓度变化不明显。
3 讨论
3.1 热带水果与其他果蔬基质效应的比较
本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法分析了噻唑磷、戊唑醇、螺虫乙酯、嘧菌酯和氯虫苯甲酰胺在4种热带水果（香蕉、芒果、菠萝和哈密瓜）中的基质效应,结果与文献报道中的结果存在一定差异。噻唑磷在4种热带水果中的基质效应为97.0%~129.1%,表现为基质增强或无基质效应,而在黄瓜、白菜等17种蔬菜基质中,噻唑磷表现为基质抑制[20]。戊唑醇在热带水果中的基质效应为56.6%~129.9%,表现为基质抑制、基质增强或无基质效应,而在葡萄基质中,戊唑醇表现为无基质效应[21]。螺虫乙酯在热带水果中表现为基质增强或无基质效应,其基质效应为107.1%~178.8%,而在梨、芹菜等果蔬中表现为基质抑制或无基质效应[22]。嘧菌酯和噻唑磷相似,在热带水果中表现为基质增强或无基质效应,其基质效应为100.3%~135.4%,而在香菜、油麦菜等蔬菜基质中同样表现为基质抑制[23]。氯虫苯甲酰胺在热带水果中基质效应为101.7%~138.5%,表现为基质增强或无基质效应,而在胡萝卜、甘薯等35种蔬菜基质中表现为基质抑制或无基质效应[24]。由此可见,在本研究测试的4种热带水果基质中,5种农药均表现出基质增强或无基质效应,但是文献报道的其他果蔬基质中则表现为基质抑制或无基质效应。与其他果蔬相比较而言,热带水果富含糖类、维生素及其他特殊的芳香类物质,这些物质的存在可能会导致待测物的离子化效率增强,使得待测物信号增强,从而表现为基质增强作用。
3.2 水果种类对基质效应的影响
本研究结果显示,在浓度为0.01、0.05、0.5 μg/mL时,5种农药在4种热带水果基质中均呈现出不同程度的基质效应。4种基质中,噻唑磷、戊唑醇、螺虫乙酯、嘧菌酯、氯虫苯甲酰胺普遍表现基质增强效应,但不同基质引起的基质效应变化较大,如在香蕉基质中螺虫乙酯为中等基质增强效应,其基质效应为112.8%~130.5%,而在芒果基质中螺虫乙酯则表现为较强基质增强效应,其基质效应在150.7%~178.8%,这可能与芒果中糖及维生素的含量高有关,也可能与芒果含有极高的维生素A的前体胡萝卜素成分有关 [25]。菠萝基质中氯虫苯甲酰胺在低浓度和中浓度均表现为无基质效应,而香蕉基质中氯虫苯甲酰胺在低浓度和中浓度表现为中等基质效应,这可能与2种基质的含水量有关[26]。每100 g菠萝中含水87.1 g,每100 g香蕉含水60 g,基质含水量的增加导致基质中共萃物浓度的降低或是影响其基质效应的因素,因此菠萝含水量高于香蕉时,其基质效应也弱于香蕉,这表明基质效应的强弱与水果种类有关。热带水果所含的蛋白质、脂肪、维生素等各种营养物质都会增强基质效应,因此在样品前处理过程中应优化前处理方法,提高净化效率以减少样品中基质组分的含量。同时在测定结果可靠的前提下,可通过稀释样品来降低基质中的共萃物浓度进而减小基质效应。
3.3 农药种类对基质效应的影响
根据本研究结果可知,同一基质同一浓度时不同农药的基质效应差异较大。当基质相同,浓度为0.01 μg/mL时,除戊唑醇表现为基质抑制效应外,其余农药均呈基质增强效应,其中螺虫乙酯最高、嘧菌酯和氯虫苯甲酰胺次之、噻唑磷最低,这可能与农药的结构性质有关。戊唑醇为三唑类农药,结构主链上含有羟基（酮基）、取代苯基和1,2,4-三唑基团 [27]。螺虫乙酯作为螺环季酮酸类化合物[28],可能因其具有独特的螺环结构而受基质效应的影响显著高于其他类型的农药,其影响机理还有待进一步研究。戊唑醇在同一基质时都呈现低浓度基质抑制,高浓度基质增强,而其余农药也在同一基质的不同浓度呈现不同的基质效应。农药浓度不同时基质相对目标化合物的浓度不同,离子化时争夺离子的能力就不同,因此产生基质效应的程度也不同,这表明基质效应的强弱与农药浓度有关。在日常检测工作中,针对基质效应较强的农药,建议采用基质匹配标准品进行定量检测,以保证检测结果的准确性。本研究为热带水果中农药的定量、定性分析提供了依据。