香蕉是我国重要的经济作物,也是全球销量最大的水果之一[1]。氟唑菌酰羟胺（pydiflumetofen）与苯醚甲环唑（difenoconazole）混用可用于防治香蕉叶斑病。氟唑菌酰羟胺是由先正达公司最新研发的新型吡唑酰胺类杀菌剂,其结构新颖、杀菌广谱,适用于多种作物上防治赤霉病、灰霉病、叶斑病等在内的多种病害[2,3]。苯醚甲环唑是一种三唑类杀菌剂[4,5],具有杀菌范围广、内吸性强等特点,现已广泛应用于蔬菜、豆类、水果等作物上的真菌防治,且具有较好的防治效果[6,7]。两者复配,可被植株叶片迅速吸收,对植株进行全面的保护[8,9]。随着氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑的广泛使用,其在香蕉等作物中的残留及安全性问题受到广泛关注。我国食品安全国家标准GB 2763— 2019中规定苯醚甲环唑在香蕉中的最大残留限量（MRL）为1 mg/kg,目前尚未制定氟唑菌酰羟胺在任何作物上的MRL标准;国外仅查到美国有少量氟唑菌酰羟胺在果蔬、谷物和畜禽上的残留限量,香蕉上尚未制定MRL。
目前,国内外氟唑菌酰羟胺的残留测定文献相对较少,智沈伟等[10,11]分别采用分散固相萃取-分散液液微萃取/高效液相色谱法和固相萃取-高效液相色谱法测定了西瓜中氟唑菌酰羟胺残留量,线性关系良好,定量限分别为0.01、0.02 mg/kg,但是前处理略显复杂。同时智沈伟[12]、孔顺等[13]、Rong等[14]、Wu等[15]分别采用色谱-质谱联用技术检测了氟唑菌酰羟胺在西瓜、土壤、葡萄等基质中的残留。苯醚甲环唑的检测主要采用液相色谱法[16,17]、气相色谱法[18,19]和色谱质谱联用法[20,21,22]。Zheng等[23]采用GC-ECD测定了单剂产品250 g/L苯醚甲环唑乳油在香蕉中的消解残留,并对其进行了膳食摄入风险评估;Huan等[24]对30%苯醚甲环唑·嘧菌酯悬浮剂在海南、云南的香蕉及土壤中的消解残留进行研究,未进行膳食风险评估。色谱质谱联用法检测农药具有快捷、准确度高、灵敏度高等特点,但由于氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑沸点均较高,采用气相色谱-质谱联用法测定时需要较高温度（300 ℃以上）才能出峰,易产生严重的柱流失现象,导致灵敏度较差[25]。同时,氟唑菌酰羟胺残留消解行为目前仅查到在西瓜上有研究报道,苯醚甲环唑主要集中在西瓜[26]、香蕉[27]、芹菜[4]等作物上;而氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑同时作用于香蕉的残留消解行为及其膳食风险评估尚未见文献报道。鉴于此,本研究建立了氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在香蕉中的超高效液相色谱-质谱/质谱分析方法,并于云南进行了田间试验,分析其中的氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑的残留与消解过程,同时对两者残留的膳食风险进行评估,以期对两者在香蕉上的混配安全使用提供科学依据,也为制定适合我国国情的香蕉中氟唑菌酰羟胺最大残留限量标准提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 田间试验香蕉品种：‘巴西香蕉’。试验地：云南昆明。
CNW BOND LC-C18填料,上海斯信生物科技有限公司;氟唑菌酰羟胺标准品（99.5%）,先正达公司;苯醚甲环唑标准品（98%）,德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;丙酮、甲醇、二氯甲烷、乙腈,均为色谱纯;NaCl和无水MgSO4（140 ℃烘烤4 h）,均为分析纯。
试验药剂：200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑悬浮剂（苯醚甲环唑125 g/L,氟唑菌酰羟胺75 g/L）。
1.1.2 仪器与设备 API4000+超高效液相色谱-串联质谱,美国AB SCIEX公司;T18高速均质机,德国IKA集团;Himac CR 22N高速冷冻离心机,日本日立公司。
1.2 方法
1.2.1 田间试验 （1）消解试验。200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑悬浮剂（苯醚甲环唑125 g/L,氟唑菌酰羟胺75 g/L）以施药剂量（有效成分）300.2 mg/kg对香蕉均匀喷雾施药,施药次数为1次,每个小区3株香蕉树,3次重复,另设清水进行空白对照。施药后于0、1、3、7、14、21、28、35、42、49 d时采集香蕉样品。随机采取香蕉树上不同部位的果实2 kg, 香蕉匀浆后混匀作为全果样品,用刀具取出蕉肉匀浆后混匀作为果肉样品,各取250 g样品,-20 ℃冰箱冷冻,待测。
（2）最终残留试验。施药剂量分别为200.1、300.2 mg/kg,施药3次和4次,每个处理3次重复,施药间隔为10 d。每个小区设3株香蕉树,另设清水对照。采样距末次施药时间分别为21、28、35 d。
1.2.2 样品前处理 称取(10.00±0.10)g待测样于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈,匀浆3 min,加入10.0 g烧过的NaCl,旋涡混匀3 min,8000 r/min离心5 min（15 ℃）;取上清液10 mL加入到装有100 mg C18和250 mg无水MgSO4的离心管中,旋涡混匀1 min,8000 r/min离心5 min（15 ℃）;取上清液过0.22 μm滤膜,超高效液相色谱-串联质谱检测。
1.2.3 检测条件 （1）色谱检测条件。液相色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18（2.1 mm×50 mm, 1.7 μm）。流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）,流速0.25 mL/min,进样量5 μL,柱温35 ℃。洗脱梯度：0~0.1 min,10%A-90%B;2.0~3.0 min,90%A-10%B;3.1~5 min,10%A-90%B。总分析时间5 min。
（2）质谱检测条件。电喷雾正离子模式扫描（ESI+）,多反应监测（MRM）。喷雾电压（IS）5000V,喷雾针温度（TEM）600 ℃,雾化气（GS1）50 psi,辅助加热气（GS2）50 psi,气帘气（CUR）20 psi,碰撞气（CAD）6 psi。其他参数见表1。
表1 氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑质谱参数Tab. 1 MS /MS parameters of pydiflumetofen and difenoconazole in MRM mode |
| 待测物 Tested pesticides | 母离子（m/z） Parent ion | 子离子（m/z）a Product ion | 去簇电压DP/V | 射入电压EP/V | |
|---|---|---|---|---|---|
| 定量离子Quantitative ion | 定性离子Qualitative ion | ||||
| 氟唑菌酰羟胺 | 426.0[M+H]+ | 192.9(38.12) | 221.0(23.21) | 109.10 | 10 |
| 苯醚甲环唑 | 406.3[M+H]+ | 251.0(34.88) | 337.0(23.89) | 131.31 | 10 |
注：a碰撞能量（CE） | |
Note: a Collision energy (CE). |
1.2.4 准确度与精密度测定 称取氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑标准品各0.01 g（精确至±0.0001 g）,用乙腈溶解,配成100 mg/L标准品母液,置于100 mL棕色容量瓶中,备用。使用时将2种母液等比例混合后分别用乙腈提取的全果、果肉空白基质液稀释,分别得到0.005、0.010、0.020、0.030、0.050 μg/mL的基质匹配标准溶液,于-18 ℃避光保存。按照1.2.3的条件检测,以峰面积为应变量,以质量浓度为自变量绘制标准曲线。在全果、果肉空白中分别添加质量浓度为0.01、0.1、1 mg/kg 3个水平的农药,每个水平5次重复,按照1.2.2和1.2.3进行样品前处理和检测,计算回收率及相对标准偏差（RSD）,同时做空白对照。
1.2.5 消解曲线及半衰期 消解曲线及半衰期分别按照公式（1）和（2）进行计算。
$C={{C}_{0}}\times \exp (-\text{K}\times t)$
$DT50=\ln 2/\text{K}$
式中：C为农药残留量,mg/kg;C0为农药原始沉积量,mg/kg;K为消解系数;t为时间,d;DT50为半衰期,d。
1.2.6 膳食风险评估 参考文献[9],膳食摄入风险评估采用理论每日最大摄入量（theoretical maximum daily intake,TMDI）进行评估。TMDI按公式（3）计算,风险商（risk quotient,RQ）按公式（4）计算。
$\text{TMDI=}\sum{\text{(MR}{{\text{L}}_{i}}\times {{\text{F}}_{i}})}$
$RQ=TMDI/(ADI\times bw)$
式中：TMDI,ug/d;MRLi（maximum residue limit）指第i级农产品中最大残留限量值,mg/kg;Fi （food intake）为不同人群对第i级农产品的膳食消费量,g/d;ADI（acceptable daily intake）为每千克体重的每日允许摄入量,mg/(kg·d);bw为人群平均体重,kg。
2 结果与分析
2.1 提取条件的选择
常用有机溶剂乙腈、丙酮和二氯甲烷对氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑都有一定的提取效率。其中,氟唑菌酰羟胺在3种溶剂中的溶解度大小顺序为二氯甲烷>丙酮>乙腈,苯醚甲环唑为丙酮>二氯甲烷>乙腈。3 种溶剂中,毒性最低的为丙酮,但其共萃取物太多;二氯甲烷与乙腈毒性相当,但考虑到二氯甲烷沸点较低（39.75 ℃,760 mm Hg）,对试验人员和环境均产生较大危害;因此,选择乙腈作为最终提取溶剂。
2.2 检测条件的选择
对影响定量离子响应值和灵敏度的关键质谱参数碰撞能量（CE）和去簇电压（DP）进行优化。对于氟唑菌酰羟胺,固定DP调整CE时,当CE为38.12 V时,离子的响应值最大,灵敏度最高;此时固定CE为38.12 V时,调整DP,使得定量离子响应值最大,当DP为109.1 V时即可获得较强的分子离子峰强度,再增加电压强度未见明显增加,此时氟唑菌酰羟胺的保留时间适中,峰形及分离度良好,所以选择CE为38.12 V、DP为109.1 V作为定量离子的最佳质谱参数。同上,苯醚甲环唑选择CE为34.88 V、DP为131.31 V作为定量离子的最佳质谱参数。氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑香蕉基质标准溶液优化后的总离子流图（TIC）及定量离子流图见图1。
2.3 标准曲线及线性范围
在质量浓度为0.005~0.050 μg/mL范围内,香蕉全果和果肉中氟唑菌酰羟胺标样线性方程和相关系数为：Y=7E+06X+5887.8,R2=0.9989;Y=1E+ 07x + 2347.4,R2=0.9968。香蕉全果和果肉中苯醚甲环唑标样线性方程和相关系数为：Y=6E+06X+ 97427,R2=0.9991;Y= 2E+07x + 148563,R2=0.9931。
2.4 方法准确度、精密度和灵敏度
表2 氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在香蕉中的回收率及相对标准偏差(n=5)Tab. 2 Recoveries and relative standard deviations of pydiflumetofen and difenoconazole in banana (n=5) |
| 农药 Pesticides | 样品 Samples | 添加浓度 Spiked concentration /(mg·kg-1) | 回收率 Recovery/% | 平均回收率 Average recovery/% | 相对标准偏差 RSD/% | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ | |||||
| 氟唑菌酰羟胺 | 全果 | 0.01 | 112 | 114 | 115 | 113 | 114 | 114 | 1.1 |
| 0.1 | 118 | 105 | 116 | 118 | 116 | 115 | 5.0 | ||
| 1 | 105 | 107 | 108 | 108 | 108 | 107 | 1.0 | ||
| 果肉 | 0.01 | 72 | 77 | 77 | 76 | 72 | 75 | 3.6 | |
| 0.1 | 95 | 94 | 93 | 93 | 93 | 94 | 1.0 | ||
| 1 | 100 | 97 | 98 | 97 | 96 | 98 | 1.3 | ||
| 苯醚甲环唑 | 全果 | 0.01 | 92 | 92 | 89 | 91 | 90 | 91 | 1.2 |
| 0.1 | 109 | 97 | 108 | 112 | 105 | 106 | 5.3 | ||
| 1 | 93 | 93 | 91 | 94 | 90 | 92 | 1.5 | ||
| 果肉 | 0.01 | 78 | 74 | 84 | 78 | 79 | 78 | 4.7 | |
| 0.1 | 91 | 89 | 90 | 90 | 88 | 90 | 1.3 | ||
| 1 | 86 | 86 | 87 | 87 | 85 | 86 | 1.0 | ||
2.5 消解行为
氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑消解曲线见图2。在香蕉中,氟唑菌酰羟胺的消解动态方程为y=0.4118e-0.041x,R2=0.8132,DT50=16.9 d;苯醚甲环唑的消解动态方程为y=0.5795e-0.034x,R2=0.869,DT50=20.4 d,消解规律均符合一级动力学模型。施药49 d后,2种农药在香蕉上的降解率分别达到93.5%和87.6%。
2.6 最终残留
按照试验设计,香蕉全果和果肉中氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑的最终残留量见表3。在最后1次施药后21、28、35 d时,氟唑菌酰羟胺在云南香蕉全果及果肉中的残留量均小于0.01 mg/kg。苯醚甲环唑在云南全果中的残留量为ND~ 0.048 mg/kg之间;在果肉中的残留量为ND~ 0.015 mg/kg之间。氟唑菌酰羟胺在香蕉全果和果肉中的规范残留试验中值（supervised trials median resi-due, STMR）和最高残留值（highest residue, HR）均小于 0.01 mg/kg。苯醚甲环唑在香蕉全果中STMR为0.017 mg/kg,HR为0.051 mg/kg;肉中STMR为0.013 mg/kg,HR为0.018 mg/kg。在距最后1次施药后21、28、35 d收获的香蕉全果和果肉中,苯醚甲环唑残留量均小于1 mg/kg（GB 2763—2019中规定苯醚甲环唑在香蕉中的MRL为1 mg/kg）。即距末次喷药21、28、35 d收获香蕉时均为安全。
表3 氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在香蕉中的最终残留Tab. 3 Pydiflumetofen and difenoconazole residue in banana |
| 样品 Samples | 喷药量 Sprayingdose/(mg·kg-1) | 喷药次数 Spraying number | 氟唑菌酰羟胺残留量 Pydiflumetofen residue/(mg·kg-1) | 苯醚甲环唑残留量 Difenoconazole residue/(mg·kg-1) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 21 d | 28 d | 35 d | 21 d | 28 d | 35 d | |||
| 全果 | 200.1 | 3 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
| 200.1 | 4 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |
| 300.2 | 3 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0.021 | <0.01 | 0.011 | |
| 300.2 | 4 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0.048 | 0.030 | <0.01 | |
| 果肉 | 200.1 | 3 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
| 200.1 | 4 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |
| 300.2 | 3 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0.015 | <0.01 | <0.01 | |
| 300.2 | 4 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 0.014 | <0.01 | <0.01 | |
2.7 膳食风险评估
氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑都是我国登记的农药,根据 GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》,苯醚甲环唑的ADI为0.01 mg/kg,苯醚甲环唑在香蕉上的MRL为1mg/kg。氟唑菌酰羟胺的ADI为0.092 mg/kg,我国尚未对氟唑菌酰羟胺的MRL作出规定。氟唑菌酰羟胺以本研究得出的香蕉中残留中值计算,得到膳食风险评估结果如表4。氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑的风险商分别为0.73%和78.21%,膳食风险均可接受。
表4 氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑膳食风险评估Tab. 4 Dietary risk assessment of pydiflumetofen and difenoconazole |
| 食物 Foods | 膳食量Dietaryintake/kg | 氟唑菌酰羟胺Pydiflumetofen | 苯醚甲环唑Difenoconazole | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 参考限量 Reference limits/(mg·kg-1) | 限量来源 Source of reference limits | 理论每日 最大摄入量 TMDI/mg | 参考限量 Reference limits/(mg·kg-1) | 限量来源 Source of reference limits | 理论每日 最大摄入量 TMDI/mg | ||
| 米及其制品 | 0.2399 | 0 | 0.5 | 中国 | 0.1200 | ||
| 面及其制品 | 0.1385 | 0.3 | 美国 | 0.0416 | 0.1 | 中国 | 0.0139 |
| 其他谷类 | 0.0233 | 0 | 0.1 | 中国 | 0.0023 | ||
| 薯类 | 0.0495 | 0 | 0.02 | 中国 | 0.0010 | ||
| 干豆类及其制品 | 0.0160 | 0 | 0.05 | 中国 | 0.0008 | ||
| 深色蔬菜 | 0.0915 | 0 | 1 | 中国 | 0.0915 | ||
| 浅色蔬菜 | 0.1837 | 0 | 1 | 中国 | 0.1837 | ||
| 腌菜 | 0.0103 | 0 | 0 | ||||
| 水果 | 0.0457 | 0.013 | 残留中值 | 0.0006 | 1 | 中国 | 0.0457 |
| 坚果 | 0.0039 | 0 | 0.03 | 中国 | 0.0001 | ||
| 畜禽类 | 0.0795 | 0 | 0 | ||||
| 奶及其制品 | 0.0263 | 0 | 0 | ||||
| 蛋及其制品 | 0.0236 | 0 | 0 | ||||
| 鱼虾类 | 0.0301 | 0 | 0 | ||||
| 植物油 | 0.0327 | 0 | 0.2 | 中国 | 0.0065 | ||
| 动物油 | 0.0087 | 0 | 0 | ||||
| 糖、淀粉 | 0.0044 | 0 | 0.05 | 欧盟 | 0.0002 | ||
| 食盐 | 0.0120 | 0 | 0 | ||||
| 酱油 | 0.0090 | 0 | 3 | 欧盟 | 0.0270 | ||
| 合计 | 1.0286 | 0.0421 | 0.4927 | ||||
| 日允许摄入量/mg | ADI×63 | 5.80 | 0.63 | ||||
| 风险商/% | 0.73% | 78.21% | |||||
3 讨论
本研究通过前处理及检测条件的选择和优化,建立了氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在香蕉全果和果肉中的超高效液相色谱-串联质谱检测方法,最低检出浓度为0.01 mg/kg。氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在云南香蕉中的半衰期分别为16.9、20.4 d,2种农药在香蕉中属于消解较慢的农药。最终残留结果表明,2种农药分别按施药剂量200.1 mg/kg和300.2 mg/kg,对香蕉进行3次和4次喷药,末次施药后21、28、35 d采样,氟唑菌酰羟胺在全果和果肉中的最终残留量均小于0.01 mg/kg;苯醚甲环唑在全蕉中的残留量最高为0.048 mg/kg,在果肉中残留量最高为0.015 mg/kg,其残留量均低于香蕉中苯醚甲环唑的国家残留限量标准（GB 2763—2019中规定苯醚甲环唑在香蕉中的MRL为1 mg/kg）。苯醚甲环唑残留量在全果中高于果肉中,说明香蕉中农药主要残留部位为果皮,这可能是因为苯醚甲环唑为亲脂性农药,容易附着于含蜡质的果皮上。氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在果肉中的回收率较全果偏低,这可能是因为香蕉果肉中含糖量较高,基质较复杂的原因,但是试验结果都满足《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788—2018）对农药回收率的要求。
结合我国农药氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑的登记情况和我国居民的人均膳食结构,普通人群氟唑菌酰羟胺的国家估算每日摄入量是0.0421 mg,占日允许摄入量的0.73%;苯醚甲环唑的国家估算每日摄入量是0.4927 mg,占日允许摄入量的78.21%。结果表明,其残留风险较低,处于可接受水平,对一般人群健康不会产生不可接受的风险。
目前,我国尚未制定氟唑菌酰羟胺在任何作物上的最大残留限量（MRL）标准,本研究可为我国建立氟唑菌酰羟胺在香蕉中的残留限量标准提供参考。同时,也为评价氟唑菌酰羟胺和苯醚甲环唑在香蕉上的混配合理安全使用提供理论依据。