Dicer是一种高度保守的核糖核酸酶,在植物中称为Dicer-like（DCL）蛋白,属于RNase Ⅲ家族,是RNA沉默途径中至关重要的组分,其通常包括DEAD box、helicase-C、DUF283、PAZ、RNase Ⅲ和dsRBD 6个结构域 [1]。DCL蛋白是加工dsRNA前体生成小分子RNA的关键酶,可通过剪切dsRNA产生siRNA,启动RNAi途径的起始阶段,在植物RNA沉默机制中发挥了关键作用[2]。由于DCL结构域的多样性,不同的DCLs在不同的生物中对RNA的剪切功能存在差异[3]。每个DCL蛋白都有其各自的功能,彼此通过功能互补和自我平衡的方式发挥作用[4⇓-6]。研究发现,在拟南芥中,AtDCL4主要在转录后的基因沉默发生作用,通过特异性识别大于100 nt的长链dsRNA,将其剪切形成20 nt的反式作用siRNA;在水稻中,OsDCL4剪切产生21 nt的反式siRNAs和phasiRNAs4[7-8]。研究表明DCL4在调控植物生长发育和适应性方面也发挥了一定生物学作用。氮缺乏条件下,拟南芥突变体ski2 dcl4和ein5 dcl4中22 nt siRNAs被显著诱导,韧皮部发育相关基因CALS7和NEN4显著下调表达,土壤根系生长明显被抑制,幼苗发育迟缓[9];在棉花干旱胁迫和病毒侵染过程中,DCL4被诱导显著性上调表达[10];撇除水稻OsDCL4基因导致植株生长矮小、结穗率低,植物内源dsRNA含量减少而使植株易受病毒侵染[11]。
外源脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）都是植物内源性激素,对植物的生长调节有重要作用。ABA在植物的生长发育调节和对非生物胁迫的应答方面发挥了显著的作用[12]。研究表明,ABA对植物生长发育的调节主要体现在促进器官脱落和休眠、抑制植物生长、促进种子休眠等方面[13],同时还可以提高植物对于干旱、低温和高盐抗性[14]。在龙眼的相关研究中发现ABA可以提高RNA沉默相关基因AGO10的表达量[15],但DlDCLs下调表达[16]。SA在植物中主要是作为防卫激素发挥作用[17],目前在多个物种中发现SA可以增强对生物性病原的抵抗作用,而且时常被应用于种子萌发前的催种[18]。研究表明,SA信号转导途径在植物对抗逆境胁迫,尤其是在对抗病害的胁迫过程中起着关键性作用[19⇓-21]。同时,研究发现50、75 μmol/L浓度的SA可以使龙眼 Mn-SOD的表达量显著上调,提高龙眼的抗氧化能力[22],同时对龙眼抗病基因的表达有调控作用[23]。
龙眼（Dimocarpus longan Lour.）作为一种热带亚热带水果,具有非常高的经济价值,同时龙眼干还有着很高的药用价值,所以龙眼果实的品质调控一直都是研究的热点。ABA和SA在植物的生长和发育中有重要的作用,而DCLs作为miRNA作用过程中的关键酶也越来越受到重视,探究它们之间的作用机制对提高龙眼果实品质具有重要意义。近年来,研究发现DlDCLs对龙眼的叶子和花器官发育具有重要的调控作用,并且能响应干旱、低温和ABA、SA等非生物胁迫[16]。研究表明,在不同种类外源激素处理下,DlDCL4的表达存在显著性差异,但是关于短期内DlDCL4对外源激素的响应机制还没有相关研究成果。因此,本试验通过比较不同物种DCL4氨基酸序列的保守性,并构建进化树;通过构建表达载体转化洋葱表皮研究龙眼DCL4的亚细胞定位;并通过设置0、4、8、12、24 h的时间梯度,探究龙眼胚性愈伤组织中DlDCL4是否参与对ABA和SA外源激素的应激反应。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所用的‘红核子’龙眼胚性愈伤组织（EC）来自于福建农林大学园艺植物生物工程研究所。选择固体培养基中生长状态良好的龙眼胚性愈伤组织继代于液体培养基中,并且在2次液体培养基继代以后,选择生长状况最好的愈伤组织,在滤纸上滤干后混样。将0.3 g样品加入分别含有100 μmol/L脱落酸（ABA）和100 μmol/L水杨酸（SA）的MS液体培养基中,置于25 ℃ 120 r/min的摇床,分别处理0、4、8、12、24 h,每个处理做3次生物学重复,收样时将3组生物学重复处理的样品混样后用滤纸吸干水分,液氮急冻处理后保存于‒80 ℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 DCL4进化树的构建 使用 www.NCBI.com和 https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html选择18种和龙眼DCL4氨基酸序列相似度较高的物种,下载DCL4氨基酸序列,用MEGA.X软件进行氨基酸序列比对和构建,且对构建的进化树进行自检（boot-strap）分析,设置1000次重复检验,其他参数为默认值,并利用在线工具iTOL（ https://itol.embl.de/up-load.Cgi）对进化树进行美化。
表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5°‒3°） Primer sequence (5°‒3°) | 退火温度 Tm/℃ | 扩增片段大小 Product size/bp | 用途 Usage |
|---|---|---|---|---|
| DCL4-1302.F | CATGCCATGGATGATCCCTGAGATACTATTGCGG | 60.3 | 1920 | 亚细胞定位 |
| DCL4-1302.R | GGACTAGTGATGACTCTGAAGGACATTTCTTGGA | |||
| DlDCL4-qFor | CAAGAAAGCGGTGGAGGAGAAC | 60.3 | 160 | qPCR |
| DlDCL4-qRev | CTGATGAACGAGAGCAACTGTAGG | |||
| EF-1a-qFor | GATGATTCCCACCAAGCCCAT | 60.0 | 160 | 内参基因 |
| EF-1a-qRev | GGGTCCTTCTTCTCAACACTCT |
注：划线部分为酶切位点。 | |
Note: The underline sections show restriction enzyme digest site. |
1.2.3 线性载体的获得 将带有1302质粒的大肠杆菌进行扩繁培养,使用TIANGEN公司的TIANGEN试剂盒提取质粒。利用NcoⅠ以及BcuⅠ2种核苷酸限制性内切酶对上一步骤获得的质粒进行切割得到线性的质粒,并且DCL4基因两端有着可配对序列的线性DNA片段,通过凝胶电泳检测获得的DNA片段是否为目的线性DNA片段。
1.2.4 龙眼DCL4的亚细胞定位 将线性载体和目的基因连接后将含有重组质粒菌液涂板至含有抗生素的培养基中进行筛选,同样地挑菌后进行菌液PCR,将含有重组质粒的大肠杆菌使用2种内切酶进行酶切验证,验证成功后的大肠杆菌可以用于转化农杆菌。随后将含有重组质粒的农杆菌侵染洋葱内表皮细胞后使用共聚焦显微镜观察。
1.2.5 实时荧光定量PCR 使用Trans Gene生物公司的TransZol Up试剂盒提取处理后样品的总RNA,然后用TaKaRa生物公司PrimeScriptTM IV 1st Strand cDNA Syn-thesis Mix试剂盒进行cDNA合成,具体步骤参考试剂盒说明书。用DNAMAN设计用于qPCR的引物后送至尚亚生物公司合成（表1）,以EF-1a为内参基因,以上一步反转录的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,每个模板进行3个重复实验,反应体系为20 μL,反应设置为40个循环。 DCL4成员的相对表达量用2‒ΔΔCT法计算。
1.3 数据处理
使用Excel软件对实时荧光定量PCR数据进行统计和计算,使用SPSS软件对结果进行差异显著性分析,并且使用GraphPad Prism 6.01软件绘制统计图。
2 结果与分析
2.1 龙眼DCL4氨基酸序列比对和进化分析
2.2 重组质粒构建
图3 重组质粒构建A：PCR扩增;B：重组载体酶切电泳验证;C：重组质粒结构图;M1：DL2000 marker;1：目的基因;2：重组载体;M2：DL5000 maker。 Fig. 3 Recombinant plasmid construction A: PCR amplification; B: Recombinant vector digestion and electrophoresis verification; C: Recombinant plasmid structure; M1: DL2000 marker; 1: The target gene; 2: Recombinant vector; M2: DL5000 maker. |
2.3 DlDCL4亚细胞定位分析
采用农杆菌介导法将DlDCL4:GFP瞬时表达于洋葱鳞叶表皮细胞,用激光扫描共聚焦显微镜观察DlDCL4的亚细胞定位（图4）。实验组的洋葱细胞在暗场下表现为细胞核散发绿色荧光,但其他位置不发出绿色荧光,空白对照组表现为整个细胞都发出绿色荧光,说明龙眼DlDCL4定位于细胞核中。
2.4 龙眼DlDCL4在外源ABA和SA处理下表达模式
从图5可知,浓度为100 μmol/L外源ABA处理可显著下调 DlDCL4的表达。而在100 μmol/L的外源SA处理下, DlDCL4的表达量明显上调,处理8、24 h时,其表达量显著上调。
3 讨论
研究表明,在一定浓度范围下,外源SA激素处理可以诱导烟草对某些病毒的获得性抗性[23]。研究发现,经过诱导剂处理后,柑橘对黄龙病的抗性有了极显著的提高,同时SA代谢通路中的关键基因上调表达4~10倍[26]。在龙眼中研究发现,SA处理可以使抗病原相关基因的显著性上调表达[27]。除此之外,在葡萄抗霜霉病[28]、番茄抗叶霉病[29]、苹果抗轮纹病[30]等植物对生物性病原的抗性研究中均有类似的发现。以上研究结果表明,SA信号传导途径在植物响应非生物胁迫过程中发挥了重要作用。同时也有研究发现,SA可通过上调21 nt的siRNA含量导致拟南芥染色体着丝粒区域的兆碱基规模的甲基化途径提高其对植物病原体的抗性[31],DCL4蛋白在大部分生物中的主要功能是特异性切割长链dsRNA产生siRNA作用于相关靶基因,沉默其表达进而调控植株的生长发育和抗性反应[32]。研究发现SA可以沉默马铃薯梅豆病毒的RNA的转录[33]。在本试验中,外源SA激素处理后,龙眼胚性愈伤组织的DCL4显著性上调表达,由此推测,外源SA通过诱导DCL4基因的上调表达响应病害胁迫。
本研究分别用含有100 μmol/L的ABA和100 μmol/L的SA处理龙眼胚性愈伤组织,结果表现出ABA抑制 DlDCL4表达甚至沉默,而SA明显促进DlDCL4表达。已有研究表明,体胚细胞发生过程中,单独加入ABA会抑制其发生[34],在龙眼胚性愈伤组织中的试验也证明了在外源ABA存在的情况下,DlDCL4的表达受到明显的抑制[16],但本研究对其进行时间梯度处理下DlDCL4的表达量总体没有表现出变化趋势,这可能和ABA处理的浓度有关,外源ABA浓度太高导致时间梯度处理对DlDCL4的表达量不产生影响;在对抗棉花抗枯萎病相关基因WRKY的研究中发现,在使用外源SA处理3 h后WRKY的表达量出现最大值[35],并且推测SA可以刺激棉花在短时间内对枯萎病毒产生应激反应。在本研究中DlDCL4在SA处理8 h时出现最大表达量,和其结果相类似,因此,猜测8 h是DlDCL4响应外源SA刺激时的关键时间。DlDCL4在龙眼体愈伤组织阶段响应激素应答和抵抗非生物胁迫的具体机制还需要进一步深入研究。