巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属于大戟科橡胶树属[1],其产生的胶乳在工业、国防等领域有着十分重要的作用。橡胶树喜高温、高湿的生长环境,易受极端天气的影响,微弱的生长环境变化就会导致胶乳品质和产量的下降[2]。生长调控因子（growth-regulating factors, GRF）是一类成员数目较多的、植物特有的转录因子家族,参与了植物生长发育等过程的调控[3,4,5]。本研究通过克隆橡胶树HbGRF基因,并进行了基因定位及表达分析,为研究橡胶树HbGRF基因的功能及作用机制奠定了理论基础,也为橡胶树精准育种提供了理论指导。植物里最先被发现的GRF基因是水稻的OsGRF1,它编码的蛋白通过调控赤霉素影响茎的伸长[6]。目前,已报道的GRF家族基因在拟南芥和水稻中分别有9个和12个成员[7,8],杨树中有19个成员[9],番茄中有13个成员[10],陆地棉中有33个成员[11],油菜中有34个成员[12],烟草中有25个成员[13],桃树中有10个成员[14],茶树中有11个成员[15],藜麦中有18个成员[16]。该基因家族编码的蛋白序列的N末端一般含有QLQ（Gln、Leu、Gln）和WRC（Trp、Arg、Cys）2个保守结构域,QLQ结构域与GRF互作因子（GRF-interacting factor, GIF）相互作用形成转录激活因子[17],WRC中包含一个与DNA相结合的锌指结构和核定位信号区域（NLS）,它们在基因行使其生物学功能方面起到了重要作用[7]。在植物中,GRF基因家族的成员在发育活跃的部位如花芽、根尖及幼叶中表达量较高,在成熟的部位表达量相对较低[18,19],多种GRF基因在叶和茎的生长、花的发育、胚珠形成等方面发挥了重要的作用,GRF基因还可通过负反馈调节机制在植物渗透胁迫下发挥作用[7]。目前,在杨树、桃树、苹果等许多植物中已对GRF基因家族进行了鉴定及功能分析,上述研究完善了我们对GRF基因家族的认识,但该家族在橡胶树中的研究及功能分析尚未见报道。本研究经克隆得到HbGRF基因,运用生物信息学和基因表达等方法分析HbGRF及其蛋白的基本信息,初步了解HbGRF在橡胶树生长发育过程中的生物学功能及作用机制;利用原位PCR和荧光原位杂交技术探究HbGRF与其他功能基因之间的位置关系,这可为橡胶树精准育种设计提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以正常生长开割10 a的巴西橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为材料,采集根、茎、茎尖、叶片、树皮、果实、雌花以及不同发育时期的花序。实验材料由中国热带农业科学院国家橡胶树种质资源圃提供。
外源赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）处理所用材料为1 a的‘热研7-33-97’组培苗,每个处理组设置5棵幼苗。GA处理：对植株喷施浓度为200 µmol/L的GA,使用过程中以无水乙醇溶解GA后喷施处理植株,并以喷施等浓度乙醇处理的植株为对照,分别采集处理0、0.5、2、6、12、24、48 h植株与对照植株的叶片,ABA处理与GA处理方法相同。以上所有材料取样后用液氮速冻,保存至-80 ℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树HbGRF基因的克隆 根据GRF家族基因的保守序列,在橡胶树基因组数据库（http://hevea.catas.cn）中做同源序列搜索,通过CDS编码区预测和序列拼接得到橡胶树HbGRF1、HbGRF2、HbGRF3基因的cDNA序列。运用Primer Primer 5.0软件进行引物设计（表1）。用反转录得到的橡胶树雌花cDNA为模板,对橡胶树HbGRF基因家族的HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3 3个成员的编码区进行扩增,PCR反应体系为20 µL,其中包括Prime STAR Max Premix（2×）10 µL,cDNA模板1 µL,上、下游引物各0.4 µL,灭菌的ddH2O 8.2 µL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共扩增35个循环;最后于72 ℃延伸10 min。使用OMEGA公司的凝胶回收试剂盒对产物进行回收纯化后与pMD19-T载体进行连接,转化至大肠杆菌DH5α中,挑选阳性克隆重组子交华大基因公司测序。
1.2.2 橡胶树HbGRF基因的生物信息学分析 HbGRF基因的编码区序列及氨基酸序列的比对和预测分析是通过NCBI中的BLAST软件和ORF Finder软件完成,其所编码蛋白的理化特性通过ExPASy ProtParam在线分析[20]。HbGRF蛋白的亚细胞定位、信号肽、编码蛋白的跨膜区段及功能结构域预测,分别采用PSORT、SignalP、TMpred及SMART软件进行分析。使用PredictProtein软件对HbGRF基因家族编码蛋白的二级结构进行预测分析。使用DNAMAN 6.0软件对近源物种的HbGRF蛋白的氨基酸序列进行多重比对分析。使用MEGA 7.0软件对HbGRF蛋白进行系统进化树分析。
1.2.3 橡胶树HbGRF基因在染色体上的物理定位
表1 PCR引物序列Tab. 1 Primers sequences for PCR |
| 基因 Gene | 上游引物(5ʹ-3ʹ) Forward primer (5ʹ-3ʹ) | 下游引物(5ʹ-3ʹ) Reverse primer (5ʹ-3ʹ) | 用途 Use |
|---|---|---|---|
| HbGRF1 | AAATAGTTACAAAGCAGGC | TTCTTCAGTGTAGAGGTGGTG | 基因克隆 |
| GCTGCCTCTTCCTCATC | AACACCTTGGACTACGA | 基因定位 | |
| AGAAAGCCTGTGGAAGGTCA | CCACCACAGCTGCTGAAATA | 定量分析 | |
| HbGRF2 | AAGTTGCTGGTAAGAACAAG | AAAGATGCCAAAACTCCTCCT | 基因克隆 |
| GCACCCTTTATGTTTCC | CAGCAAGATTTGTTAGTAGAG | 基因定位 | |
| CAGGTACATGTTGGCTGGTG | ATACGGTGGAGAGCGAAGAA | 定量分析 | |
| HbGRF3 | TCACTACCGTCCGTTTCCATC | CAACCACGGCAATCCAATC | 基因克隆 |
| ACCGCATAATAACCAAT | GTTCAAGAAAGCCTGTG | 基因定位 | |
| AGATCCAAATGGGGTTAGGC | GTGTAGCCCCTGTCCAAGAA | 定量分析 | |
| 18S rRNA | GCTCGAAGACGATCAGATACC | TTCAGCCTTGCGACCATAC | 定量分析 |
（3）原位PCR：参照官锦燕等[25]的原位PCR方法进行改进,对HbGRF1和HbGRF2基因进行检测。
（4）荧光原位杂交：将PCR扩增得到的HbGRF3基因的扩增产物回收纯化后,用地高辛切口平移试剂盒DIG-Nick Translation Mix将其标记成探针,信号位点呈现绿色;标记好的探针溶于100%去离子甲酰胺溶液中,且终浓度为50 ng/µL;将标记好的探针置于-20 ℃冰箱中避光保存备用。荧光原位杂交的方法参照本课题组邱海燕[26]报道的方法进行检测。
$扩增信号位点的百分距离=\frac{扩增信号位点到着丝粒的距离}{扩增信号位点所在染色体臂的长度}×100$
2 结果与分析
2.1 橡胶树HbGRF基因的克隆和蛋白序列分析
以巴西橡胶树‘热研7-33-97’雌花cDNA为模板,使用特异性引物克隆得到3个片段大小分别为1830、1155、1485 bp的基因。测序后发现这3个基因片段和转录组测序后的序列一致,将这3个基因分别命名为HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3,其登录号分别为：MN396751、MN396752和MN396753。
运用生物信息学方法对巴西橡胶树3个HbGRF基因进行分析,分析结果表明其编码384~609个氨基酸,分子量大小范围为41.188~ 65.663 kDa,等电点为6.09~8.77,蛋白质不稳定指数为51.08~56.06,均为不稳定蛋白,脂肪系数为57.98~69.03,疏水性平均系数范围为-0.541~ -0.582（表2）。对HbGRF蛋白进行亚细胞定位分析,发现GRF蛋白均处在细胞核内,与转录因子的特征相符合。
表2 HbGRF基因蛋白序列组成成分及理化性质分析Tab. 2 Analysis of composition and physicochemical properties of HbGRF gene proteins sequence |
| 名称 Name | 分子式 Molecular formula | 氨基酸Amino acid | 分子量 Molecular weight/kDa | 等电点 pI | 蛋白质不稳定指数 Protein instability index | 脂肪 系数 Fat coefficient | 疏水性 Hydrophobicity | 亚细胞定位 Subcellular localization | 起始密 码子 Start codon | 终止密 码子 Stop codon | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 数值 Value | 评价 Evaluate | ||||||||||
| GRF1 | C2279H3540 N668O745S20 | 609 | 65.663 | 8.48 | 51.08 | 不稳定 | 69.03 | -0.541 | 细胞核 | ATG | TAA |
| GRF2 | C1798H2806 N524O565S12 | 384 | 41.188 | 8.77 | 56.06 | 不稳定 | 62.03 | -0.580 | 细胞核 | ATG | TGA |
| GRF3 | C2279H3540 N668O745S20 | 494 | 52.858 | 6.09 | 51.27 | 不稳定 | 57.98 | -0.582 | 细胞核 | ATG | TAG |
通过Predict Protein在线软件对HbGRF1、HbGRF2、HbGRF3蛋白的二级结构进行预测,结果显示这3个蛋白都含有DNA结合区和多个蛋白结合区域（图1),说明它们可能在转录过程中发挥作用。
图1 橡胶树HbGRF蛋白的二级结构预测红色条带：螺旋结构;蓝色条带：链;黄色条带：隐藏结构;绿色条带：无规律结构;红色小方块：蛋白结合区;黄色小圆圈：DNA结合区;紫色小圆圈：RNA结合区;灰色小圆圈：核苷酸结合区。 Fig. 1 Prediction of secondary structure of HbGRF proteins in H. brasiliensis Red stripe: spiral structure; Blue stripe: chain; Yellow stripe: hidden structure; Green stripe: irregular structure; Red small square: protein binding area; Yellow small circle: DNA binding area; Purple small circle: RNA binding area; Gray small circle: nucleotide binding area. |
2.2 橡胶树HbGRF蛋白的多重比对及进化分析
对HbGRF的蛋白序列和近缘物种如木薯（Manihot esculenta）、可可树（Theobroma cacao）以及麻风树（Jatropha curcas）的GRF蛋白序列进行比对。结果表明,橡胶中的3个HbGRF基因家族成员均含有QLQ和WRC保守结构域,QLQ结构域的序列是QX3LX2Q,WRC结构域的序列是CX9CX10CX2H,在橡胶HbGRF家族的3个成员中,WRC结构域比QLQ结构域更为保守（图2）,表明这3个橡胶树HbGRF蛋白均含有特有的GRF结构域。
进一步选取木薯、可可树、水稻、拟南芥、麻风树等已知的GRF家族基因使用MEGA 6.1软件构建系统进化树。结果显示,在植物中GRF家族基因可以分成5个亚族（Ⅰ~Ⅴ）（图3）。其中橡胶树的HbGRF1、HbGRF2、HbGRF3基因分别属于Ⅰ亚族、Ⅱ亚族、Ⅳ亚族,且HbGRF1与HbGRF3基因亲缘关系略近。
2.3 HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因的物理定位分析
图4 HbGRF1基因在橡胶树‘热研7-33-97’染色体上的原位PCR检测结果与核型分析A：间期细胞;B：前期细胞;C：中期细胞;D：阴性对照;E~F：核型分析;箭头所示为信号位点。 Fig. 4 IS-PCR with HbGRF1 at chromosomes on different phase of mitosis of ‘Reyan 7-33-97’ A: Interphase cell; B: Prometaphase cell; C: Metaphase cell; D: Negative control; E-F: Metaphase cell division and its karyotype; Arrows indicated the signal of HbGRF1. |
图5 HbGRF2基因在橡胶树‘热研7-33-97’染色体上的原位PCR检测结果与核型分析A：间期细胞;B：前期细胞;C：中期细胞;D：阴性对照;E~F：核型分析;箭头所示为信号位点。 Fig. 5 IS-PCR with HbGRF2 at chromosomes on different phase of mitosis of ‘Reyan 7-33-97’ A: Interphase cell; B: Prometaphase cell; C: Metaphase cell; D: Negative control; E-F: Metaphase cell division and its karyotype; Arrows indicated the signal of HbGRF2. |
图6 HbGRF3基因在橡胶树‘热研7-33-97’染色体上的荧光原位杂交检测结果与核型分析A：间期细胞;B：前期细胞;C：中期细胞;D：阴性对照;E~F：核型分析;箭头所示为信号位点。 Fig. 6 FISH with HbGRF3 at chromosomes on different phase of mitosis of ‘Reyan 7-33-97’ A: Interphase cell; B: Prometaphase cell; C: Metaphase cell; D: Negative control; E-F: Metaphase cell division and its karyotype; Arrows indicated the signal of HbGRF3. |
2.4 橡胶树HbGRF基因的表达分析
2.4.1 橡胶树HbGRF基因在不同组织中的表达分析 为进一步研究橡胶树HbGRF基因在生长发育过程中的作用,本研究使用qRT-PCR技术对橡胶树根、茎、茎尖等8个组织或器官中HbGRF基因的相对表达量进行分析。由图8可知,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因在植株8个不同部位中表达量有差异。其中,HbGRF1基因在茎尖、雌花中高调表达,在其他部位表达量较低。HbGRF2和HbGRF3基因在茎尖中显著高调表达,在雌花中的表达量也比别的部位高。由此推测HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因可能参与橡胶树花芽分化及雌花的发育过程。
2.4.2 橡胶树HbGRF基因在不同发育时期花序中的表达分析 对橡胶树HbGRF基因在花蕾期（花序长度约为3 cm）、伸展期（花序长度约为6 cm）、盛花期（花序长度约为9 cm）和开花末期（花序长度约为12 cm）等4个花序发育阶段的表达情况进行分析,结果表明,在伸展期,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因的表达量最高,由此推测HbGRF基因在生长发育较为活跃的部位表达较强（图9）。
2.4.3 橡胶树HbGRF基因在外源激素处理下的表达分析 使用外源赤霉素对橡胶树幼叶进行处理后,HbGRF1和HbGRF2在处理后0.5 h、HbGRF3在处理后6 h时,其表达量最高;使用外源脱落酸处理时发现,3个基因均在处理后0.5 h时,表达量达到了最高值。当2种外源激素处理后48 h时,3个基因的表达量和初始条件下的表达量基本相同（图10）。
3 讨论
GRF基因家族是一类成员数目较多的转录因子家族,该转录因子对植物的生长发育过程具有重要的调控作用。目前,GRF基因家族在水稻、拟南芥、杨树、番茄、陆地棉、油菜、烟草、桃树、茶树、藜麦等多种植物中已有研究,但对于具有重要战略意义的橡胶树GRF基因的相关研究仍缺乏进一步的报道。本研究从橡胶树中克隆到3个HbGRF基因,首先对其进行生物信息学与表达模式等分析,再使用原位PCR技术和荧光原位杂交技术对基因进行了物理定位分析,试图从分子生物学及细胞学的角度对功能基因进行较为全面的研究。
伴随基因组测序技术的发展与完善,Livak等[29]对橡胶树‘热研7-33-97’的全基因组进行了测序,这对橡胶树基因家族的分析与鉴定、功能基因的挖掘与研究都提供了很多便利,预测了43 792个蛋白编码基因,其中包括7个预测的橡胶树GRF基因,较为符合一般植物中GRF基因家族含有8~20个成员的规律。本研究根据拟南芥GRF的2个保守序列QLQ和WRC,在橡胶数据库搜索到7个基团,然后设计引物,以橡胶树总cDNA为模板进行扩增,结果显示,只扩增出3个基因,推测可能是其他基因的丰度比较低等原因造成。将本研究中扩增的3个HbGRF基因和预测的7个橡胶树GRF基因的序列比对,结果发现HbGRF1配对序列的一致性为99.84%,其余均完全比对,说明该比对结果与Tang等[30]的预测结果一致。
对3个HbGRF基因的氨基酸序列进行分析,结果发现3个成员均含有QLQ和WRC 2个保守结构域,且WRC结构域的特异性较高,这与藜麦、茶树等植物中的研究相一致。对橡胶树与其他植物GRF的系统进化分析表明,可将GRF分为5个亚族,其中HbGRF1与MeGRF1、HbGRF2与JcGRF3、HbGRF3与AtGRF8亲缘关系较近,基因之间的亲缘关系越接近,其功能可能也越类似。如拟南芥中的AtGRF8基因在花的发育中具有重要的调控作用,尤其是在花器官发育后期。HbGRF3基因在橡胶树雌花中的表达量相对较高,由此推测橡胶树HbGRF3基因在花的发育过程中起重要的调控作用。
前人研究结果表明,GRF基因家族的成员在发育活跃的器官或组织中表达量较高,在成熟的组织或器官中表达量相对较低。在茶树中CsGRF在生长比较旺盛的组织尤其是芽叶中起到了重要的调控作用[15]。在油菜中BnGRF可调控花器官的发育[31]。本研究对3个HbGRF基因在不同部位的表达情况分析发现,它们在茎尖及雌花中的表达量相对较高,推测这3个基因参与了调控橡胶树花芽分化以及雌花发育的过程。对HbGRF在花序不同发育时期的表达量进行分析发现,其在伸展期表达量最高,符合GRF转录因子的特点,但在开花末期,3个基因的表达量也相对较高,出现这一现象的原因及机制尚不明确,需要进行更深入的研究。在实际生产实践过程中,橡胶树座果率较低,一般为5%~8%,最高不超过10%,这是橡胶树常规育种工作效率较低的原因之一。赤霉素信号途径在调控植物株高、开花方面有着重要的作用,脱落酸信号途径在植物多种生理反应及基因的胁迫应答方面具有重要的调控作用。前人的研究发现,苹果树MdGRF基因可能在外源激素作用下调控苹果树的生长,在调控嫁接到矮化砧木上接穗的生长以及2个品种节间伸长等过程中有着重要的作用[32]。本研究用外源赤霉素和外源脱落酸对橡胶树进行处理后发现,其表达量在处理后0.5~6 h内达到最高,在外源激素处理后48 h时,3个基因的表达量回落到初始水平,表明HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3受赤霉素和脱落酸处理的调控。
基因定位的结果表明,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3定位在3条不同的染色体上,它们之间可能相互独立,结合本课题组已报道的橡胶树其他功能基因的定位结果可以得知,HbGRF1与OVP-10390[33]、Hevb7[34]同时位于第11号染色体上;HbGRF2与HbMyb1[35]、HbN1N1[36]、HbNAC1[37]、HbPEPRK2[24]、HblMAC4[38]同时位于第5号染色体上;HbGRF3与HbCPT[39]、HbJAZ5[40]、HbNAC3[37]、HblMYC2、HblMYC5[38]、HbWRKY1、HbWRKY4、HbWRKY5[41]同时位于第9号染色体上。这些定位在相同染色体上的基因间可能存在互为连锁的关系。研究功能基因之间的相互关系对了解这些基因间可能存在的遗传关系提供了帮助,这些结果可以为橡胶树精准育种设计提供理论指导。