露兜树科（Pandanaceae）共3属,约800种,广布于亚洲、非洲和大洋洲的热带地区。我国有2属、10种、2变种,分别为藤露兜树属（Freycinetia）和露兜树属（Pandanus）,主要分布于北纬16°~25°,东起台湾、福建一带,南沿广东、海南、广西、云南和西藏等省区边境线,西达西藏南部热带季雨林、雨林带,北至云南（腾冲）、贵州（荔波）、广西（阳朔）、福建（厦门）等热带、亚热带地区;大多数为海岸或沼泽植物,在我国多散生于热带至南亚热带林中,为东半球热带特征植物[1]。
露兜树属植物具有较高的食用、药用和园艺观赏价值,如香露兜（Pandanus amaryllifolius）是一种传统的食用香料,在我国南部有广泛种植,叶有粽香,其特征香气组分为2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,简称2AP）[2],2AP具有烤爆米花和类大米风味[3]。香露兜（Pandanus amaryllifolius）被认为是获取2AP最佳的天然原料之一[4]。大叶斑兰也具有和香露兜类似的风味,且树形较大。露兜树（Pandanus tectorius）的根与果实可入药,有治感冒发热、肾炎、水肿、腰腿痛、疝气痛等功效[1],其鲜花中的白色苞片含有浓烈玫瑰香味是很好的兴奋剂和抗菌剂[5]。此外斑叶禾叶露兜、禾叶露兜和金边露兜其叶片和生长形态具有较高的绿化观赏价值。
近年来露兜树属植物研究报道日益增多,且研究领域广,但风味研究报道不多。例如Cheng等[6]报道了从香露兜中分离和鉴定了7种新生物碱并建立了结构模型;Andriani等[7]对露兜树果实分析发现其含有丰富的酚类物质,具有很强的抗氧化和抗菌作用,可作为抗氧化剂和抗菌剂;Kumar等[8]报道了Pandanus odoratissimus L.叶子乙醇提取物在400 mg/kg时具有显著的抗生育活性;Xia等[9]发现露兜树属植物（Pandanus conoideus Lam）的红果精油具有促进内皮细胞NO生成增加和氧化应激减少作用,并提出这可能是红果精油治疗作用的分子机制之一;陈小凯等[10]建立了利用HPLC法快速测定香露兜叶中角鲨烯含量的方法;金燕等[11]从露兜簕茎皮中首次分离得到10种化合物。
课题组在前期开展了香露兜不同叶位挥发性成分差异性分析研究,其目的是确定香露兜不同叶位叶片上乙醇提取的风味组分差异。本研究利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用法（headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME/GC- MS）技术测定8种露兜树属叶片挥发性组分,分析其风味组分种类和含量,并利用主成分分析和聚类分析等方法寻找其挥发性组分存在的差异性。研究结果可为露兜树属植物的利用,特别是香露兜的应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 选取露兜树属（Pandanus）8种植物,其中香露兜（P. amaryllifolius Roxb.）、露兜树（P. tectorius）、露兜草（P. austrosinensis）和红刺露兜（P. utilis Borg.）为中国植物志收录植物资源,斑叶禾叶露兜、银边露兜、金边露兜、大叶斑兰均为引进品种,该4种作物学名暂未检索到,为便于记录暂定为斑叶禾叶露兜（P. pygmaeus ‘Variegatus’）、银边露兜（P. pygmaeus Thouars）、金边露兜（P. pygmaeus ‘Golden Pygmy’）和大叶斑兰（Pandanus sp.）。上述8种植物叶片均采摘自中国热带农业科学院香料饮料研究所,采摘时间为上午10：00—12：00,取叶中段用于分析。
1.1.2 试剂 正构烷烃（C7-C30）标准品,购自美国Supelco公司;2-acetyl-1-pyrroline标准品,购自上海源叶生物科技有限公司。
1.1.3 仪器与设备 85 μm CAR/PDMS自动萃取头,购自上海安谱实验科技股份有限公司;7890BGC-5977 BMS气质联用系统,配PAL3自动进样器,为美国Agilent公司产品。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理 将采摘到的样品使用干净的纱布轻轻擦拭掉叶片上的露水和灰尘,使用剪刀将叶片剪成小碎片。
1.2.2 HS-SPME-GC/MS分析条件 SPME处理：取1.00 g剪碎的叶片,放入20 mL的顶空瓶中,60 ℃下预热10 min,插入萃取头吸附10 min,将萃取头插入进样口,230 ℃解吸附5 min,每次使用后在250 ℃老化1 min。
气相检测条件[12]：色谱柱为HP-5MS毛细管柱(Agilent 19091S-433,30 m×0.25 mm×0.25 µm),衬管：35 μL（Agilent 5190-4048,Splitless,straight,for SPME,Ultra）,升温程序：40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至100 ℃,保持1 min,以3 ℃/min升至250 ℃;载气为氦气,流速为1.0 mL/min,不分流。
质谱检测条件：离子源为EI源,电子能量70 eV,传输线温度250 ℃,离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,质量扫描范围30~350 m/z。
1.2.3 定性定量方法 （1）定性方法[13]：露兜树属叶片挥发性组分是以NIST 14谱库检索、保留指数和标准品共同定性确定。线性保留指数（linear retention index,LPI）是根据以下公式计算得到的,其中正构烷烃的碳原子数为C7~C30。
$LRI=100 \times n +\frac{100 \times (t_{x}t_{n})}{ t_{n+1} t_{n}}$
式中：n和n+1分别为待测组分前后正构烷烃的碳原子数,tn和tn+1为相应的正构烷烃出峰保留时间,tx为待测组分出峰保留时间,其中tn<tx<tn+1。
（2）半定量方法[14]：使用2AP作为外标物进行检测,默认每个化合物与2AP的相对相应因子为1,利用样品检测方法绘制标准曲线,结果如下：
$y=2.49 \times 10^{-8}x +0.03$
式中：x表示峰面积,y表示化合物含量,单位为mg/g。R2=0.9952。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次,数据以平均值±标准差的方式展现;为验证各样品间变异显著性,考虑批间变异,采用ANOVA方法检测（P<0.05）。文中所有分析数据为各组处理重复的平均值,利用SPSS 21.0进行Pearson相关性分析,应用SPSS 21.0进行主成分分析（principal component analysis,PCA）,绘图软件为Origin 2018。
2 结果与分析
2.1 挥发性风味组分鉴定与定量分析
风味是衡量产品品质最重要的指标之一,研究风味对香露兜叶片利用具有重要的意义。8种露兜树属叶片样品挥发性组分使用NIST 14谱库进行风味鉴别,并利用线性保留指数（LRI）与对照保留指数（control retention index,CRI）来验证化合物的正确性[15],个别未确定的化合物使用标准品进行验证,线性保留指数计算方式见公式（1）,化合物解谱及验证结果见表1。保留指数是国际上最常用的定性方法,具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点,利用保留指数定性,误差可小于1%[16],该方法已广泛应用于天然产物组分定性分析[17,18]。从表1中可以看出线性保留指数（LRI）与对照保留指数（CRI）不存在显著差异,说明样品解谱准确率高[19]。目前关于露兜树属植物组分分析的研究国内外有数篇报道[20,21,22],但尚未检索到利用LRI与CRI对照验证化合物准确性的报道。
Table 1 Volatile flavor component analysis of 8 Pandanaceae leaves |
 |
注:同列不同小写字母表示处理间差异显著( P<0.05)。—表示未检出。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.—Indicate not detected. |
8种露兜树属样品中共检出83种挥发性组分（表1）,化合物种类最多的是银边露兜50种,最少的为露兜草34种;其他种类化合物数量相似,如露兜树46种、金边露兜42种、斑叶禾叶露兜41种、大叶斑兰42种、红刺露兜40种、香露兜39种。使用2AP作为标准品对化合物进行半定量标定,以公式（2）计算,8种样品挥发性组分含量依次为：银边露兜58.21 mg/g,红刺露兜56.13 mg/g,露兜树46.45 mg/g,金边露兜42.22 mg/g,斑叶禾叶露兜40.03 mg/g,大叶斑兰38.52 mg/g,香露兜37.25 mg/g,露兜草31.33 mg/g。由此可见,银边露兜的挥发性组分种类最多、含量也最高,而露兜草含量种类均最少。
2.2 挥发性风味组分多样性分析
对化合物分类借鉴Cuevas等[23]的方法,共检出醛类21种、醇类17种、酮类14种、酯类12种、萜烯类9种、酚类4种、烯烃2种、呋喃2种、酸1种、吡咯啉1种。从图1可以看出醛类、醇类和酮类是露兜树属植物特征类别组分,在各类露兜树属植物中含量百分比例均较高,特别是露兜树、斑叶禾叶露兜和露兜草(94.26±0.24)%、(93.71±0.40)%和(93.87±0.24)%,其次为大叶斑兰、金边露兜和香露兜(80.93±0.92)%、(77.87±0.92)%和(72.45±0.72)%,银边露兜(57.37±1.77)%和红刺露兜(39.35±4.57)%;除特征类别组分外,还具有独特的组分类别,红刺露兜中烯烃占总含量的(53.13±3.79)%,银边露兜中萜烯占总含量的(38.21±1.91)%。
图1 挥发性风味组分分类图A：露兜树;B：斑叶禾叶露兜;C：银边露兜;D：金边露兜;E：露兜草;F：大叶斑兰;G：香露兜;H：红刺露兜。 Fig. 1 Volatile flavor component classification chart A: P. tectorius; B: P. pygmaeus ‘Variegatus’; C: P. pygmaeus Thouars; D: P. pygmaeus ‘Golden Pygmy’; E: P. austrosinensis; F: Pandanus sp.; G: P. amaryllifolius; H: P. utilis. |
和溶剂提取（solvent extraction,SE）2种方法提取香露兜叶片风味组分49种和37种,利用HS-SPME法可以检测出2AP占5.65%,而SE法未检测出2AP;Wakte等[22]对香露兜风味组分进行检测和2AP条件优化,得出了较好的提取条件。
2.3 挥发性风味组分主成分分析
表2 不同主成分的贡献率Tab. 2 The contribution of different principal components |
| 主成分 Principal components | 初始特征值Initial eigenvalues | 提取平方和载入Extraction sums of squared loadings | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 特征值 Eigenvalues | 方差 Variance/% | 累积 Cumulative/% | 特征值 Eigenvalues | 方差 Variance/% | 累积 Cumulative/% | |
| PC1 | 4.39 | 43.94 | 43.94 | 4.39 | 43.94 | 43.94 |
| PC2 | 2.18 | 21.77 | 65.71 | 2.18 | 21.77 | 65.71 |
| PC3 | 1.25 | 12.53 | 78.24 | 1.25 | 12.53 | 78.24 |
| PC4 | 0.99 | 9.86 | 88.10 | 0.99 | 9.86 | 88.10 |
表3 前4个主成分成分矩阵Tab. 3 Component matrix of first four principal components |
| 化合物类别 Compound classification | 主成分Principal component | |||
|---|---|---|---|---|
| PC1 | PC2 | PC3 | PC4 | |
| 醇类 | ‒0.80 | ‒0.42 | ‒0.27 | ‒0.03 |
| 醛类 | ‒0.82 | 0.08 | 0.39 | ‒0.00 |
| 酸类 | 0.48 | ‒0.51 | 0.58 | 0.27 |
| 酯类 | 0.84 | 0.27 | 0.21 | 0.21 |
| 酮类 | 0.82 | ‒0.13 | 0.41 | ‒0.19 |
| 烯烃类 | 0.45 | 0.72 | ‒0.11 | ‒0.28 |
| 萜烯类 | ‒0.57 | 0.32 | 0.01 | 0.70 |
| 酚类 | 0.77 | 0.03 | ‒0.61 | 0.13 |
| 呋喃 | ‒0.00 | 0.88 | 0.11 | 0.27 |
| 吡咯啉 | 0.60 | ‒0.51 | ‒0.28 | 0.42 |
图2 风味组分主成分分析(A)：样品得分图,(B)：样品荷载图;A：露兜树;B：斑叶禾叶露兜;C：银边露兜;D：金边露兜;E：露兜草;F：大叶斑兰;G：香露兜;H：红刺露兜。 Fig. 2 Principal component analysis of volatile flavor components (A): Sample score diagram, (B): Sample load diagram; A: P. tectorius; B: P. pygmaeus ‘Variegatus’, C: P. pygmaeus Thouars; D: P. pygmaeus ‘Golden Pygmy’; E: P. austrosinensis; F: Pandanus sp.; G: P. amaryllifolius; H: P. utilis. |
样品露兜树与组分烯烃呈正相关,与酸类和呈负相关;斑叶禾叶露兜、银边露兜和金边露兜与组分呋喃呈正相关,这表明露兜树属特征组分酮类组分对分类呈正相关,醇类和醛类呈负相关,而造成作物分类的并非此3类组分,萜烯和吡咯啉为个别作物所有,也不是这2类组分,因此酯类、酚类等5种共有组分才是分类依据。由此可见,由于风味组分的多样性造成主成分分析对样品的区分效果并不是很好。
2.4 挥发性风味组分相似性分析
2.4.1 挥发性风味组分相关性分析 从表4中可以看出,露兜草、大叶斑兰、香露兜和红刺露兜4种作物间相关性系数0.945以上,特别是露兜草/大叶斑兰组合和大叶斑兰/红刺露兜组合达到了0.996和0.994的相似系数,说明这4种作物风味相似度较高。该结果与主成分分析结果（图2）一致;银边露兜、斑叶禾叶露兜、露兜树和金边露兜与露兜、大叶斑兰、香露兜、红刺露兜的相关性均不高,银边露兜、斑叶禾叶露兜和金边露兜相关性在0附近,且呈负相关,露兜树相关性数值虽然也不高,但相比三者相关性略强,此结果与主成分分析结果（图2）一致。银边露兜、斑叶禾叶露兜、露兜树和金边露兜4种作物间相关性结果与主成分分析和聚类分析都略有差异,但总体结果一致。
表4 挥发性风味组分的相关性矩阵Tab. 4 Correlation matrix of volatile flavor components |
| 样品 Samples | 露兜树 P. tectorius | 斑叶禾叶露兜 P. pygmaeus ‘Variegatus’ | 银边露兜 P. pygmaeus Thouars | 金边露兜 P. pygmaeus ‘Golden Pygmy’ | 露兜草 P.austrosinensis | 大叶斑兰Pandanus sp. | 香露兜 P. amaryllifolius | 红刺露兜 P. utilis |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 露兜树 | 1.000 | |||||||
| 斑叶禾叶露兜 | 0.624 | 1.000 | ||||||
| 银边露兜 | 0.710 | 0.667 | 1.000 | |||||
| 金边露兜 | 0.351 | 0.929 | 0.415 | 1.000 | ||||
| 露兜草 | 0.347 | ‒0.033 | ‒0.216 | ‒0.105 | 1.000 | |||
| 大叶斑兰 | 0.331 | ‒0.063 | ‒0.227 | ‒0.130 | 0.996 | 1.000 | ||
| 香露兜 | 0.463 | 0.039 | ‒0.064 | ‒0.095 | 0.967 | 0.961 | 1.000 | |
| 红刺露兜 | 0.369 | 0.014 | ‒0.189 | ‒0.046 | 0.990 | 0.994 | 0.945 | 1.000 |
2.4.2 挥发性风味组分聚类分析 以挥发性风味组分为基础做聚类热图,结果见图3。通过颜色变化可直观看出各香露兜植物挥发性风味组分间存在差异;通过化合物聚类结果可知,同类化合物组分大多聚为一类,颜色变化趋势基本一致;通过植物类别聚类上可以看出,整体分为2大类,露兜树（样品A）与银边露兜（样品C）聚为一类,其他6种植物聚为一类。样品A与样品C在化合物含量组成,特别是醇类、酯类和酮类化合物含量结构具有一致性（图1）,在PCA得分图（图3）上存在一定距离,但与其他植物相比,相似性最大,可见其区分是合理的。大叶斑兰（样品F）与香露兜（样品G）聚为一类,其他4种植物聚为一类,同样样品F和样品G也具有相似的化合物结构及组成,特别是2种植物具有2AP,此聚类在PCA图上和相关性上均有较高的响应,其余4种植物从聚类图上看出组分含量存在较大的差异性,聚类分组间的欧式距离差距较小,区分效果不明显。可能是聚类结果突出了样品间化合物种类的差异性,而主成分与相关性分析是样品间整体风味差异。
图3 8种露兜树属叶片挥发性风味组分聚类热图分析A：露兜树;B：斑叶禾叶露兜;C：银边露兜;D：金边露兜;E：露兜草;F：大叶斑兰;G：香露兜;H：红刺露兜;化合物序号对应名称见表1。 Fig. 3 Cluster heatmap analysis of volatile flavor components of 8 species of Pandanus A: P. tectorius; B: P. pygmaeus ‘Variegatus’; C: P. pygmaeus Thouars; D: P. pygmaeus ‘Golden Pygmy’; E: P. austrosinensis; F: Pandanus sp.; G: P. amaryllifolius; H: P. utilis; The corresponding names of the compound numbers are shown in Tab. 1. |
3 讨论
通过对8种露兜树属植物挥发性风味组分分析发现,醛类、醇类和酮类是露兜树属植物的特征类别组分,在露兜树、斑叶禾叶露兜和露兜草中分别占总含量的(94.26±0.24)%、(93.7±0.40)%和(93.87±0.24)%,其他露兜树属植物中也具有较高的含量和相对比例,此项在以往单独露兜树属植物检测中未发现[11, 20-22]。2-乙酰基-1-吡咯啉具有烤爆米花和类大米风味,是泰国香米的特征组分,具有良好的应用前景[3,4],在露兜树属植物中以往仅在香露兜中有检出[24,25,26],本研究中发现大叶斑兰中也有检出,可以预见香露兜和大叶斑兰的种植和利用也会越来越重视;露兜树等由于具有独特的生理活性[7,8,9,10],以后会具有更加广阔的利用空间。
通过研究风味组分差异分析发现,同为露兜树属植物具有相似性,例如醛类、醇类和酮类是露兜树属植物的特征类别组分,当然组分也具有一定的差异性,从聚类热图颜色变化中可明显看出含量差异;相关性系数、主成分分析和聚类结果几者之间相互印证,对区分结果加以验证,以证明其同样具有多样性。研究结果为露兜树属植物的组分提取和生产加工提供了参考,课题组将进一步开展露兜属作物生物活性组分的提取及功能应用研究。