起源于南美洲的木薯（Manihot esculenta Crantz）是热区（尤其非洲地区）主要的块根粮食作物,生产过程中表现出明显的抗旱、耐贫瘠、对低温敏感的特性。低温条件下木薯发育迟缓、毒性物质累积,其品质、产量受到很大的影响[1]。增强木薯对低温的耐受性,对木薯产业发展具有重要作用。
目前国内外对木薯低温响应的研究主要集中在低温下游功能基因的表达对植株耐低温的影响,如苯丙胺代谢途径关键基因（苯丙胺酸解氨酶PAL）的克隆与分析[1];SAD硬酯酞脱-ACP脱饱和酶促进膜脂不饱和脂肪酸的含量[2];ROS清除相关MeCu/ZnSOD和MeCAT1过表达株系对低温表现为显著的耐受性[3]。另外,转录因子对木薯生长发育的影响方面已有一定的研究,如转录因子CBF在木薯中过表达,可增强木薯对低温的耐受[4];植物特异bHLH转录因子家族成员[Teosinte Branched/Cycloidea/PCF（TCP）]在拟南芥中过表达,可诱导ROS途径相关基因的表达增强转基因植株对低温的耐受[5];干扰木薯MYB2的表达也可提高木薯转基因植株对低温的耐受[6]。
植物激素在植物响应环境胁迫中起着重要的作用[7],参与冷胁迫的激素主要包括脱落酸（abscisic acid,ABA）、乙烯（ethylene,ETH）、茉莉酸类物质（jasmonate,JAs）、赤霉素（gibberellins,GAs）等。茉莉酸（jasmonic acid,JA）与茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）等衍生物统称为JAs,是植物激素中的重要成员。现研究表明JAs不仅广泛参与光合作用、各组织器官的发育[8]、调控植物的生长发育,同时作为脂肪酸衍生物的MeJA可作为内源信号分子调节植物防御外来侵害,对干旱[9]、高盐[10]等环境胁迫也有重要作用。由于MeJA能够抑制膜脂组分的变化,降低膜透性[11],生产中,人们用MeJA做保鲜剂和冷害保护剂,在西红柿[12]、黄瓜[13]、水蜜桃[14,15]、柠檬[16]、石榴[17]等作物中已得到应用。同时,JAs可以通过与其他激素如ABA、水杨酸（salicylic acid,SA）等或转录因子（transcription factors,TFs）间的互作完成发育过程的调控,而其中多涉及MYC2转录因子[18]。
木薯受低温胁迫过程中茉莉酸发挥着怎样的作用,目前尚无详细报道。本研究通过克隆木薯MYC2基因,分析其在不同逆境胁迫下的表达差异,可为阐述木薯MYC2参与非生物胁迫的生物学功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验在中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验室进行,所用植物材料为木薯‘cv. 60444’。以pCAMBIA1300-35S::GFP为基因表达载体。主要试剂：植物总RNA提取/反转录试剂盒（天根）、植物DNA提取试剂盒（天根）、DNA回收纯化试剂盒（艾德莱）、平末端克隆试剂盒（天根）、荧光定量PCR反应试剂（大连宝生物）。主要仪器设备：GEL DOC.XR凝胶成像系统（BIO-RAD,美国）、DYY-4C电泳仪（北京六一）、5804R离心机（Eppendorf,美国）、Mastercyclernexus PCR仪（Eppendorf,德国）、Stepone plus荧光定量PCR仪（ABI,美国）。
1.2 方法
木薯盆栽苗种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验大棚中,栽培基质采用营养土/蛭石=1∶1（体积比）。待苗长至高1 m左右时,进行以下胁迫处理：100 μmol/L MeJA、5 mmol/L水杨酸甲酯（Salicylate,SA）、100 μmol/L ABA、10 mmol/L H2O2以及冷害（4 ℃）处理1、3、6、12 h,以未经胁迫处理的木薯植株作为对照（CK）,每个处理设置3次生物学重复。取其顶端伸展叶片,液氮速冻后-80 ℃保存备用。
1.2.1 MeMYC2基因的克隆 采用天根植物RNA提取试剂盒（DP441）提取木薯叶片总RNA,利用FastKing RT kit（KR116）将提取的总RNA反转录获得cDNA。基于拟南芥MYC2基因序列特征,通过在木薯基因组数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search?show=BLAST）搜索MYC2同源基因。利用TaKaRa高保真酶（R045）,以木薯DNA/cDNA为模板,以特异性引物PCR克隆木薯MeMYC2基因序列。PCR反应程序：98 ℃变性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸10 s,共计35个循环。PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳回收纯化、与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α;经菌落PCR及酶切鉴定为阳性克隆的送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所用引物及其序列见表1,下划线表示酶切位点。
表1 本实验所用引物及序列Tab. 1 Sequences of primer used in this experiment |
| 引物Primer | 引物序列（5'-3'）Primer sequence (5'-3') | 用途Application |
|---|---|---|
| Primer Gene-F | GCTCTAGAATGACGGACTATCGGATATC | 基因克隆 |
| Primer Gene-R | GTGGATCCGGTGTCACCAACTTTGGTTG | 基因克隆 |
| Primer Pro-F | GTGGATCCCAGTAAGTAATTTACCACGATTGTG | 启动子克隆 |
| Primer Pro-R | GATCCATGGGATATCCGATAGTCCGTCAT | 启动子克隆 |
| Primer PCR-F | GTTCATGGCCGATGGGAACG | 目的基因qPCR分析 |
| Primer PCR-R | GGTGCCACCTGATGATGGAA | 目的基因qPCR分析 |
| Actin-F | TGATGAGTCTGGTCCATCCA | 内参基因qPCR分析 |
| Actin-R | CCTCCTACGACCCAATCTCA | 内参基因qPCR分析 |
1.2.2 MeMYC2基因生物信息学分析 利用生物信息学在线分析软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）预测MeMYC2.1蛋白理化性质,TMHMM 2.0 Server（http://www.-cbs.dtu.dk/services/TMHMM）预测蛋白跨膜结构,SignalP （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测蛋白的信号肽,Plant-mPLoc软件预测其亚细胞定位;NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白功能结构域,Swiss- Model在线分析软件（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive/d697dL/models/）预测三级结构;采用MEGA 7.0软件构建不同物种MYC2蛋白序列的系统进化树。
1.2.3 MeMYC2基因表达谱分析 分别提取不同处理下木薯叶片RNA,进而反转录成cDNA,再以稀释20倍的cDNA为模板进行实时定量PCR反应。以木薯看家基因Actin为内参基因,对木薯MeMYC2.1进行相对表达量分析。每个样品设置3个技术重复。定量PCR试剂采用TB Green Premix Ex TaqTM （TliRNaseH Plus,TaKaRa-RR820A）,利用ABI stepone plus定量PCR仪完成实验。数据分析采用2ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。
1.2.4 MeMYC2基因启动子的克隆与分析 以天根DNA提取试剂盒（DP305）获得木薯DNA。利用TaKaRa高保真酶（R045）,以DNA为模板克隆木薯MeMYC2.1基因上游启动子序列,通过凝胶回收纯化、与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α;经菌落PCR及酶切鉴定为阳性克隆的送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所用引物及其序列如表1所示。采用在线数据库（http://bioinformatics,psb.ugent.be/webtools/plantcare）对获得的启动子序列进行顺式作用元件分析。
2 结果与分析
2.1 目标基因的选择
通过搜索Phytozome数据库,获得12个木薯MYC2相似基因,经过Blast数据比对,结合相关文献查阅,筛选出蓖麻（29827.m002528, Ricinus communis L.）、拟南芥（AT1G32640,Arabidopsis thaliana）、玉米（Zm00008a034941_T01,Zea mays）、水稻（LOC_Os10g42430,Oryza sativa）的MYC2基因序列,利用MEGA 7.0软件,结合Neighbor-Joining计算方法（Bootstrap值设置为1000）,构建MeMYC2与其他物种（拟南芥、水稻、蓖麻、玉米）系统进化树。比对结果显示（图1）,Manes.17G016000（命名为MeMYC2.1）和Manes.15G182700（命名为MeMYC2.2）与已报道的MYC2同源性最高;木薯MYC2与蓖麻MYC2的亲缘关系最近,其次是双子叶拟南芥,与单子叶植物水稻、玉米MYC2亲缘关系稍远;其他木薯MYC基因亲缘关系则较远。本研究选择MeMYC2.1作为目标基因进行研究。
2.2 MeMYC2.1克隆及序列分析
图2 MeMYC2.1基因全长核苷酸及其编码氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide acid sequence and predicted amino acid sequence of MeMYC2.1 |
图3 MeMYC2.1基因克隆及蛋白结构预测A：木薯MeMYC2.1氨基酸序列保守结构域预测;B：木薯MeMYC2.1基因PCR扩增图,箭头标示为目标条带,M：D150000+2000 Marker; C：MeMYC2.1蛋白质3D结构预测,采用Swiss-mode在线软件进行分析,箭头标示为相应结构域。 Fig. 3 Gene cloning and the structural prediction analysis of MeMYC2.1 A: Prediction of conserved domain of amino acid sequence of MeMYC2.1; B: PCR amplification of MeMYC2.1,arrow marks the target band, M: D150000+2000 Marker; C: The deduced three-dimensional structure of MeMYC2.1, Swiss-mode online software was used, arrows indicate corresponding domains. |
采用在线软件ProtParam理化性质预测MeMYC2.1蛋白质的分子量为75 043.89 Da,理论等电点（pI）为5.49,该蛋白因不包括任何Trp,这可能导致消光系数超过10%的计算误差;氨基酸N末端为A（Ala）,估计其半衰期为4.4 h,不稳定指数为37.06,归类为稳定性蛋白;脂肪系数28.93,亲水系数为0.755。用Plant-mPLoc软件预测其亚细胞定位表明,该蛋白定位于细胞核;TMHMM 2.0 Server软件预测MeMYC2.1蛋白无跨膜区,为非膜蛋白;通过SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线查找信号肽,结果表明MYC2.1不存在信号肽序列,为非分泌蛋白。
利用NCBI-CDD数据库进行保守功能结构域（图3A）预测,结果表明该蛋白含有bHLH-MYC保守结构域（N69~250）,及HLH DNA结合域（N505~556）,表明克隆得到的基因为木薯MeMYC基因。利用在线软件SOPMA分析蛋白二级结构,结果显示MeMYC2.1蛋白结构中α-螺旋占31.73%,延伸链占11.84%,β-转角占1.46%,无规则卷曲占54.97%。通过SWIS-MODEL在线软件对MeMYC2.1蛋白进行三级结构分析（图3C）,其N端主要由α-螺旋和β-折叠构成;C端主要由α-螺旋构成。预测N端5-243片段,为MYC3晶体结构,可与JAZ9结合位点（218~ 239 aa）;C端α-螺旋PDB预测可能是MYC2转录因子DNA结合位点。此结果佐证了MeMYC2.1具有的典型HLH结构域,通过与JAZ互作参与JA信号途径。
2.3 不同胁迫条件下MeMYC2.1表达模式分析
2.4 MYC2.1启动子分析
3 讨论
植物在应对低温等环境胁迫时,JA信号途径发挥着重要作用。目前对拟南芥JA信号转导途径的研究较为清晰,认为COI1-JAZ-MYC2复合体是其信号传导途径的核心元件[19]。正常情况下JAZ（Jasmonate ZIM-domain）阻遏蛋白与MYC2转录因子结合,阻遏了MYC2下游基因的转录;当植物接收外界刺激信号后,细胞内JA累积,与异亮氨酸形成JA-Ile结合物,激活SCFCOI1（Skpl/ Cullin1/F-box protein）受体,使COI1与JAZ阻遏蛋白结合,并将JAZ泛素化进而被26S蛋白酶体降解,从而释放MYC2,启动JA信号途径下游基因的转录[19,20,21,22]。因此,在整个JA信号通路中,MYC2是JA信号传导途径的核心调控元件。近年来,在拟南芥、番茄、烟草、长春花、丹参等多种植物中对MYC2基因进行了研究[23],在植物应答逆境刺激时起重要调控作用。
MeMYC2.1蛋白N末端包含MYC3晶体结构可与JAZ9结合;且具有的典型HLH结构域,通过与JAZ互作参与JA信号途径。外源MeJA处理木薯叶片1 h后,MeMYC2.1的表达量即可飙升至制高点,因此MeMYC2.1可能是木薯JA信号途径的早期应答基因,这与番茄中MYC2的表达模式相符[24]。低温胁迫（4 ℃）也可诱导MeMYC2.1基因的上调表达,但其表达存在滞后,随着低温胁迫的加深缓慢上升。另外,本研究对MeMYC2.1基因上游启动子区顺式作用元件进行分析,也发现其具有JA信号相关CGTCA、TGACG顺式元件和低温相关LTR元件。综上所述,MeMYC2.1可能通过调控JA信号途径参与木薯逆境胁迫应答反应。MeMYC2.1受低温胁迫诱导表达在冷害24 h后表达量提高显著,这可能与低温胁迫下木薯体内JA的累积有关。MeMYC2.1基因具体如何参与木薯响应低温胁迫的过程,有待进一步实验证明。本研究团队已构建了MeMYC2.1过量表达和基因编辑载体,期望获得MeMYC2.1转基因植株,进行后续研究。