荔枝霜疫霉病（litchi downy blight）由荔枝霜疫霉（Phytophthora litchii）侵染引起,是荔枝（Litchi chinensis Sonn.）主要病害之一,在荔枝生长的各阶段均可发生,主要侵染荔枝的嫩叶、幼茎、花和果实,严重时可导致荔枝减产80%,危害极其严重[1]。近年来,有关研究发现苯丙烷类代谢通路及其代谢产物对植物抵御病原菌的入侵发挥重要作用。植物体在受到生物因素与非生物因素胁迫时,苯丙烷类代谢中一系列中间产物、转化产物（如木质素、黄酮类、香豆素、绿原酸等）及关键性酶类（如苯丙氨酸解氨酶、过氧还物酶、肉桂醇脱氢酶等）在植物生理活动中起着重要调控作用[2-3]。植物受到生物胁迫与非生物胁迫时,其苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性一般会增加,因而,PAL通常视为植物抗性的生理标记[4]。过氧化物酶（POD）能够催化多种酚类和非酚类化合物发生氧化还原,与植物防御功能紧密相关。诸多植物,如玉米、大豆、柠檬在真菌和病毒侵染过程中均显示出过氧化物酶在防御反应中的作用[5]。植物中β-葡萄糖苷酶（BGLU）能将木质素水解形成葡萄糖,是该过程的关键限速酶,关系着植物细胞壁的建构[6]。总酚、类黄酮和花色素苷是苯丙烷类代谢中重要的次生代谢产物。研究发现,海棠在锈斑和邻近组织中黄酮类、花色素苷的积累使得着色加深,表征防御机制的启动[7]。酚类植物抗毒素表现出抗生素和抗真菌活性,在植物生长发育中起着重要作用[8]。植物受到病虫害胁迫会分泌香豆素参与抗性过程,一方面作为植物抗毒素,自身特殊的气味能防止病虫危害;另一方面香豆素作为木质素合成前体,在植物受到外界胁迫时有利于细胞壁的木质化,提高植物的抗性作用[9]。目前,关于荔枝的霜疫霉病发病机制尚不清楚。前期研究发现,不同荔枝品种果实对霜疫霉侵染表现出不同抗性,通过评价鉴定得出‘黑叶’和‘桂味’分别对霜疫霉表现为稳定抗病和稳定感病[10]。本文研究霜疫霉侵染后,‘黑叶’和‘桂味’果皮中苯丙烷类代谢有关酶的活性及代谢产物含量的变化差异,探究苯丙烷类代谢在荔枝抗霜疫霉病中的作用,为进一步揭示荔枝对霜疫霉病的抗病机制,研发防控技术提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
采集‘黑叶’和‘桂味’八成熟果实,在1 d内运往实验室进行预处理。挑选成熟度一致、无损伤的健康果实,用蒸馏水清洗2次,室温条件下晾干10 min,备用。
将长满培养皿的霜疫霉菌（菌株HK-Ⅰ,本实验室分离保存）轻轻刮入纯水中,计算孢子浓度,配置浓度为4×106个/mL孢子悬浮液。通过悬浮孢子液浸泡果实人工接种霜疫霉菌于上述果实,以不接种果实为对照。处理和对照果实置于保鲜盒中,每20个果实放置1个保鲜盒,果实之间彼此分开,均匀分布。
分别在接种后0、24、48、72、96 h时取样,每个时间点3个生物学重复,每个生物学重复20个果实。用干净的解剖刀小心剥离病健交界处果皮,使之不粘连果肉与果汁,液氮速冻,在高速研磨仪上研磨成粉,置于-80 ℃下冷冻保存备用。
1.2 方法
1.2.1 病情调查与统计 以接菌0 h的果实为准,每24 h观察1次果实发病情况,依据病情分级标准（表1）统计果实发病严重程度（果实病斑面积占果实面积比例）,计算病情指数,至大部分果实发病。
表1 荔枝霜疫霉病病情分级标准Tab. 1 Classification standard of litchi downy blight |
| 病情严重级别 Severity level of disease | 分级标准 Grading standard |
|---|---|
| 0 | 0 |
| 1 | 0<病斑占果皮面积≤1/10 |
| 3 | 1/10<病斑占果皮面积≤1/3 |
| 5 | 1/3<病斑占果皮面积≤1/2 |
| 7 | 1/2<病斑占果皮面积≤3/4 |
| 9 | 3/4<病斑占果皮面积≤1 |
病情指数=∑(s×n)/(N×S)×100（注：s为各级病情级别,n为各级别病果数,N为总果数,S为最高病情级别）。
1.2.2 提取液的制备 研钵先用液氮预冷,果皮粉末在液氮条件下继续研磨。取研磨后的果皮粉末样品1.0 g于10 mL离心管,低温条件下加入5.0 mL预冷的0.1 mol/L硼酸缓冲液（pH为8.8含0.1 g PVPP）,涡旋震荡30 s,12 000 r/min、4 ℃下离心30 min,收集上清液用于酶活性测定。
取上述研磨过的果皮粉末样品0.5 g于5 mL离心管中,低温条件下加入1 mL预冷80%甲醇水溶液,涡旋震荡30 s,4 ℃条件下127 r/min摇床震荡提取12 h,然后12 000 r/min、4 ℃下离心10 min,将上清液转入10 mL离心管中。将第一次提取残渣重复上述步骤提取一次,收集最后提取液并定容至相同体积,最后提取液过0.22 μm滤膜,滤液用于香豆素含量测定。
1.3 数据处理
使用DPS数据软件进行数据分析处理[13],采用Excel软件进行绘制图表。
2 结果与分析
2.1 接种霜疫霉菌后荔枝病情指数的变化
荔枝未接种霜疫霉菌时,‘黑叶’与‘桂味’病情指数随时间变化不大。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的病情指数均随时间呈逐渐上升趋势;2个品种的病情指数均在48 h开始急剧上升,此后均显著高于对照,96 h达到最大值。总体而言,接菌处理后,‘桂味’病情指数的升高幅度明显大于‘黑叶’（图1）。
2.2 接种霜疫霉菌对荔枝果皮PAL、POD、BGLU活性的影响
2.2.1 PAL活性的变化 未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘黑叶’与‘桂味’果皮的PAL活性均随时间平稳上升,但‘黑叶’的PAL活性高于‘桂味’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的PAL活性均呈逐渐上升趋势,且高于对照;‘桂味’果皮PAL活性在24~48 h迅速上升,72 h时的PAL活性与‘黑叶’相当,此后PAL活性继续缓慢升高;‘黑叶’果皮PAL活性的变化幅度小于‘桂味’（图2A）。PAL与病情指数呈极显著正相关（r=0.625**,P<0.01）。
2.2.2 POD活性的变化 未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘黑叶’与‘桂味’果皮的POD活性均随时间平稳上升,但‘黑叶’的POD活性高于‘桂味’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的POD活性均呈逐渐上升趋势,且高于对照;‘桂味’果皮的POD活性在0~24 h迅速升高,96 h时的POD活性与‘黑叶’接近;‘黑叶’果皮POD活性的变化幅度小于‘桂味’（图2B）。POD与病情指数呈正相关（r=0.425*,P<0.05）。
2.2.3 BGLU活性的变化 未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘黑叶’与‘桂味’果皮的BGLU活性均随时间平稳上升,但‘桂味’的BGLU活性高于‘黑叶’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的BGLU活性均呈逐渐上升趋势,且高于对照;‘桂味’果皮的BGLU活性在24~48 h迅速升高,此后BGLU活性继续缓慢上升,‘桂味’的BGLU活性明显高于‘黑叶’;‘桂味’果皮BGLU活性的变化幅度大于‘黑叶’（图2C）。BGLU与病情指数呈正相关（r=0.908**,P<0.01）。
2.3 接种霜疫霉菌对荔枝果皮总酚、类黄酮、花色素苷含量的影响
2.3.1 总酚含量变化 未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘黑叶’与‘桂味’果皮的总酚含量均随时间逐渐降低,但‘黑叶’的总酚含量高于‘桂味’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的总酚含量均呈逐渐下降趋势,且低于对照;96 h时2个品种果皮的总酚含量均达最低值;‘黑叶’的总酚含量总体高于‘桂味’（图3A）。总酚含量与病情指数呈负相关（r=-0.720**,P<0.01）。
2.3.2 类黄酮含量变化 未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘黑叶’与‘桂味’果皮的类黄酮含量随时间变化不大,但‘黑叶’的类黄酮含量高于‘桂味’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的类黄酮含量均呈逐渐下降趋势,且低于对照;‘黑叶’果皮的类黄酮含量在0~24 h迅速下降,此后,2个品种的果皮类黄酮含量均缓慢下降;‘黑叶’果皮类黄酮含量均高于‘桂味’（图3B）。类黄酮含量与病情指数呈负相关（r=-0.698**,P<0.01）。
2.3.3 花色素苷含量变化 未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘黑叶’与‘桂味’果皮中花色素苷含量均随时间逐渐下降,但‘黑叶’的花色素苷含量高于‘桂味’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的花色素苷含量均呈逐渐下降趋势;在接种霜疫霉菌48 h后,2个品种的果皮花色素苷含量均开始急剧下降,且低于对照,96 h时2个品种的果皮花色素苷含量均达最低值;‘黑叶’的花色素苷含量高于‘桂味’（图3C）。花色素苷含量与病情指数呈负相关（r=-0.633**,P<0.01）。
2.4 接种霜疫霉菌对荔枝果皮香豆素含量的影响
未接种霜疫霉菌的对照果实中,‘桂味’果皮的香豆素随时间平稳上升,而‘黑叶’的香豆素含量则无明显变化,但‘桂味’的香豆素含量高于‘黑叶’。接种霜疫霉菌后,‘黑叶’与‘桂味’的香豆素含量均呈上升趋势;在接种霜疫霉菌24~48 h,‘黑叶’果皮的香豆素含量迅速上升;48 h时,2个品种的香豆素含量相当,此后,黑叶’的香豆素含量呈缓慢下降趋势,而‘桂味’的香豆素含量则持续上升,96 h时达最大值。总体而言,接种霜疫霉后,2个品种果皮香豆素含量均高于对照,‘桂味’的香豆素含量高于‘黑叶’（图4）。香豆素含量与病情指数呈正相关（r=0.637**,P<0.01）。
3 讨论
PAL、POD、BGLU是苯丙烷类代谢中的关键性酶类。PAL和POD与植物抗病性联系紧密,可以作为反映植物抗性水平的重要指标[14]。植物抗病性研究中植物细胞壁是抵御外来生物与非生物因子胁迫的第一道防护屏障,BGLU在其中起重要作用：一方面,参与植物细胞壁木质化的过程,从而影响植物对外界病虫生物的防御;另一方面,它使得植物中的激素和芳香化合物得以释放[15-16]。植物中的BGLU活性高有利于植物形成木质素和香豆素共同构建防御病原菌的结构与物质安全防护层,有效抑制病原菌在植株中的扩展和为害[17]。接种霜疫霉菌后,抗病品种‘黑叶’的POD、PAL、BGLU活性随发病程度的加深而逐渐升高,而感病品种‘桂味’的PAL、POD、BGLU酶活性则快速上升,酶活性的变化幅度较大,由于自身物质代谢基础弱,需要合成具有杀菌或抑菌活性的香豆素,因此对病原菌的侵染表现敏感。
植物通过分泌植物抗毒素——香豆素,散发出一种特殊气味,能有效防止病虫的危害,生物合成香豆素对植物抵御真菌病害发挥着重要作用[18]。受到霜疫霉菌侵染后,感病品种‘桂味’的抗性关键酶活性大幅提升,加快合成发挥主要抗菌作用的物质——香豆素;抗病品种‘黑叶’受到霜疫霉菌侵染后抗性关键酶活性上升,但变化幅度不大。抗病品种‘黑叶’植株体内原始积累的总酚、类黄酮、花色素苷高于感病品种‘桂味’,这类物质对霜疫霉有很好的抗性,因此在抗病品种‘黑叶’中香豆素并不是发挥主导作用的抗菌物质。
相关性分析显示,病情指数与PAL、POD、BGLU活性呈极显著正相关,与类黄酮、花色素苷、总酚含量呈极显著负相关,而与香豆素含量呈极显著正相关。说明这些酶活性和物质含量的变化显著影响了荔枝果实的发病进程,2个品种接种霜疫霉菌后发病进程不同,与这些物质含量和酶活性在成熟果皮中的本底大小及接种后的变化有关。
综上分析,感病品种‘桂味’接种霜疫霉菌后,随着发病程度加深,抗性关键酶迅速调控香豆素的生物合成,并与总酚、类黄酮、花色素苷迅速联合作用参与对病原菌的防御,表现出对病原菌侵染较敏感;抗病品种‘黑叶’主要依靠自身原始积累的高含量总酚、类黄酮、花色素苷进行积极防御,表现出较强抗性。抗、感病荔枝品种受到霜疫霉菌侵染后,果实发病越严重,苯丙烷类代谢中关键性酶变化和代谢产物生物合成趋向抵御不良生物因素方向发展,不同荔枝品种苯丙烷类代谢产物生物合成侧重点因品种抗性差异而不同。