种子萌发是指具有生活力的种子吸水膨胀后,胚根突破种皮的过程[1]。种子能否正常萌发对其后期是否能够正常生长发育,以及正常结实具有重要的作用。种子萌发受到外部和内部因素双重影响,外部因素主要包括光照、温度、水分等;内部主要受到自身基因、激素及活性氧等影响。
过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）是植物正常生理过程产生的代谢产物,早先被认为仅是具有毒害作用的活性氧[2]。但近年的研究发现,适当浓度的H2O2可作为逆境信号分子,参与调控植物的抗逆性[3,4]。已有研究证实,外源H2O2可以提高铝胁迫下小麦根尖的抗氧化代谢水平,缓解铝胁迫导致的氧化损伤,从而增强小麦对铝胁迫的适应性[5]。适量的外源H2O2还可降低干旱下水稻糊粉层细胞内H2O2的含量,延缓糊粉层细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）[6],从而缓解干旱对水稻种子萌发的影响。
植物体内H2O2主要是由NADPH合成酶途径产生。碘二苯（diphenylene iodonium, DPI）作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）合成酶专一性抑制剂,预处理棉花种子会降低种子萌发率[7]。二甲基硫脲（dimethylthiourea, DMTU）是H2O2的清除剂,可降低H2O2含量,从而抑制莴苣种子萌发[8];DPI和DMTU均可减少干旱条件下水稻糊粉层中过量的H2O2,以提高淀粉酶活性,缓解干旱对水稻种子萌发的抑制作用[9]。DPI和DMTU还可降低中国石竹超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）活性[10],影响山黎豆种子萌发和初生根生长[11]。
目前对于内源H2O2影响正常生长条件下水稻种子萌发的研究仍较少,因此,本研究用不同浓度NADPH合成酶抑制剂DPI和H2O2清除剂DMTU处理水稻种子,阐明其胚根和胚芽生长等萌发状况,并探究DMTU处理下胚根根尖超氧阴离子（superoxide anion, O2-）含量和H2O2含量及细胞膜透性的变化,以期为进一步研究内源H2O2调控水稻种子萌发的机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为水稻（Oryza sativa L.）杂交种‘博Ⅱ优767’种子,购自海南儋州种子站。选取均匀饱满、大小一致、去除稻壳的种子50粒,放入垫有双层滤纸的培养皿中,并于光照培养箱进行培养。培养条件为：光照周期16/8 h（昼/夜）,光照强度400 μmol/(m2·s),温度26 ℃。
1.2 方法
1.2.1 实验处理 实验设为13个处理：分别包括水（CK）、DPI和DMTU。其中,DPI设置6个浓度,分别为10、20、30、40、50、60 μmol/L,同样DMTU 也设置有6个浓度,包括10、20、30、40、50、60 mmol/L,每个处理设3次重复,每天更换对应的处理液。
1.2.2 胚芽长、胚根长观测及测量 分别于培养的24 h及48 h观测并拍照萌发水稻种子。培养3 d后,从每个处理中随机选取10粒种子,纯水洗净并用滤纸吸干表面水分,用直尺测量胚根长和胚芽长。
1.2.3 根系活性氧含量高低及质膜透性大小观察 参照氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazorium blue chloride, NBT）染色法[12]观察水稻种子胚根根尖O2-含量。分别从各处理中随机选取培养3 d的萌发水稻种子,用手术刀切取根尖放入NBT染液（1 mmol/L,pH 5.8）中染色5 min,用纯水多次冲洗根尖,洗净后观察。
参照二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）染色法[13]观察水稻种子胚根根尖H2O2含量。同样随机选取培养3 d的萌发水稻种子,切取根尖于二氨基联苯胺染液（1 mg/mL,pH 5.8）中染色30 min后,用纯水洗净、观察。
参照伊文思蓝染色法[14]观察质膜透性大小。将萌发3 d水稻种子根尖放入0.125%伊文思蓝染液染色5 min后,取出用蒸馏水洗净观察。
以上水稻种子胚根根尖染色后,均采用Olympus（SZX7）体式显微镜观察并拍照。
1.3 数据处理
实验数据采用SPSS软件进行方差分析（analysis of variance, ANOVA）,对处理间的差异性多重比较采用最小显著性差异法（least significant difference, LSD）进行分析,用Excel和Photoshop软件作图。
2 结果与分析
2.1 NADPH合成酶抑制剂DPI对水稻种子萌发中胚根生长和胚芽生长的影响
由图1可见,在水培养24 h后,水稻种子的胚根和胚芽均突破了种皮,而不同浓度DPI培养24 h后,只有10 μmol/L处理的种子稍微露出胚根和胚芽,20、30 μmol/L处理的仅露出胚芽部分,其余处理的胚根和胚芽均未露出。浸种48 h后,水培养的胚根远长于胚芽,10~30 μmol/L DPI处理的水稻种子仅露出一小段胚根,而40~60 μmol/L DPI处理的水稻种子则未见胚根露出。虽然不同浓度DPI处理下均可观察到胚芽,但随着DPI浓度的升高,胚芽长度逐渐缩短。以上结果表明,NADPH合成酶抑制剂DPI以依赖浓度效应影响水稻种子胚根及胚芽生长,且对胚根生长的影响效应远大于对胚芽的影响。
由于DPI对胚根生长抑制较严重,致使培养3 d的水稻种子大部分未有胚根露出,因此,本研究仅对DPI处理的水稻种子胚芽长度进行测量。从图2可知,与水培养的胚芽长度相比,不同浓度NADPH合成酶抑制剂DPI培养水稻种子3 d后,胚芽的长度受到明显的抑制,抑制率均超过50%,且随着处理浓度的递增,胚芽长度显著地递减。
由此可见,因DPI减少了水稻种子内由NADPH途径产生的内源H2O2,从而影响了水稻种子萌发过程胚根及胚芽的生长,尤其是严重抑制胚根的生长。这些结果表明了由NADPH途径产生的内源H2O2在调控水稻种子萌发中起着关键的作用。
2.2 H2O2清除剂DMTU对水稻种子萌发中胚根和胚芽生长的影响
如图3所示,不同浓度DMTU培养水稻种子24 h后,其胚根全部突破种皮,其中10 mmol/L DMTU处理的胚根长度与正常处理的较为接近,20 mmol/L DMTU处理的胚根长度与30 mmol/L DMTU处理的也极为接近,且均明显高于40~ 60 mmol/L DMTU处理的。同时,不同浓度DMTU处理的胚芽长度均明显不如正常处理的,其中,60 mmol/L DMTU处理的胚芽仍未伸长,10~ 30 mmol/L DMTU处理的胚芽长度较为接近,40 mmol/L及50 mmol/L DMTU处理的胚芽仅露出一点。水稻种子经过48 h培养后,10 mmol/L DMTU处理的胚芽及胚根长与正常处理的较为接近,20 mmol/L与30 mmol/L DMTU 处理的胚芽及胚根长度也较为接近,而50、60 mmol/L DMTU处理的胚根长度明显不如其他浓度DMTU处理的。由此可见,水稻种子经过不同浓度H2O2清除剂DMTU处理24 h或48 h后,萌发情况与DPI处理的相似,均呈现浓度效应,亦随着DMTU浓度增大,对胚根及胚芽生长的抑制作用越大。
由图5可见,10 mmol/L DMTU处理对胚芽生长影响较小,在处理水稻种子3 d后,其胚芽长度仍为正常处理的88%。20、30 mmol/L DMTU处理对胚芽长度的影响较为接近,仅相差0.1 cm,约为正常处理的70%~65%,这两者间差异不显著。与正常处理相比,40 mmol/L DMTU处理的胚芽长度被抑制了50%,50~60 mmol/L DMTU处理对胚芽长度的抑制极其显著,其中60 mmol/L DMTU处理的胚芽长度仅为正常处理的30%（p<0.05）。
由此可见,清除种子内H2O2抑制了水稻种子萌发过程胚根和胚芽的生长,从而影响种子的萌发,表明水稻种子的萌发需要种子内一定量的H2O2参与。
2.3 H2O2清除剂DMTU对萌发水稻种子胚根根尖O2-产生的影响
O2-可与NBT反应生成蓝紫色不溶于水的显色物,其颜色深浅代表O2-的含量高低,颜色越深,O2-积累越多。由图6可以看出,正常处理的胚根根尖颜色最深,即其O2-含量最高;10 mmol/L DMTU处理的胚根根尖颜色仅次于正常处理的,20~ 40 mmol/L DMTU处理的胚根根尖颜色随着浓度升高而变浅,表明O2-含量随浓度升高而减少;50、60 mmol/L DMTU处理的胚根根尖仅被轻微染色。因此,随着H2O2清除剂DMTU浓度的升高,萌发水稻种子胚根根尖颜色逐渐变浅,即根尖O2-含量随之减少,呈现出一定的浓度效应。
2.4 H2O2清除剂DMTU对萌发水稻种子胚根根尖H2O2产生的影响
植物体内H2O2被过氧化物酶分解后,可与DAB生成不溶于水的棕色产物,因此,根据颜色的深浅可以反映出细胞内H2O2含量的高低,颜色越深,H2O2的含量就越高。如图7所示,正常处理的萌发水稻种子胚根根尖染色最深,10 mmol/L DMTU处理的胚根根尖颜色比正常处理的的稍浅,说明10 mmol/L DMTU处理的胚根根尖H2O2含量与正常处理的较为接近,20、30 mmol/ L DMTU两者处理的根尖颜色也比较接近,50 mmol/L DMTU处理的根尖只有轻微染色, 60 mmol/L DMTU处理的胚根根尖几乎没染上颜色。因此,随着DMTU处理浓度越高,水稻种子胚根根尖染色越浅,且着色多集中于根尖前端,表明水稻种子胚根中H2O2含量与O2-含量趋势相同,H2O2清除剂DMTU浓度越大,H2O2含量与O2-含量越少。
2.5 H2O2清除剂DMTU对萌发水稻种子胚根根尖细胞透性的影响
伊文思蓝可进入细胞膜透性增大的细胞,蓝色深浅代表根尖细胞膜透性大小,颜色越深,细胞膜透性越大,表明细胞受伤害程度越高。从图8可见,随着DMTU浓度逐渐增大,萌发水稻种子胚根根尖伊文思蓝染色逐渐加深。正常处理的胚根根尖染色最浅,表明其细胞膜透性最小,细胞受伤害最轻;10~30 mmol/L DMTU处理的胚根根尖染色慢慢变深,即细胞膜透性逐渐增大;从40 mmol/L DMTU处理开始染色急剧加深,至60 mmol/L DMTU染色最深,说明此时细胞受伤害最严重。由此可见,随着DMTU浓度增加,伊文思蓝染色越来越深,表明胚根根尖细胞膜透性变大,即细胞受伤害程度逐渐增大,而根系活力逐渐变小,胚根正常生长受到一定的影响。
图8 不同浓度DMTU处理下萌发水稻种子胚根根尖伊文思蓝染色变化Fig. 8 Changes of Evans blue staining in root tips of germinated rice seeds treated with different concentrations of DMTU A: 0 mmol/L DMTU; B: 10 mmol/L DMTU; C: 20 mmol/L DMTU; D: 30 mmol/L DMTU; E: 40 mmol/L DMTU; F: 50 mmol/L DMTU; G: 60 mmol/L DMTU. |
3 讨论
在本研究中,不同浓度的NADPH氧化酶抑制剂DPI处理水稻种子后,其胚根长和胚芽长都受到明显抑制,并呈现出浓度效应,即浓度越高,抑制效果越明显。其中,20 μmol/L DPI处理的胚芽长度约为对照的45%左右,30~60 μmol/L DPI处理的胚根几乎不生长。孔祥强等[7]研究表明,用DPI预处理棉花种子后,种子内H2O2含量降低,萌发率也降低。此外,DPI处理绿豆幼苗外植体48 h后,不定根形成会完全被抑制,说明细胞中H2O2产生变少,导致绿豆不定根生长受阻[15]。本研究结果显示,DPI作为NADPH合成酶专一性抑制剂可抑制由NADPH途径产生的内源H2O2,进而阻碍水稻种子萌发及生长,尤其是胚根的生长。因此,我们推断,由此产生的内源H2O2与水稻胚根生长发育紧密相关,并且可能是调控水稻胚根生长与发育的重要因子。
在本研究中,水稻种子经DMTU处理后,也呈现出浓度效应,即胚根及胚芽生长受到的抑制作用均随DMTU浓度递增而增强,且DMTU对胚根和胚芽的抑制作用相当。张凤芝等[8]的研究也证实,莴苣种子经DMTU处理后,因H2O2被清除,导致外源多鞍对种子萌发的促进作用降低,从而使种子萌发受到抑制。此外,对水稻种子胚根根尖染色观察分析结果也表明,随着DMTU浓度增大,H2O2含量及O2-含量逐渐减少,而细胞膜透性却逐渐增大,即胚根根尖细胞受伤害程度加深。林莹等[16]研究与本研究结果相似,用NBT对大豆种子胚轴进行染色,正常种子萌发过程会产生O2-,胚轴可被NBT完全染色,而老化的种子由于失去活力,萌发生长受到影响,导致O2-产生较少,因此部分区域无染色。
在正常条件下,植物体内活性氧产生与清除处于动态平衡,因此,植物能维持正常生命活动,但一旦这种平衡被打破,其生命活动即受到影响。在本研究中,DPI和DMTU均显著影响水稻种子胚根和胚芽的生长,并且DPI比DMTU对水稻种子萌发的抑制效果更显著。张倩倩等[10]研究表明,DPI和DMTU有效地清除和减少正常条件下生长的石竹幼苗叶和根中O2-和H2O2,并且这种效果在根中更为明显,这与本实验结论相一致。通过对本实验结果进行分析,我们推测可能水稻种子正常萌发所需的内源H2O2主要来自NADPH氧化酶途径产生的H2O2,而H2O2清除剂DMTU对水稻种子萌发的抑制效果不如DPI,可能是DMTU清除的H2O2中只有部分是来自由NADPH氧化酶途径产生的H2O2。本研究还证实DPI对水稻种子胚根的影响远大于对胚芽的影响,说明NADPH产生的内源H2O2主要是通过调控水稻种子胚根的发生来影响萌发。此外,DMTU因清除部分NADPH氧化酶途径产生的H2O2,因此,在一定程度阻碍了胚根及胚芽的生长,且胚根根尖O2-含量和H2O2含量都有所减少,并引起根尖细胞损伤,从而使水稻种子的正常萌发受到影响。总之,维持内源H2O2产生与清除动态平衡对水稻种子萌发及生长至关重要。