木薯（Manihot esculenta）是三大薯类作物、六大粮食作物之一,主要生长于热带和亚热带地区,是南亚热带地区广泛种植的、用于加工淀粉和饲料的主要作物。随着我国社会经济的快速发展,对木薯相关产品需求量不断增加,木薯种植规模不断扩大。然而,热带地区的间歇性干旱使木薯种植规模的扩大受到了严重的限制。另外,作为一种典型的热带作物,对木薯响应干旱胁迫相关基因的研究不但可以挖掘木薯中的抗逆相关的功能基因,为木薯分子育种提供优秀的基因资源,而且有助于了解植物响应干旱胁迫的分子机制。
研究表明,植物在受到不同的非生物胁迫时可能会产生相似的反应,这意味着植物体内有一些通用的途径以响应不同的非生物胁迫[1,2]。胁迫响应机制的激活主要是与胁迫响应有关的基因的表达调控,其中编码调控保护基因表达的调控因子是表达调控中非常重要的一步,这类调控基因主要包括MYB、MYC、bZIP、bHLH、DREB2、AREB、NAC、WRKY类等转录因子。在拟南芥、水稻、小麦等植物中的研究表明,植物MYB基因受各种环境因子所诱导,如信号分子（ABA、SA、JA等）、病原体、干旱、低温、创伤、高盐胁迫等,在响应非生物胁迫过程中起重要的调控作用。在逆境胁迫下,MYB蛋白与该元件的结合能够激活或抑制下游胁迫响应基因的表达,从而调控与胁迫响应有关的级联信号传导途径和生理反应。
MYB基因是植物中广泛存在的一个功能多样化的基因家族,根据MYB蛋白含MYB结构域不完全重复子的个数,MYB基因可分为4类：1R、R2R3、3R、4R。综合不同植物中的研究成果,MYB基因的功能可以划分成几大块,主要集中在对以下几个生理过程的调控方面：基本次生代谢、细胞命运分化、发育过程以及响应胁迫过程。Chen等[3]的研究表明拟南芥中的R2R3-MYB基因可能广泛地参与了那些对调控植物逆境胁迫响应有重要作用的激素应答过程。拟南芥中有多个MYB基因通过ABA信号途径来调节叶片气孔开闭,包括AtMYB60、AtMYB61、AtMYB15这3个R2R3-MYB基因[4,5,6]。另外,AtMYB44基因可以抑制ABI1/2、HAB1/2、AtPP2CA基因的表达,以此抑制ABA信号因子的产生,调控气孔开闭,从而提高拟南芥对一些非生物胁迫的耐受性[7]。
植物在受到逆境胁迫后到对相应的逆境有一定耐受性的过程中,除气孔开闭调节外,相关代谢物的产生和累积也发挥着重要的作用。研究表明,MYB基因通过ABA信号途径参与到逆境胁迫相关代谢物的产生和累积过程中。在干旱条件下,AtMYB96基因通过调控拟南芥长链脂肪酸合成相关酶基因的表达,从而调控表皮蜡质的堆积,以提高植物对干旱的耐受性[8,9]。另外,AtMYB96可通过调控ABA与生长素之间的信号耦合,促进次生根的生长[10]。AtMYB30基因同样也可以调控长链脂肪酸的合成,在响应病原胁迫过程中激活超敏性细胞程序性死亡[11,12]。除此之外,AtMYB30还参与BR信号途径,在拟南芥幼苗中调控下胚轴的伸长[11, 13]。AtMYB41通过ABA介导的信号途径响应盐及渗透压胁迫,调控植物的一些基本代谢途径,如糖、氨基酸代谢[14]。AtMYB2、AtMYB13、AtMYB33和AtMYB101参与了响应非生物胁迫的ABA信号途径[15,16]。
随着木薯种植规模的扩大,干旱、低温、高盐等非生物胁迫对木薯产业的危害作用也越来越明显。要应对非生物胁迫的危害,首先必须了解木薯对非生物胁迫的响应机制。Sakurai等[17]对20 000个木薯全长cDNA克隆进行了测序分析并筛选了一些与胁迫响应有关的基因家族;Lokko等[18]建立了一个富含干旱胁迫相关基因的EST库,这些研究工作为木薯非生物胁迫响应机制的研究提供了良好的数据支持。新技术特别是“组学”手段的应用显著加快了研究速度,同时也获得了海量基因表达数据,并构建了大量胁迫信号相关的调控网络[19]。木薯基因组的公布[20,21]为开展木薯非生物胁迫响应机制的研究奠定了基础。通过应用“组学”手段,研究人员积累了大量木薯响应干旱、低温胁迫相关的“组学”数据,包括转录组、蛋白组、非编码RNA等相关数据[22,23,24],以及不同组织部位基因表达的数据[24,25,26]。随后通过数据分析从中筛选出了大量胁迫相关基因,对其在不同非生物胁迫条件下的表达进行了分析[23, 27-28]。
基因组数据及大量转录组数据的发表为筛选木薯抗逆相关基因提供了便利,通过转录组数据分析,在木薯中筛选到多个与干旱胁迫相关的MYB转录因子基因[26]。本研究分析了其中的1个R2R3-MYB转录因子MeMYB2的特性和功能,并利用酵母双杂交系统筛选到了部分与该转录因子互作的蛋白。为进一步研究MeMYB2转录因子的功能及其在木薯干旱胁迫响应信号调控机制中的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
野生型烟草、木薯品种‘cv. 60444’均由本实验室保存。将木薯‘cv. 60444’成熟茎杆分成约30 cm的茎段,扦插于装满沙土的花盆中置于室外培养,萌发60 d后用作实验材料。MeMYB2- RNAi转基因木薯由本实验室制备,具体材料见文献[26]。
带绿色荧光蛋白（eGFP）标记基因的植物表达载体pG1300由本实验室改造并保存。酵母双杂交系统采用Clontech Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System (cat#: 630489)。DNA测序和引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 干旱胁迫处理 选择叶片数为15~20片的木薯植株进行干旱处理,以停止灌溉的方式进行干旱处理,以最后一次灌溉后第4天（D0）为干旱处理起始时间点,连续处理12 d,处理过程中在不同的时间点,干旱0 d（D0）、2 d（D2）、4 d（D4）、8 d（D8）、12 d（D12）分别收集成熟叶片,以取自3个不同植株的混合样品为1个生物学重复,至少收集3个生物学重复的样品,液氮速冻后-70 ℃保存备用。
1.2.2 总RNA提取及cDNA的合成 RNA提取采用TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Plus Kit （cat#: DP441）,按操作说明书进行提取。RNA的浓度和质量以NanoDrop 2000（Thermo Scientific）系统进行分析,浓度和质量达到要求的RNA保存备用。分别取1 μg的总RNA为模板,按Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒（TaKaRa）的说明书进行操作,合成cDNA。
1.2.3 基因表达分析 以0.5 μL cDNA产物作为PCR模板。采用Taq PCR MasterMix （code#: KT201-02）体系（TIANGEN）进行PCR,反应体系及程序见说明书,反应循环数为35。荧光定量PCR采用SYBR® Premix Ex TaqTM II Kit （TaKaRa）试剂,在StepOneTM Real-Time PCR 仪器（Applied Biosystems）进行实时定量PCR反应,通过计算2-∆∆CT值对基因的表达进行相对定量,以木薯Actin基因的表达作为内参。
1.2.4 MeMYB2基因cDNA全长的克隆 以叶片的cDNA为模板,采用TaKaRa公司的Ex Taq （code#: DRRR001A）酶进行PCR扩增,反应体系参照说明书进行,反应程序为：94 ℃变性3 min;然后94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;最后72 ℃延伸7 min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上检测,切下目的条带,回收PCR产物,将回收产物连接到pLB零背景载体（TIANGEN,cat#：VT205）上,通过转化大肠杆菌DH5α,经鉴定的阳性克隆进行测序验证。
1.2.5 MeMYB2蛋白亚细胞定位 通过PCR在MeMYB2基因完整开放阅读框两端分别引入SalI和BamHI酶切位点,同时在3'端删除MeMYB2基因编码序列上的终止密码,利用上述2个内切酶将测序正确的MeMYB2基因序列插入pG1300植物表达载体,与标记基因eGFP融合。构建好的MeMYB2：pG1300经测序鉴定正确后导入农杆菌LBA4404备用。
通过烟草瞬时表达的方式对MeMYB2蛋白亚细胞定位进行分析。以5 mL无针头注射器将含MeMYB2：pG1300载体的农杆菌菌液（OD600= 0.8~1.2）注射进烟草叶片的下表皮,以携带pG1300空载体的农杆菌作为对照,继续培养72 h后,通过激光共聚焦显微镜（Olympus Fluo View FV1100）观察绿色荧光在细胞中的分布。
1.2.6 MeMYB2在酵母中的转录自激活活性分析 为研究MeMYB2转录因子在酵母中的转录自激活活性,通过PCR在MeMYB2基因cDNA两端分别引入EcoRI和BamHI酶切位点,同时在3'端删除MeMYB2基因编码序列上的终止密码,利用上述2个内切酶将测序正确的MeMYB2基因全长序列插入酵母表达载体pGBKT7的多克隆位点,构建MeMYB2full：pGBKT7载体。对MeMYB2蛋白的C末端进行缺失,通过PCR分别获得了801 bp和741 bp两个MeMYB2基因的3'端缺失片段,同样通过EcoR I和BamH I酶切位点插入pGBKT7的多克隆位点,构建MeMYB2801：pGBKT7和MeMYB2741：pGBKT7。上述酵母表达载体经测序正确后按试剂盒说明书转化酵母Y2HGold菌株,于SD/-Trp培养基上筛选,选取阳性克隆备用。选取经鉴定后的重组酵母菌株以0.9%的NaCl重悬后点在SD/-Trp/X- α-Gal培养基上,根据是否形成蓝斑判断MeMYB2缺失片段的转录自激活活性。
1.2.7 酵母双杂交筛选MeMYB2互作蛋白 酵母双杂交筛选方法按试剂盒说明书进行。挑取含有MeMYB2760:pGBKT7质粒的Y2HGold单菌落,接种于50 mL SD/Trp液体培养基中,30 ℃摇床培养2~3 d,待其OD600为0.8左右时,于2 mL文库菌液在2 L的锥形瓶中混合均匀,加入45 mL 2×YPDA液体培养基,30 ℃摇床培养20 h,以显微镜观察见“米老鼠”形状时终止共培养。1500 r/min离心10 min后,用10 mL 0.5×YPDA液体培养基重悬。取100 μL 10-2、10-3、10-4的稀释液涂于SD/-Trp、SD/-Leu、DDO（SD/-Trp/- Leu）固体平板,30 ℃培养2~3 d。待平板上长出菌落后,计算平板上克隆数量,计算滴度及杂交效率,将DDO/X（SD/-Trp/-Leu/AbA/ X-α-Gal）平板上所长单菌落全部挑出,稀释于无菌水中,点接在QDO/AbA/X（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α- Gal）板上,30 ℃培养3~5 d。挑取蓝色的斑点在SD-Trp培养液摇菌,以pGADT7载体上的通用引物进行PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将所筛选到的阳性克隆在QDO/AbA/X-α-Gal平板上进行二次培养,再次通过PCR鉴定筛选到阳性克隆。
1.2.8 MeMYB2-RNAi转基因木薯叶片水分蒸腾速率分析 分别取MeMYB2-RNAi转基因木薯及野生型木薯成熟叶片各5片,分别对每片叶片称重,随后于室温条件下置于培养皿中持续12 h,每隔2 h称重一次,计算叶片失水率。
2 结果与分析
2.1 木薯MeMYB2属于R2R3-MYB蛋白
通过蛋白序列的比对,结果发现木薯MeMYB2属于R2R3-MYB亚家族成员,2个DNA结合保守结构域在其蛋白的N端（图1A）。MeMYB2蛋白N末端的序列与AtMYB60具有
95%以上的相似度,但其C末端的序列与AtMYB60之间仅有不到30%的相似度（图1B）。这意味着研究木薯MeMYB2基因的功能可在一定程度上参考AtMYB60相关的功能研究,但也需要注意木薯本身的特殊性。
2.2 MeMYB2基因在木薯成熟叶片中的表达受干旱胁迫负调控
表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences |
| 引物名称Primer name | 序列（5'-3'）Sequence (5'-3') | 用途Application |
|---|---|---|
| MeMYB2_PF | CAGGCTCAACCAACTAAC | RT-PCR |
| MeMYB2_PR | TTCCTTCTGCTTTGTTCC | RT-PCR |
| SalI_MeMYB2_F | TCGTCGACATGGGAAGGCCTCCTTGCTGTG | 构建植物表达载体 |
| BamHI_MeMYB2full_R | TAGGATCCGAATATTGGAGATAGTTCTTCA | 构建植物表达载体 |
| EcoRI_MeMYB2_F | TAGAATTCATGGGAAGGCCTCCTTGCTGTG | 构建酵母表达载体 |
| BamHI_MeMYB2full_R | GCGGATCCTCTGTTTCTTCTCTGCTACTGTAAT | 构建酵母表达载体 |
| BamHI_MeMYB2801_R | ACGGATCCTAGAATCACAGGTGGATTTGTCCCA | 构建酵母表达载体 |
| BamHI_MeMYB2741_R | ACGGATCCACATTGTTCAAGTTCTGATCA | 构建酵母表达载体 |
2.3 木薯MeMYB2蛋白定位于细胞核中
植物中多数MYB类蛋白是作为转录因子起作用,而转录因子蛋白在细胞核中起作用。以eGFP蛋白对MeMYB2蛋白进行标记形成MeMYB2-eGFP融合基因,通过农杆菌介导瞬时转化烟草叶片的方法来瞬时表达MeMYB2-eGFP融合蛋白,以激光共聚焦显微镜观察绿色荧光的分布确定融合蛋白的亚细胞定位。同时,以拟南芥组蛋白Histone3与eGFP融合作为细胞核定位对照。观察结果显示（图3）,Histoen3-eGFP融合蛋白明显富集于细胞核中,同样MeMYB2- eGFP融合蛋白也主要分布在细胞核中,而未融合的eGFP蛋白可分布在整个细胞中,包括细胞核与细胞质。以上结果表明MeMYB2蛋白可能是一个在细胞核中发挥作用的转录因子。
2.4 MeMYB2转录激活结构域在其蛋白的C端247~267氨基酸残基内
转录因子蛋白的另一特性是具有明显的转录激活活性,可利用酵母菌种Y2HGold中的报告基因对MeMYB2蛋白的转录激活活性进行分析。完整的MeMYB2蛋白（MeMYB2-full,含327个氨基酸残基）以及C末端部分删除蛋白MeMYB2- 267（含267个氨基酸残基,删除C末端60个氨基酸残基）可明显激活酵母Y2HGold中的报告基因MEL1的表达,从而在含X-α-Gal的培养基中显示明显的蓝色（图4）。而带有另一个C末端部分删除蛋白MeMYB2-247（含247个氨基酸残基,删除C末端80个氨基酸残基）的重组Y2HGold酵母没有形成蓝色菌斑（图4）,说明MeMYB2- 247未能激活MEL1基因的表达,在酵母中没有转录自激活活性。上述结果表明MeMYB2蛋白具有明显的转录激活活性,且其转录激活结构域处于蛋白C末端的247~267氨基酸残基之间。
2.5 MeMYB2互作蛋白筛选
部分MYB类转录因子通常需要与其他蛋白互作进行发挥其功能。以缺失蛋白MeMYB2-247为诱饵,通过酵母双杂交系统,从木薯叶片cDNA文库中筛选到了多个与MeMYB2互作的蛋白（表2）。通过功能注释发现其中的部分蛋白（Manes. 15G115100.1,Manes.05G142000.1）与气孔开闭和光合效率有关,表明MeMYB2可能在木薯气孔开闭以及叶片光合效率方面具有重要的调控功能。干旱胁迫对Manes.15G115100.1基因在叶片中的表达具有上调作用,但对Manes. 05G142000.1基因在叶片中的表达具有负调控作用（图5）。在正常生长条件下,抑制MeMYB2基因的表达并不会明显影响上述2个基因在木薯叶片中的表达（图5）。但在干旱胁迫条件下,Manes.15G115100.1和Manes.05G142000.1基因在MeMYB2-RNAi转基因木薯叶片中的表达量均明显低于其在野生型木薯叶片中的表达（图5）。
表2 酵母双杂交筛选到的MeMYB2互作蛋白Tab. 2 Screening MeMYB2 binding protein by yeast two hybrid system |
| 编号 Number | JGI 登录号 JGI Accession Number | 注释 Annotation |
|---|---|---|
| 1 | Manes.17G022300.1 | ATP synthase |
| 2 | Manes.15G084500.1 | Methytransferase |
| 3 | Manes.03G133400.1 | Proline synthase |
| 4 | Manes.15G115100.1 | Member of NPH3 family |
| 5 | Manes.15G109300.1 | unknown |
| 6 | Manes.15G141800.1 | BAF60 |
| 7 | Manes.05G142000.1 | Plastocyanin (petB) |
| 8 | Manes.08G096000.1 | Solute carrier |
2.6 抑制MeMYB2基因的表达可显著降低转基因木薯叶片的失水率
通过RNAi技术抑制MeMYB2的表达可以导致转基因木薯对干旱的耐受性显著提高[26]。MeMYB2- RNAi转基因木薯耐旱性的提高表明MeMYB2基因的表达可能与叶片水分蒸腾速率密切相关。在正常生长环境下,MeMYB2-RNAi转基因木薯的成熟叶片与野生型木薯成熟叶片没有明显的差异（图5A）。在叶片从植株取下12 h后,MeMYB2- RNAi转基因木薯的成熟叶片没有出现明显的萎蔫现象,而野生型木薯成熟叶片明显萎蔫卷曲（图5B）。失水率统计结果同样显示,从叶片离体开始,MeMYB2-RNAi转基因木薯成熟叶片的失水率显著低于野生型木薯成熟叶片（图6C）。通过RT-PCR对MeMYB2-RNAi转基因木薯成熟叶片中MeMYB2基因的表达进行分析,结果表明在转基因木薯中MeMYB2完整mRNA含量明显比野生型低（图6D）,而用于基因干扰（RNAi）的RNA片段（491~933 bp）在转基因木薯中的含量明显高于野生型,可见转基因木薯中MeMYB2的表达已被MeMYB2-RNAi明显抑制。上述结果表明,MeMYB2基因的表达与木薯叶片的失水率直接相关。
3 讨论
MYB类转录因子一般都具有至少1个DNA结合保守结构域,蛋白序列比对结果表明MeMYB2蛋白具有2个MYB保守结构,其蛋白N末端与拟南芥AtMYB60具有非常高的相似度,但MeMYB2蛋白的C末端与AtMYB60蛋白的C末端的相似度极低。因此,AtMYB60的功能可为研究木薯MeMYB2的功能提供一定的参考。拟南芥突变体atmyb60对干旱胁迫的耐受性明显比野生型高[4]。但是,在拟南芥中过表达MeMYB60基因对转基因拟南芥的抗旱性没有明显的影响。随后,采用RNAi技术在转基因木薯中抑制MeMYB2基因的表达,发现MeMYB2-RNAi转基因木薯对干旱的耐受性明显提高,这表明MeMYB2与AtMYB60一样负调控植株的耐旱性。对MeMYB2-RNAi转基因木薯叶片失水率的分析结果表明,抑制MeMYB2基因的表达可显著降低转基因木薯叶片的失水率,这意味着MeMYB2可能与AtMYB60一样可以调控气孔运动。进一步的研究需要明确MeMYB2基因是否可以在木薯叶片保卫细胞中表达。
转录因子一般应定位于细胞核中,且具有DNA结合和转录激活结构域。亚细胞定位结果表明,MeMYB2蛋白主要分布于细胞核中且在酵母中具有明显的转录自激活性。通过蛋白C末端缺失研究发现,MeMYB2蛋白的转录激活结构域处于其蛋白C末端序列第247~267之间的20个氨基酸残基中。上述的结果表明MeMYB2是一个R2R3-MYB转录因子。利用酵母双杂交系统,从木薯叶片cDNA文库中筛选到8个可以与MeMYB2互作的蛋白。通过功能注释发现其中Manes.15G115100.1是一个NPH3家族成员,该家族成员具有响应光信号及调控气孔开闭的功能[29]。而Manes.05G142000.1为质体蓝素（PetB）,该蛋白在光合作用中起重要作用,这意味着MeMYB2转录因子可能参与了对光合作用的调控,对MeMYB2-RNAi转基因木薯叶片光合效率的测定有助于进一步了解该转录因子在木薯叶片光合作用过程中所扮演的角色。对MeMYB2转录因子特性的研究及其功能的挖掘将有助于深入理解该转录因子的功能,并为该转录因子在木薯遗传育种中的应用奠定基础。