植物促生细菌通常定殖于植物根际系统或植物内部[1],对植物的生长起促进作用。植物促生细菌能有效分解植物根际土壤中难溶或被固定的元素,促进植物对元素的吸收,能直接或间接促进植物的生长、增产以及抗病等[2,3,4]。目前,植物促生细菌的类群包括芽胞杆菌[5]、假单胞菌[6]、农杆菌[7]、运动节杆菌[8]和沙雷氏菌[9,10]等。
植物促生细菌的促生机制复杂多样,且多数是多种机制共同作用[11]。目前报道的促生菌的促生机理主要包括以下3个方面：（1）通过固氮、解磷和解钾作用,有效分解土壤中难溶和被固定的元素,使营养元素有效化,促进植物生长;（2）合成促进植物生长发育物质,如吲哚-3-乙酸（IAA）、吡咯喹啉醌（PQQ）和植酸酶（phytases）等。大多数植物促生菌能合成IAA[12],参与植物细胞的伸长生长、形成层细胞的分裂、维管组织的分化过程的调节与控制[13];而PQQ不仅能提高植物抗低温胁迫能力[14],微生物还能利用GDH-PQQ全酶作用溶解土壤无机或有机磷酸盐,从而达到促进植物生长[15];而植酸酶能分解植酸,释放磷元素,促进植物磷的吸收[16];（3）促生菌能诱导植物产生系统抗性（ISR）和系统耐受力（IST）,使植物抵抗真菌、细菌和病毒等生物类侵害,耐受重金属,干旱,盐分等非生物胁迫[17],提高植物整体免疫抗病力,促进植物生长。
芽胞杆菌作为植物促生菌的重要类群,在农业生产中有着重要的应用价值。芽胞杆菌促生菌的重要特点是促生菌种资源多样化[5, 18-25]和促生作物品种多样化[22, 25-30]。然而,各芽胞杆菌均含有不同的促生因子（解无机磷、解有机磷、固氮效能、IAA含量、PQQ浓度和植酸酶活性等）,促生因子间的相互关系的研究报道还较少。国内关于植物促生菌的促生因子和促生作用有较多研究,主要集中于菌株筛选、功能测定、代谢物提取与鉴定等方面,尚缺乏完整而充分的筛选条件。前人研究的促生菌的促生因子,单一因子研究较多,而系统研究较少,特别是各促生因子之间的相互关系及其对植物的促生作用的相关性方面。本研究以实验前期高通量筛选得到的14株芽胞杆菌为材料,进行16s rRNA分子鉴定,检测植物促生作用的相关因子,对其促生能力进行评估,并研究促生因子的相关性,对其促生机理进行初步分析,为后续促生菌的应用研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 供试菌株14株,置于-80 ℃甘油冷冻保存,由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供。
1.1.2 供试培养基 LB固体培养基;LB液体培养基;NBRIP培养基;Ashby培养基;有机磷细菌溶磷能力测定培养基;植酸酶筛选培养基。
1.1.3 供试试剂 细菌基因组提取试剂盒（Generary bitehch）,引物为27F和1492R,由上海博尚生物技术有限公司合成,Taq酶购自上海博尚生物技术有限公司。钼锑抗贮存溶液、Salkowski比色液、硫酸蒽酮溶液、吡咯喹啉醌、植酸钙、植酸钠、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钙、三氯乙酸、钼锑抗显色剂、硫酸亚铁-钼酸铵显色剂等购自福州卡文生物科技有限公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4 生测材料 栽培基质采用蔬菜设施专用栽培基质（N+P2O5+K2O≥3%,有机质≥45%）购自厦门市江平生物基质技术股份有限公司;生测用番茄品种为‘农科180’,购自福建农科农业良种开发有限公司;营养液采用霍格兰液。
1.2 方法
1.2.1 促生芽胞杆菌的分子鉴定 采用LB液体培养基于170 r/min,30 ℃摇床中培养48 h,获得培养液,并离心收集菌体。采用Tris-饱和酚法提取菌株基因组DNA,采用16S rRNA基因通用引物27F: 5°-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3°和1492R: 5°-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3°,进行PCR扩增,PCR反应程序参照郑雪芳等[31]的方法,PCR产物送至上海博尚生物技术有限公司测序,应用EZBioCloud完成序列同源性比对,通过MEGA 6.0.6软件分析序列和构建系统发育树。
1.2.2 菌株促生生功能分析 （1）菌株高温胁迫生长性能测定。挑取单菌落于LB培养基中,170 r/min 30 ℃恒温培养48 h,用灭菌超纯水稀释至OD600=0.8左右。吸取200 µL种子液接种于5 mL LB液体培养基中,以空白培养基为对照,分别于30 ℃和60 ℃下170 r/min培养48 h,每株菌3个重复,于酶标仪检测OD600值。
（2）解磷能力测定。有效磷含量检测采用钼锑抗法,参照张祥胜[32]的方法,测定波长700 nm的吸光度,绘制标准曲线,从标准曲线上查得相应的含磷量。
（3）固氮能力测定。固氮效能测定方法参照NY 411—2000《固氮菌肥料》[33]。定糖采用恩酮光电比色法,测氮采用半微量光电比色法。
（4）菌株产IAA能力测定。采用Salkowski比色法,参照高晓星等[34]的方法,根据标准曲线测定细菌分离IAA的量。
（5）菌株产PQQ浓度测定。采用光谱分析法,参照徐文等[35]的方法,根据标准曲线计算样品中PQQ含量。
（6）菌株植酸酶活性测定。采用硫酸亚铁-钼蓝法检测植酸酶活性。先用10 mL LB培养菌24 h,离心,菌体用无菌水洗3次,溶解于1 mL无菌水,取30 μL接种于10 mL植酸酶筛选培养基中,30 ℃,170 r/min摇床中培养5 d。取发酵液离心取上清,得到粗酶液。将200 μL粗酶溶液与800 μL底物溶液于37 ℃孵育30 min后,加入1 mL 10%三氯乙酸终止液终止反应,加入2 mL显色剂,10 min后测量700 nm处的吸光度分析释放的有机磷酸盐。将1个单位的植酸酶活性定义为在植酸钠浓度为1 mmol/L,温度为37 ℃,每分钟释放1 μmol磷酸盐的酶量（U/mL）。
1.2.3 菌株促生特性分析 （1）番茄种子促生试验。将14株芽胞杆菌发酵液稀释1000倍,清水为对照。挑选相对一致的番茄种子置于底部铺置2~3层滤纸的9 cm透明培养盒中,每个培养盒15粒番茄种子,每个处理重复3次,共计45颗。置于27 ℃恒温人工气候箱,光照16 h、黑暗8 h。观察记录番茄发芽情况,直到连续3 d无新的发芽粒出现,统计发芽率并测量胚根长与胚芽长。
（2）番茄幼苗促生试验。基于种子促生实验结果,挑选6株芽胞杆菌用于盆栽苗实验,将芽胞杆菌接种于LB液体培养基中,30 ℃ 170 r/min摇床中培养48 h,培养至菌密度约为(0.8×108)~ (1.2×108) CFU/mL（OD600=0.8左右）。挑选长势相近的番茄幼苗,移栽于花盆中,每盆4株。设置试验组、对照组（CK）,每个处理组20株（5盆）。于室内种植7 d后,进行发酵液灌根处理,用稀释100倍的发酵液每周每盆浇灌200 mL。植物生长期间每2 d浇水1次,每2周浇霍格兰液100 mL/盆。日夜温度分别为25 ℃/20 ℃,日照时间为14 h,盆直径为14 cm。每盆装1 kg灭菌的蔬菜种植基质。35 d后,测量各组番茄植株株高、茎粗、根长、根干重及地上部分干重。
1.3 数据处理
聚类分析：对各芽胞杆菌的解无机磷、解有机磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ浓度等,以芽胞杆菌为样本,检测值为指标,数据不转换,马氏距离为尺度,用可变类平均法进行系统聚类。
相关分析：构建各芽胞杆菌的检测因子：解无机磷、解有机磷、固氮效能、IAA含量、活菌数、发芽率、胚根长、胚芽长数据矩阵,以芽胞杆菌为样本,检测因子为指标,利用DPS统计软件进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 促生作用芽胞杆菌筛选
2.1.1 菌株鉴定 对供试的14株菌株进行分子鉴定,采用引物27 F和1492 R进行PCR扩增,条带在1400 bp左右。通过16S rRNA鉴定与同源性比对,试验菌株为芽胞杆菌科的2个属、9个种,鉴定结果见表1。其中,芽胞杆菌属有7个种,为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、暹罗芽胞杆菌（Bacillus siamensis）、副炭疽芽胞杆菌（Bacillus paranthracis）、萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）、图瓦永芽胞杆菌（Bacillus toyonensis）、贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）和特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）;而类芽胞杆菌属有2个种,为土地类芽胞杆菌（Paenibacillus terrae）和苔原类芽胞杆菌（Paenibacillus tundrae）。
表1 基于16S rRNA基因的菌株种类鉴定Tab. 1 Identification of strains based on 16S rRNA gene sequence analysis |
| 序号 No. | 菌株编号 Strains No. | 菌株扩增条带长度 Length/bp | 同源性最高序列的菌株 Closed match | 相似度 Similarity/% | 分离来源 Sample collection area |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | FJAT-47169 | 1416 | Bacillus siamensis KCTC 13613T (AJVF01000043, 1472 bp) | 99.72 | 西藏双湖宰刚玛日附近土壤 |
| 2 | FJAT-47226 | 1420 | Bacillus siamensis KCTC 13613T (AJVF01000043, 1472 bp) | 99.72 | 西藏双湖县草原土壤 |
| 3 | FJAT-47469 | 1443 | Bacillus paranthracis Mn5T (MACE01000012, 1474 bp) | 99.45 | 西藏纳木错中科院综合观察站周边土壤样品 |
| 4 | FJAT-47472 | 1426 | Bacillus atrophaeus JCM 9070T (AB021181, 1472 bp) | 99.93 | 西藏纳木错中科院综合观察站周边土壤样品 |
| 5 | FJAT-47525 | 1434 | Paenibacillus terrae AM141T (AF391124, 1480 bp) | 99.09 | 西藏尼玛县申亚乡土壤样品 |
| 6 | FJAT-47648 | 1424 | Bacillus toyonensis BCT7112T (CP006863, 1474 bp) | 100.00 | 云南腾冲火山地热国家地质公园草根际土 |
| 7 | FJAT-49376 | 1424 | Bacillus siamensis KCTC 13613T (AJVF01000043, 1472 bp) | 99.86 | 福建省莆田市农科所果树基地芒果根际土 |
| 8 | FJAT-49379 | 1243 | Paenibacillus tundra A10bT (EU558284, 1475 bp) | 99.92 | 福建省武夷山野草根际土 |
| 9 | FJAT-49378 | 1422 | Bacillus velezensis CR-502T (AY603658, 1404 bp) | 99.71 | 福建省福州市新店部队养猪场垫料 |
| 10 | FJAT-10501 | 1419 | Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum KCTC 13429T (AMXN01000021, 1472 bp) | 99.93 | 福建省福州市新店部队养猪场猪垫料 |
| 11 | FJAT-49377 | 1421 | Bacillus tequilensis KCTC13622T (AYTO01000043, 1472 bp) | 100.00 | 福建省宁德市七都镇养猪场垫料 |
| 12 | FJAT-14464 | 1421 | Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum KCTC 13429T (AMXN01000021, 1472 bp) | 99.72 | 福建省漳州市南靖县香蕉发病植株根际土 |
| 13 | FJAT-10626 | 1425 | Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum KCTC 13429T (AMXN01000021, 1472 bp) | 99.93 | 福建省顺昌县金桔叶片内生菌 |
| 14 | FJAT-10275 | 1422 | Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum KCTC 13429T (AMXN01000021, 1472 bp) | 99.72 | 福建省顺昌县黄龙病蜜桔叶片内生菌 |
2.1.2 菌株高温胁迫生长能力测定 不同的芽胞杆菌对高温（60 ℃）胁迫生长的适应性不同,研究结果显示,特基拉芽胞杆菌FJAT-49377在高温下生长能力最强,活菌数达5.28×107 CFU/mL,而土地类芽胞杆菌FJAT-47525最弱,活菌数为0.32×107 CFU/mL（表2）。
表2 芽胞杆菌菌株的高温生长特性（60 ℃）Tab. 2 Growth characteristics of Bacillus strains at high temperature (60 ℃) |
| 序号 No. | 菌株 Strains | 活菌数 Number of living bacterium /(107 CFU·mL‒1) |
|---|---|---|
| 1 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 5.28 |
| 2 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 5.04 |
| 3 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 3.36 |
| 4 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 3.28 |
| 5 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 3.28 |
| 6 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 3.12 |
| 7 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 2.64 |
| 8 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 2.56 |
| 9 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 1.68 |
| 10 | 副炭疽胞杆菌FJAT-47469 | 1.52 |
| 11 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 1.52 |
| 12 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 0.80 |
| 13 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 0.48 |
| 14 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 0.32 |
2.2 与芽胞杆菌促生作用相关的生理生化特性
2.2.1 菌株无机磷降解能力测定 不同芽胞杆菌对无机磷的降解能力不同,芽胞杆菌降解无机磷的范围在‒2.05~297.36 mg/L（表3）。其中降解能力最强的是副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469,磷增量为297.36 mg/L,较CK提高了588.25%;最弱的则为枯草芽胞杆菌FJAT-10626,磷增量为‒2.05 mg/L,磷含量较CK减少3.02%。
表3 芽胞杆菌菌株无机磷降解能力Tab. 3 The ability of Bacillus strains to dissolve inorganic phosphorus |
| 序号 No. | 菌株 Strains | 磷含量 Phosphorus content /(mg·L‒1) | 磷增量 Phosphorus incremental /(mg·L‒1) | |
|---|---|---|---|---|
| CK | 处理Treatments | |||
| 1 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 50.55 | 347.91 | 297.36 |
| 2 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 50.55 | 257.63 | 207.08 |
| 3 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 67.78 | 237.51 | 169.73 |
| 4 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 67.78 | 205.95 | 138.17 |
| 5 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 50.55 | 181.69 | 131.14 |
| 6 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 67.78 | 198.30 | 130.52 |
| 7 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 67.78 | 184.29 | 116.51 |
| 8 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 50.55 | 145.22 | 94.67 |
| 9 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 67.78 | 156.66 | 88.88 |
| 10 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 50.55 | 127.80 | 77.25 |
| 11 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 67.78 | 140.23 | 72.45 |
| 12 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 67.78 | 123.98 | 56.20 |
| 13 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 67.78 | 123.05 | 55.27 |
| 14 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 67.78 | 65.73 | ‒2.05 |
对无机磷增量进行聚类分析表明,当λ=15.1时,供试菌株分为3个类群。类群I为没有无机磷降解能力组,仅1个菌株,为枯草芽胞杆菌FJAT-10626,特征是不具备无机磷降解能力,磷增量为-2.05 mg/L;类群II为中等无机磷降解能力组,包含6株芽胞杆菌（贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378、暹罗芽胞杆菌FJAT-49376、苔原类芽胞杆菌FJAT-49379、土地类芽胞杆菌FJAT- 47525、枯草芽胞杆菌FJAT-10275、暹罗芽胞杆菌FJAT-47169）,其特征为具有中等无机磷降解能力,表现出中等的磷增量,范围为55.27~94.67 mg/L;类群III为强无机磷降解能力组,包含其余7株芽胞杆菌,表现出较高的磷增量,其范围为116.51~ 297.36 mg/L。
2.2.2 菌株有机磷降解能力测定 芽胞杆菌的有效磷含量见表4。不同的芽胞杆菌对有机磷的降解能力不同,范围为‒3.596~5.011 mg/L。其中,有机磷降解能力最强的菌株为图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648,磷增量为5.011 mg/L,较CK提高150.45%;降解能力最弱的为土地类芽胞杆菌FJAT-47525。
表4 芽胞杆菌菌株降解有机磷能力Tab. 4 The ability of Bacillus strains to degrade organophosphorus |
| 序号 No. | 菌株 Stains | 磷含量 Phosphorus content /(mg·L‒1) | 磷增量 Phosphorus incremental /(mg·L‒1) | |
|---|---|---|---|---|
| CK | 处理Treatments | |||
| 1 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 3.33 | 8.34 | 5.01 |
| 2 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 3.33 | 8.33 | 5.00 |
| 3 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 3.33 | 4.62 | 1.30 |
| 4 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 3.33 | 3.07 | -0.26 |
| 5 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 3.33 | 2.68 | -0.65 |
| 6 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 4.69 | 3.70 | -0.99 |
| 7 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 4.69 | 3.53 | -1.16 |
| 8 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 3.33 | 1.63 | -1.70 |
| 9 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 3.33 | 1.34 | -1.98 |
| 10 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 3.33 | 1.34 | -1.99 |
| 11 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 3.33 | 1.32 | -2.01 |
| 12 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 4.69 | 2.63 | -2.06 |
| 13 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 4.69 | 1.52 | -3.17 |
| 14 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 4.69 | 1.09 | -3.60 |
对有机磷增量进行聚类分析表明,当λ=13.6时,供试菌株分为3个类群。类群I为无有机磷降解能力组,该类群特征为磷含量减少较多,磷增量范围为‒3.60~ ‒3.17 mg/L,包含2株芽胞杆菌（土地类芽胞杆菌FJAT-47525和萎缩芽胞杆菌FJAT-47472）;类群II为无有机磷降解能力组,磷含量减少适中,其磷增量范围为‒2.06~‒1.70 mg/L,包含5株芽胞杆菌（暹罗芽胞杆菌FJAT-47226、枯草芽胞杆菌FJAT-10501、枯草芽胞杆菌FJAT- 14464、贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378、特基拉芽胞杆菌FJAT-49377）;类群III为低有机磷降解能力组,其特征为具有较弱有机磷降解能力,表现出相对高的磷增量,磷增量的范围为‒1.16~ 5.01 mg/L,包含其余7株芽胞杆菌。
2.2.3 菌株固氮效能测定 采用比色法测定了芽胞杆菌的固氮效能。不同芽胞杆菌的固氮效能存在差异,固氮效能范围为-8.80~27.67 mg/g（表5）。最高为萎缩芽胞杆菌FJAT-47472,其固氮效能为27.67 mg/g;最低的则为图瓦永芽胞杆菌FJAT- 47648。
表5 芽胞杆菌菌株的固氮效能Tab. 5 Nitrogen fixation efficiency of Bacillus strains |
| 序号 No. | 菌株 Stains | 糖耗量 Sugar consumption /(mg·L‒1) | 固氮量 Amount of nitrogen /(mg·L‒1) | 固氮效能 Nitrogen fixation efficiency /(mg·g‒1) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 75.38 | 2.09 | 27.67 |
| 2 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 92.80 | 2.39 | 25.75 |
| 3 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 175.81 | 3.95 | 22.47 |
| 4 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 168.28 | 3.28 | 19.49 |
| 5 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 147.63 | 2.40 | 16.29 |
| 6 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 166.13 | 2.47 | 14.86 |
| 7 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 102.69 | 1.52 | 14.83 |
| 8 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 151.08 | 1.78 | 11.80 |
| 9 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 73.87 | 0.78 | 10.51 |
| 10 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 169.78 | 1.29 | 7.62 |
| 11 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 147.63 | 0.68 | 4.61 |
| 12 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 149.57 | 0.28 | 1.90 |
| 13 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 84.41 | -0.15 | -1.74 |
| 14 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 92.15 | -0.81 | -8.80 |
对固氮效能进行聚类分析表明,当λ=14.75时,供试菌株分为3个类群。类群I为低固氮效能组,仅1株芽胞杆菌（图瓦永芽胞杆菌FJAT- 47648）,其特征为固氮能力较低,固氮效能为-8.80 mg/g;类群II为中固氮效能组,包含4株芽胞杆菌（副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469、枯草芽胞杆菌FJAT-10275、枯草芽胞杆菌FJAT-10626、苔原类芽胞杆菌FJAT-49379）,其特征为具有中等固氮能力,表现出中等的固氮效能,其范围为-1.74~7.62 mg/g;类群III为高固氮效能组,包含其余9株芽胞杆菌,其特征为具有相对高的固氮能力,固氮效能为10.51~27.67 mg/g。
2.2.4 菌株产IAA能力测定 采用Salkowski比色法检测了芽胞杆菌产IAA的含量,结果表明所有供试菌株能具备产IAA的能力,其浓度范围为1.23~10.29 mg/L（表6）。其中IAA含量最高的菌株为贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378,为10.29 mg/L;而含量最低的为图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648,浓度为1.23 mg/L。
表6 芽胞杆菌菌株产IAA的含量Tab. 6 The content of IAA produced by Bacillus strains |
| 序号No. | 菌株Stains | IAA含量 IAA concentration /(mg·L‒1) |
|---|---|---|
| 1 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 10.29 |
| 2 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 10.00 |
| 3 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 8.98 |
| 4 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 8.36 |
| 5 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 8.24 |
| 6 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 8.16 |
| 7 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 7.66 |
| 8 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 7.58 |
| 9 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 7.34 |
| 10 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 7.34 |
| 11 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 7.17 |
| 12 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 5.16 |
| 13 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 4.71 |
| 14 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 1.23 |
通过聚类分析表明,λ=15.0时,供试菌株分为3个类群。类群I为高产IAA组,包含2株芽胞杆菌（贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378和苔原类芽胞杆菌FJAT-49379）,其特征为IAA含量较高,为10.00~10.29 mg/L;类群II为低产IAA组,包含3株芽胞杆菌（枯草芽胞杆菌FJAT-10626、枯草芽胞杆菌FJAT-14464和图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648）,其特征为产IAA能力较弱,IAA含量为1.23~5.16 mg/L;类群III则为中等产IAA组,包含了其余9株芽胞杆菌,其特征为具有中等的产IAA能力,产生的IAA含量范围为7.17~ 8.98 mg/L。
2.2.5 菌株PQQ浓度测定 采用光谱法测定了芽胞杆菌对产吡咯喹啉醌的浓度（表7）。其中,产PQQ的菌株有7株,占供试菌株数的50%,PQQ的浓度范围为0.00~55.01 μg/mL,含量最高的菌株为暹罗芽胞杆菌FJAT-49376。
表7 芽胞杆菌菌产PQQ浓度Tab. 7 The concentration of PQQ produced by Bacillus strains |
| 序号No. | 菌株Stains | PQQ浓度 PQQ concentration /(μg·mL‒1) |
|---|---|---|
| 1 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 55.01 |
| 2 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 44.30 |
| 3 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 34.65 |
| 4 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 27.67 |
| 5 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 21.08 |
| 6 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 7.37 |
| 7 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 3.86 |
| 8 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 0.00 |
| 9 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 0.00 |
| 10 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 0.00 |
| 11 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 0.00 |
| 12 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 0.00 |
| 13 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 0.00 |
| 14 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 0.00 |
对PQQ浓度进行聚类分析表明,当λ=9.75时,供试菌株分为3个类群。类群I为高产PQQ能力组,包含5株芽胞杆菌（暹罗芽胞杆菌FJAT- 47226、暹罗芽胞杆菌FJAT-47169、贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378、枯草芽胞杆菌FJAT-10275和暹罗芽胞杆菌FJAT-49376）,其特征为具有较强的产PQQ能力,表现出较高PQQ浓度,范围为21.08~55.01 μg/mL;类群II为PQQ中等产量组,包含2株芽胞杆菌（副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469和图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648）,其特征为具有中等产PQQ的能力,其PQQ浓度范围为3.86~ 7.37 μg/mL;类群III为不产PQQ组,包含其余7株芽胞杆菌,PQQ浓度为0。
2.2.6 菌株植酸酶活性测定 采用硫酸亚铁-钼蓝法检测了菌株的植酸酶活性,酶活范围为0.00~ 19.62 U/mL（表8）。植酸酶酶活最高菌株为枯草芽胞杆菌FJAT-14464,为19.62 U/mL。供试菌株中具有植酸酶活性的菌株有10株,包含全部暹罗芽胞杆菌菌株（3株）与枯草芽胞杆菌菌株（4株）。
表8 芽胞杆菌菌产植酸酶的活性Tab. 8 Phytase activity of Bacillus strains |
| 序号No. | 菌株Stains | 植酸酶活性 Phytase activity/(U·mL‒1) |
|---|---|---|
| 1 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 19.62 |
| 2 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 18.28 |
| 3 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 17.18 |
| 4 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 16.69 |
| 5 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 16.45 |
| 6 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 14.37 |
| 7 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 14.13 |
| 8 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 13.76 |
| 9 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 13.39 |
| 10 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 7.90 |
| 11 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 0.00 |
| 12 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 0.00 |
| 13 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 0.00 |
| 14 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 0.00 |
对植酸酶活性进行聚类分析表明,当λ=9.75时,供试菌株分为3个类群。类群I为无植酸酶活性组,包含4株芽胞杆菌（苔原类芽胞杆菌FJAT-49379、土地类芽胞杆菌FJAT-47525、萎缩芽胞杆菌FJAT-47472和副炭疽芽胞杆菌FJAT- 47469）,其植酸酶活性为0;类群II为低植酸酶活性组,包含1株芽胞杆菌（暹罗芽胞杆菌FJAT-47169）,其特征为具有中等植酸酶活性,其酶活为7.90 U/mL;类群III为高植酸酶活性组,包含其余9株芽胞杆菌,其特征为具有较强的植酸酶活性,表现出较高植酸酶酶活,范围为13.39~19.62 U/mL。
2.3 芽胞杆菌对番茄种子发芽的影响
2.3.1 芽胞杆菌对番茄种子发芽的影响 通过种子发芽试验,研究芽胞杆菌对番茄种子的促生作用,结果见表9。不同芽胞杆菌对番茄种子生物活性的影响存在不同。从发芽率看芽胞杆菌对番茄种子的发芽均有促进作用,种子发芽率范围为82.22%~93.33 %,较CK提高了0.74%~11.85%。其中暹罗芽胞杆菌FJAT-49376和特基拉芽胞杆菌FJAT-49377的促发芽效果最明显,其发芽率达93.33%。从胚根长度来看,12株芽胞杆菌对胚根的生长具有促生作用,其胚根长为54.97~ 87.36 mm,较CK提高了4.03~65.33%。同时存在2株菌对番茄种子胚根的生长具有抑制作用,分别为暹罗芽胞杆菌FJAT-49376和暹罗芽胞杆菌FJAT-47226。从胚芽长来看,有8株芽胞杆菌对种子胚芽有促进作用,其中促生作用最明显的是土地类芽胞杆菌FJAT-47525,增长率为18.17%。
表9 芽胞杆菌对番茄种子的促生作用Tab. 9 Effect of Bacillus strains on germination of tomato seeds |
| 序号 No. | 菌株 Stains | 发芽率 Germination rate/% | 胚根长 Radicle length/mm | 胚芽长 Plumule length/mm |
|---|---|---|---|---|
| CK（清水） | 81.48±5.47 | 52.84±6.36 | 20.14±1.58 | |
| 1 | 特基拉芽胞杆菌FJAT-49377 | 93.33±3.85 | 87.36±7.32 | 19.67±0.85 |
| 2 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-49376 | 93.33±0.00 | 8.74±0.79 | 12.00±0.86 |
| 3 | 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-49378 | 91.11±5.88 | 83.95±6.19 | 21.89±0.72 |
| 4 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10626 | 91.11±2.22 | 84.92±5.71 | 21.65±0.99 |
| 5 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10275 | 91.11±2.22 | 78.43±5.88 | 20.89±0.99 |
| 6 | 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 91.11±2.22 | 61.41±5.59 | 16.05±1.58 |
| 7 | 枯草芽胞杆菌FJAT-14464 | 88.89±4.44 | 83.97±5.83 | 21.51±0.99 |
| 8 | 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 88.89±2.22 | 87.05±5.46 | 23.33±1.22 |
| 9 | 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 88.89±2.22 | 80.05±4.77 | 23.80±1.12 |
| 10 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 88.89±2.22 | 35.97±3.54 | 12.31±1.38 |
| 11 | 枯草芽胞杆菌FJAT-10501 | 86.67±3.85 | 81.51±4.58 | 20.39±1.06 |
| 12 | 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 86.67±0.00 | 54.97±5.59 | 16.44±1.52 |
| 13 | 苔原类芽胞杆菌FJAT-49379 | 84.44±2.22 | 68.53±3.95 | 20.67±0.90 |
| 14 | 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 82.22±4.44 | 57.97±5.44 | 15.65±1.28 |
2.3.2 芽胞杆菌对番茄种子发芽促生因子的相关分析 构建分析数据矩阵,以芽胞杆菌为样本,以6个促生因子、芽胞杆菌活菌数、种子生物学特性（发芽率、胚根长、胚芽长）为指标,进行相关系数统计,分析结果见表10。统计结果表明,促生因子（解无机磷、解有机磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ浓度）之间无相关关系（P>0.05）,与芽胞杆菌活菌数无相关关系（P> 0.05）,与种子发芽率、胚根长、胚芽长也无明显相关关系（P>0.05）。种子生物学特性中发种子芽率与胚根长、胚芽长无相关关系（P>0.05）,而胚根长和胚芽长之间具有显著性相关（P<0.01）。
表10 芽胞杆菌对番茄种子促生因子的相关系数及其检验Tab. 10 Correlation coefficient of Bacillus strains to growth promoting factors in tomato seeds and its test |
| 因子 Factors | 解无机磷 Solution of inorganic phosphorus | 解有机磷 Solution of organophosphorus | 固氮效能 Nitrogen fixation efficiency | IAA含量 IAA content | 植酸酶活性 Phytase activity | PQQ浓度 PQQ concentration | 活菌数 Number of living bacterium | 发芽率 Germination rate | 胚根长 Radicle length | 胚芽长 Plumule length |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 | X7 | X8 | X9 | X10 | |
| X1 | 0.4952 | 0.7989 | 0.5773 | 0.2444 | 0.2376 | 0.5480 | 0.8096 | 0.8331 | 0.3867 | |
| X2 | ‒0.1990 | 0.2237 | 0.1408 | 0.1532 | 0.3840 | 0.4484 | 0.5194 | 0.2640 | 0.6737 | |
| X3 | ‒0.0750 | ‒0.3473 | 0.1299 | 0.8204 | 0.6816 | 0.6661 | 0.8766 | 0.2249 | 0.2799 | |
| X4 | ‒0.1632 | ‒0.4143 | 0.4249 | 0.4033 | 0.4158 | 0.4500 | 0.5280 | 0.4075 | 0.3022 | |
| X5 | ‒0.3332 | 0.4029 | 0.0668 | 0.2426 | 0.1612 | 0.1202 | 0.3557 | 0.0431 | 0.1195 | |
| X6 | ‒0.3378 | 0.2524 | 0.1205 | ‒0.2364 | 0.3959 | 0.1016 | 0.1182 | 0.8837 | 0.9837 | |
| X7 | 0.1757 | ‒0.2206 | 0.1267 | ‒0.2199 | ‒0.4349 | 0.4556 | 0.6851 | 0.1103 | 0.4733 | |
| X8 | ‒0.0709 | 0.1882 | ‒0.0457 | ‒0.1844 | 0.2672 | 0.4370 | 0.1191 | 0.9074 | 0.9883 | |
| X9 | ‒0.0621 | ‒0.3205 | ‒0.3465 | ‒0.2405 | ‒0.5467 | 0.0431 | 0.4455 | ‒0.0343 | 0.0000 | |
| X10 | ‒0.2510 | ‒0.1236 | ‒0.3106 | ‒0.2971 | ‒0.4356 | ‒0.0060 | 0.2090 | ‒0.0043 | 0.9070 |
注：左下角是相关系数r,右上角是P值。 | |
Note: The correlation coefficient r is in the lower left corner and the P value is in the upper right corner in the table. |
2.3.3 基于芽胞杆菌的种子发芽率促生因子聚类分析 构建矩阵,以解无机磷、解有机磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ浓度、活菌数、发芽率、胚根长、胚芽长等为样本,以芽胞杆菌为指标,进行聚类分析（图1）。当λ=7.7时,供试菌株分为3个类群。类群I为种子的生物学特性组,包括了3个因子,分别为发芽率、胚芽长和胚根长;类群II为活菌数、PQQ浓度和植酸酶活性;类群III为解有机磷能力、解无机磷能力、固氮效能与产IAA含量。
2.4 芽胞杆菌对番茄幼苗的促生作用
为了进一步验证芽胞杆菌对番茄的促生效果,采用株高、根长和茎粗3个指标,评价芽胞杆菌对番茄幼苗生长特性的影响（表11）。结果表明,不同芽胞杆菌对番茄幼苗促生效果存在不同。试验的5株芽胞杆菌均能显著提升株高,增长率达36.00%~59.61%,其中,暹罗芽胞杆菌FJAT-47169效果最好,能提升幼苗株高达59.61%。在促进根生长方面,3株菌均能显著增加根长42.74%~53.31%,副炭疽芽胞杆菌FJAT- 47469的促生效果最明显,增长率为53.31%。但番茄幼苗经各芽胞杆菌处理后,茎粗均与对照无显著差异。
表11 芽胞杆菌对番茄幼苗促生的影响Tab. 11 Effect of Bacillus strains on growth promotion of tomato seedling stage |
| 菌株 Stains | 生长特性Growth characteristics | 生物量Biomass | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 株高 Height/mm | 茎粗 Stem diameter/mm | 根长 Root length/cm | 地上部干重 Dry weight of shoot/mg | 地下部干重 Dry weight of root/mg | |
| 暹罗芽胞杆菌FJAT-47169 | 437.33±35.20a | 4.13±0.14a | 19.17±2.04abc | 1049.66±138.34a | 177.27±17.64c |
| 暹罗芽胞杆菌FJAT-47226 | 431.33±29.09a | 4.00±0.12a | 15.44±1.45bcd | 892.05±126.38a | 170.70±16.85c |
| 副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469 | 400.92±34.07ab | 3.99±0.11a | 20.59±1.54a | 913.62±148.97a | 283.56±37.02a |
| 萎缩芽胞杆菌FJAT-47472 | 431.17±32.83a | 4.08±0.09a | 17.98±1.36bcd | 754.10±70.62ab | 229.09±31.72abc |
| 土地类芽胞杆菌FJAT-47525 | 372.64±33.00ab | 4.08±0.13a | 14.88±1.55cd | 741.98±108.49ab | 191.84±25.65bc |
| 图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648 | 323.67±19.02bc | 4.21±0.12a | 19.66±1.65ab | 904.47±121.92a | 276.61±39.44ab |
| CK | 274.00±22.45c | 3.97±0.20a | 13.43±0.77d | 517.56±48.13b | 172.60±14.14c |
注：表中数据为平均值±标准误;同列数据不同小写字母表示经Duncan’s新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。 | |
Note: Data are mean ± SE. Different letters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by Duncan’s new multiple range test. |
在芽胞杆菌处理对植株生物量的影响方面,4株芽胞杆菌能显著增加地上部干重,增长率为72.36%~102.80%,其中暹罗芽胞杆菌FJAT- 47169的增长率最高,为102.80%。而图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648和副炭疽芽胞杆菌FJAT-47469能显著提高地下部干重,较CK分别增加了60.26%和 64.29%。
3 讨论
芽胞杆菌能促进植物种子萌发、幼苗及根系生长[37],提高植物产量,改善品质。目前,关于芽胞杆菌促生作用的报道较多,车建美等用短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的菌体、发酵上清液及发酵液喷施的番茄苗叶片数量明显增加,芽长和茎粗也明显高于对照组[5]。张翠绵等研究表明接种枯草芽胞杆菌G81后,番茄幼苗的各项生理指标均明显提高[38]。本研究也呈现出类似的结果,芽胞杆菌对番茄种子、番茄幼苗都表现出明显的促生效果。在对番茄种子促生方面,14株芽胞杆菌提升了番茄种子的发芽率,增长0.74%~ 11.85%。其中暹罗芽胞杆菌FJAT-49376和特基拉芽胞杆菌FJAT-49377的发芽率达93.33%;12株芽胞杆菌能促进番茄种子胚根的生长,较CK提高了4.03%~65.33%;8株芽胞杆菌对种子的胚芽生长有促进作用,其中土地类芽胞杆菌FJAT- 47525的效果最好,胚芽较对照提高18.17%。在对番茄幼苗（盆栽苗）促生方面,5株芽胞杆菌能显著提升株高,增长率为36.00%~59.61%;3株菌显著促进根长,增长率为42.74%~53.31%;而茎粗与对照则无明显差异;4株芽胞杆菌能显著促进地上部生物量,地上部干重增长达72.36%~ 102.80%;而2株芽胞杆菌能显著提高地下部干重,增长60.26%~64.29%。另外,研究结果表明,供试的所有芽胞杆菌对番茄幼苗均有一定的促生作用,但促生的部位与效果存在不同。如图瓦永芽胞杆菌FJAT-47648能显著增加根长,提升地上部与地下部干重,而暹罗芽胞杆菌FJAT- 47226的促生效果则主要表现在增加株高和地上部生物量上。
近年来,研究者们陆续开展促生因子的特性及其相关性的研究。王奎萍等[13]研究发现,解磷、固氮、产IAA与植物促生效果间存在明显的正相关,且解磷和固氮活性对植物的影响要大于产IAA活性;焦子伟等[15]认为PQQ可作为直接促生因子和IAA共同参与HX2菌株对增加玉米生物量,提高营养摄入,促进其根形态等有关键的调控作用;谢越盛等[39]以固氮、解（溶）磷以及分泌嗜铁素、IAA活性为指标,对其促生能力进行赋值评估,结果表明细菌的平板活性赋值与促生效果之间存在较高的正相关性。芽胞杆菌促生因子对植物的促生作用是相互独立的,研究表明,促生因子（解无机磷、解有机磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ浓度）之间无相关关系（P>0.05）,与番茄种子发芽率、胚根长、胚芽长也无明显相关关系（P>0.05）。研究发现促生作用好的芽胞杆菌,其促生因子含量并不一定高,反之也成。芽胞杆菌促生因子的作用十分复杂,有待于进一步研究。
研究结果表明,芽胞杆菌促生因子独立发生作用的,促生的过程十分复杂,特定的促生因子所起到作用有限。筛选出的4株芽胞杆菌,尽管它们的促生因子并非最好,但能够显著增加地上部干重,增长72.36%~102.80%,而2株芽胞杆菌可以显著提高地下部干重,较CK分别增加了60.26%~64.29%。具有高效促生功能的微生物肥料用于农业生产,能够充分利用土壤潜在元素,对促进农业可持续发展具有重要意义。目前存在的问题包括促生菌种类很多,但是部分菌株在田间的效果不稳定,针对性不强,因此需要继续开展菌种适生性、稳定性与促生作用机理的研究。本研究筛选到的菌株,在田间环境的适应性,在不同作物根际的定殖能力与解磷、固氮、产生长素的实际效果,还有待进一步研究。