澳洲坚果（Macadamia integrifolia,M. tetraphylla）是我国南亚热带地区新兴的常绿乔木果树,已在我国云南、广西、广东、贵州等省（区）推广种植约200 000 hm2,成为了一个经济与生态效益俱佳的新兴特色产业。然而,随着全球气候变暖,高温对作物生育和产量的威胁已是一个全球性的热点问题[1]。经调查发现,在夏季持续的高温条件下,广东与广西的坚果园中一些耐热性较差的澳洲坚果品种（如‘HAES344’‘桂热1号’等）的新梢叶片容易发生黄化,甚至失水干枯,影响果实产量,而在贵州与云南产区则少见此类现象。然而,迄今有关澳洲坚果叶片黄化的生理特性研究尚未见报道。
叶片是植物进行光合作用的主要器官,叶色变化对植物的光合作用与生长发育有着直接影响。通常情况下,常绿植物叶色的主要决定因子是叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量,叶片黄化主要是由于叶绿素的合成或者降解受到不可避免的影响而改变了叶绿素和类胡萝卜素的比例,进而表现出不正常的褪绿[2]。在高温条件下,植物会通过感受逆境信号而改变其光合生理生化反应,造成外观形态上的热害症状,甚至萎蔫死亡[3]。高温胁迫不仅破坏叶绿体结构,影响叶绿素合成,还能够引发光系统Ⅱ（PSⅡ）受损,造成光合系统活性降低[4,5]。一般认为,高温胁迫主要通过产生过剩激发能,诱导叶绿体中过量活性氧（ROS）生成,使得光合膜脂质过氧化,导致PSⅡ蛋白损伤与叶绿素降解[6,7]。研究表明,在40 ℃/30 ℃（昼/夜）的高温处理下,蝴蝶兰幼苗叶片明显黄化,ROS和丙二醛（MDA）水平增加,而抗氧化酶（SOD、POD与CAT）活性显著下降[8]。通过高温胁迫（40 ℃/35 ℃）处理后发现,蓝莓植株叶色变黄,且叶绿素含量及SOD活性下降[9];芍药叶绿体及其光合机构受到不可逆损伤,造成叶绿素的相对含量（SPAD）和PSⅡ的Fo、Fm、Fv/Fm等叶绿素荧光参数显著降低,导致植株叶片发生黄化,光合能力明显下降[10]。冯建灿等[11]认为,植物的叶绿素荧光和PSⅡ原初反应有着密切关系。高温条件下叶绿素荧光参数迅速下降,PSⅡ反应中心活性受抑制[12,13,14]。但是,不同植物的PSⅡ在高温条件下吸收光能分配比例存在较大差异,反映出不同植物对高温的耐性不同[15]。目前,叶绿素荧光技术被广泛应用于指示植物的胁迫应答反应和评价植株的抗逆性[16,17,18],这在澳洲坚果水分胁迫方面已有报道[19]。然而,有关高温下澳洲坚果叶片的叶绿素荧光特性和ROS代谢还鲜见报道。因此,研究和探讨高温条件下澳洲坚果黄化叶片的生理代谢变化,对澳洲坚果抗热害栽培具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于2019年6月在广东省湛江市中国热带农业科学院南亚热带作物研究所的澳洲坚果试验基地（110°24ʹ E、21°12ʹ N）内进行,以8~10年生的‘HAES344’澳洲坚果正常植株为供试材料。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 经田间观察,于2019年6月1日选择3株生长一致且已抽发正常夏梢的植株,在其树冠外围选择12个长势基本相当的新梢,并对新梢上初始成熟的第4~5轮叶片进行标记观察和叶绿素荧光测定,同时收集相同叶位上的部份成熟叶片为分析样品。随后每日拍照观察,待标记叶片已出现肉眼可见的黄色小斑点时（6月12日）,开始跟踪叶片的黄化程度变化,并选取不同黄化程度的叶片进行采样和叶绿素荧光观测,直至6月30日结束试验。整个试验期间,植株按常规的水、肥管理。
对不同黄化程度的成熟叶片,可按其黄化面积大小分为4组：全绿叶片（S0,于6月1日采集）、轻度黄化叶片（S1,黄化面积低于25%,于6月15日采集）、中度黄化叶片（S2,黄化面积介于50%~75%之间,于6月20日采集）与重度黄化叶片（S3,黄化面积接近100%,于6月28日采集）（图1）。
图1 ‘HAES344’澳洲坚果的不同黄化程度叶片S0：全绿叶片;S1：轻度黄化叶片（黄化面积低于25%）;S2：中度黄化叶片（黄化面积介于50%~70%之间）;S3：重度黄化叶片（黄化面积接近100%）。 Fig. 1 Etiolation leaves with different degree in ‘HAES344’ macadamia S0: Green leaf; S1: Mildly yellow leaf (etiolation area less than 25%); S2: Moderately yellow leaf (etiolation area between 50%-70%); S3: Severely yellow leaf (etiolation area nearly 100%) |
1.2.2 温度数据采集 于2019年6月1日应用ZDR-20型温湿度记录仪采集温度数据,每隔30 min自动记录温度1次,连续追踪树冠顶端叶面处的温度变化,直至6月30日结束。计算日平均温度与昼/夜各个时段的平均温度,并统计昼/夜各个温度段的总时数与平均时数。
1.2.3 测定项目与方法 （1）SPAD值测定。利用叶绿素仪SPAD-502 plus（Konica Minolta, INC, Japan）对植株的取样叶片进行测定,在主叶脉两侧各取3个不同部位测定其SPAD值,并计算平均值。
（2）叶绿素含量测定。参照孔祥生[20]的方法,应用UV-1800型紫外分光光度计测定并计算叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和总叶绿素（Chla+Chlb）含量。每个样品3次重复。
（3）叶绿素荧光参数测定。参考Morison等[21]的方法,利用叶绿素荧光成像系统（CFImager;Technologica Ltd., Colehester, UK）测定叶片叶绿素荧光参数。检测前先将叶片充分暗适应30 min,用弱检测光[0.5 μmol/(m2·s)]测定最小荧光Fo,再给周期性的饱和脉冲光[6000 μmol/(m2·s),脉冲时间0.8 s],诱导最大荧光Fm;然后,打开作用光[750 μmol/(m2·s)],让叶片充分光适应30 min,待光下稳态荧光Fʹ稳定后,再用饱和脉冲光测定Fmʹ。由系统计算出Fv/Fm、Fvʹ/Fmʹ、Fqʹ/Fmʹ和NPQ。单个叶片样品重复测定3次,每株取3个叶片测定。
（4）MDA与H2O2含量测定。MDA含量参照赵世杰等[22]的硫代巴比妥酸（TBA）显色法进行测定。称取0.5 g样品,加入6 mL磷酸缓冲液（50 mmol/L,pH 7.8,含0.2 mmol/L EDTA和2% PVP）进行冰浴研磨,于4 ℃下10000 ×g离心20 min后,取上清液1 mL,加入3 mL TBA反应液（2% TBA与30%三氯乙酸的混合液）,于95 ℃水浴30 min后离心,再取上清液分别测定波长450、532、600 nm处的吸光度值,并计算单位叶片鲜重的MDA含量（nmol/g）。H2O2含量应用北京索莱宝科技有限公司的H2O2试剂盒测定,具体操作参照说明书。
（5）抗氧化酶活性测定。称取0.5 g样品,加入5 mL磷酸缓冲液（50 mmol/L,pH 7.8,含1% PVP）进行冰浴研磨,于4 ℃下10 000×g离心15 min,上清液即为粗酶提取液,用于酶活性测定。超氧化物歧化酶（SOD）活性应用北京索莱宝科技有限公司SOD活性检测试剂盒测定,以“酶活力单位/克鲜重（U/g）”表示酶促反应活性。过氧化物酶（POD）活性参照曾韶西等[23]的愈创木酚氧化法测定,过氧化氢酶（CAT）活性参照Cakmak等[24]的紫外吸收法测定,按每分钟内OD值变化0.01定义为1个活力单位（U）,以“酶活力单位/克鲜重/分钟[U/(g·min)]”表示酶促反应活性。重复测定3次。
1.3 数据处理
应用Microsoft Excel 2007软件进行数据处理,采用SPSS 16.0统计软件对数据进行相关性分析和One-Way ANOVA检验。
2 结果与分析
2.1 试验期间的气温变化情况
于2019年6月,利用温湿度记录仪测得澳洲坚果树冠顶端的气温变化如图2所示。整个6月份的平均温度为31.1 ℃,月平均最低气温为26.9 ℃,月平均最高气温达38.2 ℃;其中,日最高气温超过35 ℃的天数有27 d,而超过38 ℃的天数达18 d,甚至超过40 ℃的天数有6 d（图2A）。经统计,6月份≥35 ℃的总时数达172.5 h,平均每天约5.8 h;其中,≥38 ℃的时数为55.5 h,平均每天约1.9 h。值得注意的是,整月夜间≥28 ℃的总时数达239.5 h,平均约8.0 h/d;其中,≥30 ℃的时数有58.5 h,平均约2.0 h/d（表1）。因此,澳洲坚果植株在6月份生长期间遭受了长时间的昼/夜高温环境影响。
图2 2019年6月澳洲坚果树冠顶端的气温变化Fig. 2 Changes of temperature at the top of macadamia canopy in June, 2019 |
表1 2019年6月澳洲坚果树冠顶端的气温分析Tab. 1 Analysis on temperature at the top of macadamia canopy in June, 2019 |
| 项目Items | 全天温度 Day temperature (00：00—24：00) | 夜间温度 Night temperature (18：00—06：00) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ≥30 ℃ | ≥35 ℃ | ≥38 ℃ | ≥40 ℃ | ≥25 ℃ | ≥28 ℃ | ≥30 ℃ | |
| 总时数/h | 360.0 | 172.5 | 55.5 | 4.0 | 357.0 | 239.5 | 58.5 |
| 平均时数/(h·d-1) | 12.0 | 5.8 | 1.9 | 0.1 | 11.9 | 8.0 | 2.0 |
进一步分析发现,整月的昼平均气温为33.6 ℃,上午（06：00—12：00）、下午（12：00—18：00）两个时段的平均温度相当（图2B）。在夜间,整月的夜温均较高,平均气温达28.5 ℃,其上半夜（18：00—24：00）的平均温度（29.2 ℃）比下半夜（24：00—06：00）高出1.3 ℃（图2C）。期间,昼、夜平均气温还先后出现了3次高峰,分别在6月7—11日、6月20—23日和6月26—29日,其每日的昼、夜平均温度大致分别高于35 ℃与29 ℃。结合不同黄化程度叶片产生的时期发现,从6月1日的全绿叶片至6月15日的轻度黄化叶片产生时其昼/夜平均气温由30.0 ℃/25.6 ℃升高至32.9 ℃/28.2 ℃,而由轻度至中度黄化叶片时（6月16—20日）以及中度至重度黄化叶片时（6月21—28日）,昼/夜平均温度则分别增加至33.0 ℃/ 28.6 ℃和35.4 ℃/29.1 ℃。综合分析可知,昼/夜高温可能对‘HAES344’澳洲坚果叶片生长造成了高温胁迫影响。
2.2 叶绿素荧光参数的变化
2.3 叶片叶绿素含量的变化
2.4 叶片MDA与H2O2含量的变化
H2O2是植物响应逆境胁迫所产生的一种非常重要的ROS,其作用于质膜的产物MDA是反映膜脂过氧化程度的重要指标,MDA含量越高,膜脂过氧化程度或者质膜受损程度越大。由图5可见,MDA和H2O2在全绿叶片中的含量均显著低于黄化叶片,二者在不同黄化程度叶片间均达到显著性差异水平。随着叶片黄化程度的加重,MDA含量逐渐显著增加,而H2O2含量表现出先增加后下降的趋势,且在中度黄化叶片中达到最大值。
2.5 叶片抗氧化酶活性的变化
由图6可知,随着叶片黄化程度的加剧,SOD活性呈先增加后下降的变化趋势,而POD与CAT活性逐渐增强。其中,全绿叶片的SOD活性显著低于轻度黄化叶片,但显著高于重度黄化叶片;黄化叶片的POD和CAT活性均显著高于全绿叶片,且POD和SOD活性在轻度、中度与重度黄化叶片间基本上达到显著性差异水平,但CAT活性在这3种黄化叶片间无显著性差异。
2.6 叶片生理指标的相关性分析
对高温条件下有关叶片黄化生理特性的9个指标进行相关性分析发现,各指标之间存在一定的显著相关性（表2）。其中,CAT与POD酶活性呈显著正相关,SOD活性与Fo则呈极显著正相关;Chla含量与Fv/Fm亦呈显著正相关,但与POD活性呈显著负相关;MDA含量与Fm、Fv/Fm间也均呈显著负相关。
表2 澳洲坚果黄化叶片生理指标的相关性分析Tab. 2 Correlation of physiological indexes from macadamia etiolation leaf |
| 指标 Indexes | CAT | POD | SOD | H2O2 | MDA | Fo | Fm | Fv/Fm | Chla |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CAT | 1 | ||||||||
| POD | 0.970* | 1 | |||||||
| SOD | -0.118 | -0.334 | 1 | ||||||
| H2O2 | 0.830 | 0.797 | -0.290 | 1 | |||||
| MDA | 0.632 | 0.796 | -0.831 | 0.599 | 1 | ||||
| Fo | -0.134 | -0.342 | 0.997** | -0.339 | -0.828 | 1 | |||
| Fm | -0.494 | -0.679 | 0.917 | -0.532 | -0.984* | 0.915 | 1 | ||
| Fv/Fm | -0.707 | -0.857 | 0.739 | -0.581 | -0.985* | 0.730 | 0.942 | 1 | |
| Chla | -0.863 | -0.958* | 0.588 | -0.748 | -0.936 | 0.592 | 0.861 | 0.964* | 1 |
注： *表示差异显著（P<0.05）,**表示差异极显著（P<0.01）。 | |
Note: * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01). |
3 讨论
植物在长期的自然进化过程中形成了适应生长的温度环境。但随着全球气候变暖,温室效应加剧,高温对植物的正常生长造成了严重影响。研究发现,夏季高温可造成芍药茎叶萎蔫与叶色变黄[25,26],导致葡萄叶片失水干枯甚至死亡[27]。陈作泉等[28]认为,澳洲坚果的适宜生长温度是10~30 ℃。在35 ℃以上的自然高温条件下,如‘HAES344’‘HAES508’等澳洲坚果品种的新梢叶片易出现褪绿变黄现象[29]。本研究中,‘HAES344’澳洲坚果在整个试验期间基本上长期处于35 ℃以上高温环境,且遭遇了超过38 ℃的极端高温,与叶片黄化产生及其黄化症状不断加深的时间大致吻合,暗示高温可能导致了叶片黄化,也印证了前人的相关报道。一般情况下,不同种类的作物或者同一种作物的不同基因型对高温的敏感性不同,因而表现出不同的耐热性[3, 25]。在田间自然高温条件下,‘HAES344’澳洲坚果产生叶片黄化,表明其对高温的敏感性要强于其他未发生叶片黄化的品种。研究表明,40 ℃/30 ℃（昼/夜）处理蝴蝶兰幼苗6 d后叶片产生明显黄化[8],40 ℃/35 ℃（昼/夜）处理芍药植株12 d后叶片失绿变黄[10],而蓝莓植株在40 ℃/35 ℃（昼/ 夜）处理4 d后就发生叶片黄化和萎蔫[9]。本研究发现,‘HAES344’澳洲坚果新梢叶片从绿变黄所经历的昼夜平均气温是由30.0 ℃/25.6 ℃升高至32.9 ℃/28.2 ℃,而造成‘HAES344’发生叶片黄化的临界高温及其时长还有待于进一步验证。
叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,其含量在一定程度上反映了其光合作用潜力的大小,是植物生长状况的重要指示剂[30]。叶片的SPAD值与叶绿素含量间存在正相关关系,能有效反映出叶片的叶绿素状况[31],这与本研究结果相一致。叶绿素对高温很敏感,其含量是衡量植物耐热性的一个参考指标[32]。在高温胁迫下,耐热性强的植物始终能够将叶绿素含量保持在较高水平,但热敏感型植物的叶绿素容易遭到破坏和降解[9, 25]。植物叶色变黄与叶绿素含量降低有密切关系[33]。本研究中,‘HAES344’澳洲坚果叶片的叶绿素含量随着叶片黄化程度的加深而显著减少,说明高温可能造成了叶绿素的合成受阻或降解加速,导致叶绿素含量大幅下降,引发叶片失绿变黄,这与蓝莓[9]、芍药[10]及葡萄[34]等作物上的报道相一致,也暗示了‘HAES344’澳洲坚果对高温比较敏感,但调控其叶色变黄的分子生理机制仍需进一步研究。
高温通常会导致光合机构的损伤[35]。研究表明,PSⅡ是容易遭受高温伤害的主要位点,在高温胁迫下PSⅡ的结构和功能易发生改变甚至损伤[36]。叶绿素荧光动力学相关参数能够直接反映PSⅡ的光化学活性。其中,最大荧光Fm反映PSⅡ的电子传递情况,Fm减少表示植物受到光抑制[37];Fv/Fm是反映PSⅡ最大光化学效率的参数,属于热敏指标[38],常作为PSⅡ反应中心的探针应用于作物的耐热性评价[14, 16, 39]。在葡萄[40]、芍药[10]等作物上的研究表明,高温胁迫下PSⅡ反应中心受损,阻碍了PSⅡ的正常功能,导致电子传递效率减弱,进而造成光化学效率下降,表现为Fm、Fv/Fm的降低。当遭受严重高温时,PSⅡ活性中心受到不可逆损伤,Fo、Fm和Fv/Fm等叶绿素荧光参数均发生明显降低[10, 27]。本研究中,Fm与Fv/Fm均随着叶片黄化症状的加剧而显著下降,表明PSⅡ的受损程度不断加重,热害程度逐步增强,这可能与其所遭受的高温时长或者强度增加有关。初始荧光Fo既能够反映PSⅡ结构的基本状态,又可反映类囊体膜的受损程度。卢从明等[41]认为,Fo与叶绿素含量有关。Tu等[42]发现,类囊体膜受损和PSⅡ反应中心出现可逆性失活均会导致Fo升高。本研究结果表明,轻度黄化叶片的Fo明显高于全绿叶片,表明轻度黄化叶片的PSⅡ反应中心发生部分失活,这可能与高温下叶绿素降解或者类囊体结构受损有关,与前人在柑橘[43]、芍药[10]和葡萄[27, 34]上的研究报道一致。但是,中度与重度黄化叶片的Fo显著低于全绿叶片,暗示这两类黄化叶片的PSⅡ已遭受不可逆破坏,这与朱晓静等[33]在中华金叶榆上的研究结果类似。
高温胁迫主要通过产生过剩激发能,导致过量ROS生成,进而损伤光系统[7],同时抑制PSⅡ修复过程,破坏光合机构,使得植物产生光抑制[44]。Chen等[45]认为,耐热型植物可通过耗散过剩激发能来防止电子传递链的过度还原以及PSⅡ中ROS的产生,进而实现较高的耐热性。本研究中,H2O2与MDA含量均随着叶片黄化程度的加深而显著增加,与其Fm、Fv/Fm的变化规律恰好相反,这说明高温条件下‘HAES344’澳洲坚果叶片的光合电子传递能力减弱与光抑制加剧,使得过剩激发能不能够得到及时耗散,导致其ROS过度积累,造成类囊体膜脂过氧化和PSⅡ氧化损伤,最终引起PSⅡ光化学活性的丧失。相关性分析表明,MDA含量与Fm、Fv/Fm间均呈显著负相关,这表明类囊体膜结构破坏与PSⅡ功能受损密切相关。重度黄化叶片的H2O2含量明显低于中度黄化叶片,这可能与重度黄化叶片的叶绿体结构与功能遭到不可逆破坏有关,导致其H2O2合成明显受到抑制,这与葡萄[36]、小麦[46]等作物上的报道一致。刘春英等[13]研究表明,ROS还可直接氧化损伤其周边的胡萝卜素与叶绿素。本研究中,黄化叶片的产生及其症状的加剧,可能与ROS引起的叶绿素降解与叶绿体结构解体有关。
在高温下,植物会诱导抗氧化酶系统来清除过量的ROS,使植物免受热胁迫伤害[47]。SOD、POD和CAT是植物细胞中清除ROS的主要酶类,其活性的高低对维持ROS平衡至关重要。一般认为,SOD活性既受超氧阴离子自由基的诱导,又可将它歧化为H2O2,但生成的H2O2又能诱导POD和CAT活性的提高,并将H2O2清除,以避免对细胞产生毒害作用。本研究表明,轻度黄化叶片的SOD活性显著高于全绿叶片,推测高温可能导致超氧阴离子自由基在轻度黄化叶片中爆发,诱导了SOD活性的增强;而SOD活性与Fo呈极显著正相关,意味着在叶片变黄初期类囊体结构的破坏和叶绿素的降解可能是受到超氧阴离子自由基的毒害所致[8]。试验结果表明,在H2O2与MDA含量明显增加的同时,黄化叶片的POD和CAT活性也相应增强,提高了清除H2O2的能力,说明这两种细胞保护酶在高温所引起的黄化叶片中起到一定的积极保护作用。有证据表明,高温能钝化SOD活性[48]。本研究中,SOD活性随着叶片黄化程度的加剧而显著下降,可能与高温超出了叶片的耐受能力而导致SOD酶活性明显受抑有关,这与高温胁迫下菊花[48]和蝴蝶兰[8]的结果相一致。然而,POD活性持续增加,CAT也保持相对恒定的高活性,这意味着POD与CAT酶蛋白的高温耐受性可能要比SOD高,也表明POD活性可能是伴随叶绿体受损程度的加深而被激发,并与相对恒定的高活性CAT共同作用,以增强高温条件下叶片的抗氧化能力,这可以从CAT与POD活性的显著正相关关系中得到反映。