白菜<i>BcSOTs</i>的序列特征及在害虫胁迫下的表达模式分析

蔡九琦; 郭二彪; 余芳洁; 施沁钰; 郁有健

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.007

热带作物学报 >

2021 , Vol. 42 >Issue 3: 667 - 674

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.007

组学与生物技术

白菜BcSOTs的序列特征及在害虫胁迫下的表达模式分析

蔡九琦 ¹ ,
郭二彪 ² ,
余芳洁 ¹ ,
施沁钰 ¹ ,
郁有健 ^,¹^,^*

展开

1.浙江农林大学农业与食品科学学院/浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室/浙江农林大学生物种业研究中心,浙江杭州 311300
2.山西农业大学园艺学院,山西太谷 030800

*郁有健,E-mail：yjyu@zafu.edu.cn

蔡九琦（1999—）,男,本科生,研究方向：植物品质调控与分子生物学。

收稿日期: 2020-05-19

要求修回日期: 2020-06-18

网络出版日期: 2021-03-25

基金资助

国家自然科学基金面上项目(31572115)

浙江省自然科学基金重点项目(LZ14C150001)

浙江农林大学大学生科研训练项目(113-2013200098)

版权

收起

Analysis of the Sequence Characteristics of BcSOTs and the Expression Pattern under Pests Stress in Brassica campestris

CAI Jiuqi ¹ ,
GUO Erbiao ² ,
YU Fangjie ¹ ,
SHI Qinyu ¹ ,
YU Youjian ^,¹^,^*

Expand

1. College of Agriculture and Food Science, Zhejiang Agriculture and Forestry University / Zhejiang Provincial Key Laboratory of Agricultural Product Quality Improvement Technology / Biological Seed Research Center, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Hangzhou, Zhejiang 311300, China
2. College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030800, China

*YU Youjian,E-mail：yjyu@zafu.edu.cn

Received date: 2020-05-19

Request revised date: 2020-06-18

Online published: 2021-03-25

Copyright

Fold

摘要

对白菜硫苷合成相关BcSOTs的序列结构及在害虫取食胁迫下的表达模式进行综合分析,解析其序列结构特征及在抵御害虫胁迫过程中表达模式的异同,为利用基因工程技术调控植物体内硫苷组分和含量及培育高品质白菜品种提供理论依据。在白菜基因组数据库中获得硫苷合成相关的13个BcSOTs的DNA、CDS和氨基酸序列,利用GSDS、NPSA-prabi、Swiss-Pdb Viewer进行序列结构分析,利用PlantCARE对启动子序列进行分析。以白菜‘绿野黑油筒’为材料,利用荧光定量PCR的方法分析8叶期植株叶片中13个BcSOTs在甜菜夜蛾三龄幼虫取食胁迫1、24、48、72 h后的表达模式。13个BcSOTs的核苷酸序列长度相似,除Bra015935的序列仅含有561个核苷酸且明显短于其他12个基因以外,其余基因的序列长度为951~1107 bp;13个BcSOTs在蛋白二级结构上具有高度相似性,主要以α-螺旋、无规卷曲、延伸链和β-转角为主,其中11个（Bra008132、Bra015936、Bra015938、Bra003817、Bra027623、Bra003726、Bra003818、Bra027880、Bra031476、Bra027117、Bra025668）的二级结构中无规卷曲所占的比例最大,2个（Bra015935、Bra027118）α螺旋所占比例最高,除Bra015935、Bra003726外,其他成员所编码蛋白的三级结构也都具有高度相似性;13个BcSOTs的启动子序列中含有大量与逆境胁迫响应和生长发育相关的顺式调控元件,Bra008132、Bra027117和Bra025668三个BcSOTs还分别含有与叶肉细胞分化响应、种子形态发育调控和细胞周期调控相关的一些元件;13个BcSOTs的表达量在白菜受到害虫胁迫不同时间后均出现升高,其中3个BcSOTs（Bra015936、Bra027623、Bra003726）的相对表达量随着取食时间的延长呈现逐渐升高的趋势,其他10个BcSOTs随着取食胁迫时间的延长表达模式变化的趋势有所不同。白菜硫苷合成相关的13个BcSOTs在核苷酸和蛋白序列上具有高度保守性,在不同程度上参与了抵御害虫胁迫的这一抗逆过程,Bra015936、Bra027623和Bra003726这3个成员在这一抗逆过程中可能起着更加重要的作用。研究结果将为进一步深入解析白菜硫苷合成关键SOT基因的生物学功能提供重要的数据支撑,进而为利用基因工程技术调控植物体内硫苷组分和含量以及高品质白菜育种奠定理论基础。

关键词： 白菜; 硫苷; 磺基转移酶; BcSOTs基因

本文引用格式

蔡九琦 , 郭二彪 , 余芳洁 , 施沁钰 , 郁有健 . 白菜BcSOTs的序列特征及在害虫胁迫下的表达模式分析[J]. 热带作物学报, 2021 , 42(3) : 667 -674 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.007

Abstract

This study comprehensively analyzed the sequence structure and expression patterns under insect eating stress of BcSOTs related to glucosinolate synthesis in Brassica campestris aimed to reveal the sequence structural characteristics and the similarities and differences in expression patterns during the resistance to pest stress and lay a theoretical foundation for the use of genetic engineering technology to regulate the glucosinolate composition and content in plants and to cultivate high quality varieties. The DNA, CDS and amino acid sequences of 13 BcSOTs related to the synthesis of glucosinolate were obtained from the genomic database of B. campestris. The sequence structure of the 13 BcSOTs was analyzed by GSDS, NPSA-prabi and Swiss-Pdb Viewer, and the promoter sequences were analyzed by PlantCARE. Using ‘lvyeheiyoutong’ as the material, the expression pattern of the 13 BcSOTs were analyzed by qRT-PCR in the leaves of the eighth-leaf stage plants after feeding by the third instar larvae of Spodoptera exigua at different time points (1, 24, 48, 72 h). The nucleotide sequences of the 13 BcSOTs were similar in length, except that the sequence of Bra015935 contained only 561 nucleotides and was significantly shorter than that of the other 12 genes, and the sequence length of which was between 951 bp and 1107 bp. They were also highly similar in protein structure, which were mainly composed by alpha helix, random coil, extended strand and beta turn. Among them, Bra008132, Bra015936, Bra015938, Bra003817, Bra027623, Bra003726, Bra003818, Bra027880, Bra031476, Bra027117 and Bra025668 had the largest proportion of random coil, and alpha helixes had the highest proportion in Bra015935 and Bra027118. Except for Bra015935 and Bra003726, the tertiary structure of the proteins encoded by other members were also highly similar. The promoter sequences of the 13 BcSOTs contained a large number of cis-regulatory elements related to stress response and development. Three BcSOTs (Bra008132, Bra027117, and Bra025668) also contained cis-regulatory elements related to mesophyll cell differentiation, seed morphological development regulation, and cell cycle regulation. The expression level of the 13 BcSOTs increased after the plants were subjected to pest stress at different time points. The relative expression levels of 3 BcSOTs (Bra015936, Bra027623, Bra003726) had gradually increased with the increase of feeding time, and the expression patterns of the other 10 BcSOTs changed with the increase of insect stress. 13 BcSOTs related to glucosinolate synthesis in B. campestris were highly conserved in nucleotide and protein sequences. They all participated in the resistance process to pest to varying degrees in the leaves of B. campestris. Bra015936, Bra027623 and Bra003726 may play a more important role in this resistance process. The research results would provide important data for further analysis of the biological function of key SOT genes in the glucosinolate synthesis in B. campestris, and lay a theoretical foundation for the use of genetic engineering technology to regulate the content and composition of glucosinolates in plants and the breeding of high-quality varieties of B. campestris.

Key words： Brassica campestris; glucosinolates; sulfotransferases; BcSOTs gene

白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）又名普通白菜、青菜、油菜,是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种,含有丰富的营养物质,如各种矿物质、抗氧化物质和硫代葡萄糖苷等,是我国重要的传统蔬菜^[1,2]。植物在进化过程中为了适应各种生物和非生物胁迫,形成了各种应对胁迫的防御机制,产生了多种应对环境变化或胁迫的代谢产物^[3]。硫代葡萄糖苷（glucosinolates, GS）简称硫苷,又称芥子油苷,是十字花科植物中一类重要的次生代谢产物。硫苷的合成包括从氨基酸侧链的延伸到醛肟的生成,再经过氧化、裂解和硫酸化等一系列复杂步骤,根据其侧链氨基酸的来源不同,可分为三大类：脂肪族硫苷、芳香族硫苷及吲哚族硫苷,所有硫苷都具有由β-D-硫代葡萄糖基和磺酸肟形成的核心结构^[4]。硫苷富含硫,其水解产物为芸薹属蔬菜的特殊风味做出重要贡献^[5];当十字花科植物组织受损时,芥子酶会水解硫苷产生各种具有不同生物活性的降解产物如异硫氰酸酯、腈类、硫氰酸盐等,具有很多重要的生物活性^[6]。萝卜硫苷降解产生的萝卜硫素,可有效诱导小鼠肝癌细胞II期解毒酶,同时显著降低乳腺肿瘤的发生概率,减缓肿瘤的发生和扩散,具有很强的抗癌性^[7];吲哚族硫苷降解产物的衍生物吲哚-3-甲醇可通过磷酸化p53蛋白的第15个丝氨酸使癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期和Fas死亡受体诱导细胞凋亡蛋白酶-8介导的细胞凋亡2条途径产生较强的抗癌效应^[8];此外,苯乙基异硫氰酸盐目前被证明是肺癌癌细胞被激活的一种非常有效的抑制因子,并且已经被开发成了一种化学防癌剂^[9]。因此,分析与白菜硫苷合成相关BcSOTs基因的序列结构及害虫取食胁迫下的表达模式,对利用基因工程技术调控植物体内硫苷组分和含量以及培育高品质白菜具有重要意义。磺基转移酶（sulfotransferases, SOT）对于硫苷核心结构的形成具有重要作用,可催化共底物3ʹ-磷酸腺苷-5ʹ-磷酰硫酸上硫酸基团的转移,从而将无硫硫苷转化形成硫苷^[10]。已有研究表明磺基转移酶与抗病相关,在马氏珠母贝中磺基转移酶PmCHST9和PmCHST11编码的蛋白通过磺酸化反应,合成硫酸软骨素来调节马氏珠母贝的免疫系统^[11,12]。近几年,在水稻中的研究发现,白叶枯病菌可以诱导磺基转移酶的表达,并对所编码蛋白的功能进行了一定的研究^[13]。菜心在被小菜蛾取食胁迫后经转录测序发现,编码磺基转移酶的基因表达发生上调,说明编码磺基转移酶基因的表达受到昆虫取食胁迫的诱导,可能参与了植物的抗虫反应^[14]。目前,在白菜中已经发现了13种硫苷合成相关的SOT蛋白,其中BcSOT16、BcSOT17和BcSOT18参与了无硫硫苷的硫化过程^[15]。在竞争的情况下,AtSOT16更喜欢以由色氨酸和苯丙氨酸合成而来的dsGSs为催化底物,而由甲硫氨酸衍生而来的长链dsGSs是AtSOT17和AtSOT18的首选底物^[16]。此外,通过对甘蓝型油菜（Brassica napus L.）中的一些SOT蛋白进行研究,发现其催化功能具有底物特异性,且植株生理状态会对它们的表达模式产生重要影响^[17]。在白菜基因组进化过程中,与硫苷合成相关的SOT基因经过基因组三倍化后的大量复制、转座和串联重复等进化事件,最终产生和保留了13个成员,一些研究人员此前也对BcSOTs的序列、染色体定位和进化进行了初步的研究,但是对其序列结构和生物逆境胁迫下的表达模式尚无深入的分析和研究^{[15, 18]}。针对白菜中硫苷合成相关的13个SOT基因,采用GSDS、NPSA-prabi、Swiss-Pdb Viewer、PlantCARE深入分析其基因序列、结构、启动子元件,采用荧光定量解析BcSOTs在小白菜响应害虫胁迫过程中的表达模式。研究结果能够为深入解析白菜硫苷合成相关SOT基因的生物学功能提供重要的数据支撑,从而为利用基因工程技术调控植物体内硫苷组分和含量以及培育高品质小白菜品种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料和培养条件

试验所用白菜品种为‘绿野黑油筒’,购自宁波市江东绿野蔬菜种子有限公司,甜菜夜蛾三龄幼虫由浙江农林大学农业与食品科学学院植物保护学科刘亚慧课题组提供。将白菜置于光照培养箱中培养,光周期为14 h/10 h（光照/黑暗）,培养温度为28 ℃/26 ℃（白天/黑夜）,光照强度为200 µmol/(m²·s)。害虫取食胁迫下叶片中硫苷代谢相关BcSOTs的表达分析所用材料的取样方法为：选取长势一致的八叶期植株进行接虫处理,先将甜菜夜蛾三龄幼虫饥饿处理4 h,选取第5、6片真叶进行接虫,每片叶接虫1头,用网袋将叶片套住,利用棉花塞住袋口防止虫逃逸,整个接虫过程防止植株损伤,对照株做同样的套袋处理,培养条件相同;分别在接虫后1、24、48、72 h进行取样,每个时间点随机选取3株植株取食后的叶片作为1次生物学重复,用酒精棉将接虫后的叶片擦拭干净,去除主脉后剪碎,液氮中速冻,于-80 ℃冰箱中保存备用。

**1.2 白菜硫苷合成相关BcSOTs序列特征分析**

根据Wang等^[15]的研究结果,从白菜基因组数据库（http://brassicadb.org/brad/BRDA）中获得白菜硫苷合成相关的13个BcSOTs的DNA、CDS和氨基酸序列,利用GSDS（http://gsds.cbi.pku. edu.cn/index.php）分析内含子和外显子的结构与相位,采用NPSA-MLRC（http://npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat. pl?page=/NPSA/npsa_mlrc. html）、Swiss-PdbViewer（https://swissmodel.expasy. org/）预测蛋白二级结构和三级结构。

**1.3 白菜硫苷合成相关BcSOTs启动子序列分析**

根据13个白菜硫苷合成相关BcSOTs的编码序列,从白菜数据库BRAD中获得各BcSOTs编码序列的起始密码子（ATG）上游2 kb的核苷酸序列作为启动子序列,利用PlantCare软件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对其所含有的顺式作用元件进行预测和分析。

**1.4 白菜硫苷合成相关BcSOTs的表达分析**

采用Trizol法提取各材料总RNA,参照反转录试剂盒（SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit, TaKaRa）的说明书进行RNA反转录。以反转录获得的cDNA为模板,根据基因CDS序列的非保守区,利用Primer Premier 5软件设计基因特异的qRT- PCR引物（表1）,以白菜BrUBC10基因作为内参基因,采用定量试剂盒（SYBR Premix Ex Taq, TaKaRa）在CFX96 Real Time System（Bio-Rad, France）仪器上进行qRT-PCR分析。扩增体系为：10 μL 2×SYBR Premix Ex-Taq^TM,3 μL cDNA（10 ng/μL）,上下游引物各0.3 μL,补足ddH₂O至15 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s;60 ℃复性34 s;共40个循环。按照2^-ΔΔCT的方法进行定量数据的处理^[19],琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。

表1 实时荧光定量PCR表达分析引物序列

Tab. 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis

基因编号Gene code	上游引物（5°-3°）Forward primers (5°-3°)	下游引物（5°-3°）Reverse primers (5°-3°)
Bra008132	ATGTGTTGGGTTACTGGAAGG	CTCTTCCTCAGCACTAAACCC
Bra015935	TCTCAAGAGGGTCAGCAGC	GCCTTCCAGTAACCCAACA
Bra015936	CGCTGATTCTTTGCCTTATGTG	CAACATCTCGAAGCTGCAAAG
Bra015938	GTTGTGGATCTTTGCAGCTTC	CGACCAATCTCCAACCTTACC
Bra003817	ACGATTCCACGAACCCTCT	AGAACATCAATGTGAGGGA
Bra027623	CTCTATCGTTTTGCTTCTAATG	TTACGGTTTCTGTTGCCATT
Bra003726	TTCTACTTGGCTCAAATCAC	AGAACATCAATGTGAGGGA
Bra003818	TACCACTTGGCTCAAATCA	AGACCATCAACTTCAGGGA
Bra027880	CCCAATCTCATCTGTCCAAA	CTTATTCTTCCCAAACTCTGTCT
Bra027118	CGTTCATCGGGTACTGTGGT	GTGGTGCCTGACTTTGGGTA
Bra031476	GACCATTCCTCAAACCCTCTC	CGGGATATGAGTCGAGAAAAGAG
Bra027117	AGCACGACCCATTGACTTC	TTGAGAGGGTTTGAGGATTGG
Bra025668	CGTGGCTCAAGGCACTAAA	ACTCGTGAGGGTTGCGTTT
BrUBC10	GGGTCCTACAGACAGTCCTTAC	ATGGAACACCTTCGTCCTAAA

2 结果与分析

2.1 白菜硫苷合成相关SOT基因序列特征分析

基因结构分析表明（图1）,13个白菜硫苷合成相关SOT基因都具有非常相似的基因结构,除了Bra003726在89 bp处有一个122 bp长度的内含子和Bra003817在472 bp处有一段75 bp的内含子外,其余11个基因都没有内含子。Bra015935的序列仅含有561个核苷酸,明显短于其他12个基因的序列长度,其余基因的序列长度为951~1107 bp。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图1 白菜硫苷合成相关SOT基因的结构分析

Fig. 1 Gene structure anaylsis of glucosinolate biosynthesis related BcSOTs

由表2可知,13个白菜硫苷合成相关SOT的二级结构主要以α-螺旋、无规卷曲、延伸链和β-转角为主,而且各组成部分所占的比例也具有一定相似性,其中11个基因（Bra008132 、Bra015936、Bra015938、Bra003817、Bra027623、Bra003726、Bra003818、Bra027880、Bra031476、Bra027117、Bra025668）二级结构组成中以无规卷曲占比最高,2个基因（Bra015935、Bra027118）的二级结构组成中以α-螺旋占比最高;除Bra015935、Bra003726外,其他成员所编码蛋白的三级结构都具有高度相似性（图2）。

表2 白菜硫苷合成相关SOT二级结构分析

Tab. 2 Secondary structural prediction of glucosinolate biosynthesis related BcSOTs

蛋白编号 Protein code	α-螺旋 Alpha helix/%	延伸链 Extended strand/%	β-转角 Beta turn/%	无规卷曲 Random coil/%
Bra008132	40.71	11.21	4.72	43.36
Bra015935	51.08	10.75	6.99	31.18
Bra015936	37.28	10.98	4.91	46.82
Bra015938	40.70	12.50	4.94	41.86
Bra003817	41.80	9.29	4.95	43.96
Bra027623	38.07	10.80	4.26	46.88
Bra003726	41.03	11.72	4.83	42.41
Bra003818	38.37	12.50	4.36	44.77
Bra027880	42.18	9.73	4.13	43.95
Bra027118	42.93	10.87	4.62	41.58
Bra031476	39.56	11.08	5.70	43.67
Bra027117	40.40	12.71	5.08	41.81
Bra025668	39.47	12.17	5.34	43.03

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图2 白菜硫苷合成相关SOT的三维结构模型分析

Fig. 2 Three-dimensional protein structure models of glucosinolate biosynthesis related BcSOTs

2.2 白菜硫苷合成相关SOT基因启动子顺式作用元件分析

利用在线数据分析工具PlantCARE对13个硫苷合成相关SOT基因的启动子序列进行分析,结果表明在这13个基因的上游2 kb序列中,与生长发育调控响应相关的顺式作用元件主要涉及分生组织的发育、胚乳发育、生理周期调控和蛋白质代谢等方面;与逆境胁迫响应相关的顺式作用元件种类较多,包含高低温胁迫、干旱胁迫、厌氧诱导和机械损伤胁迫等;存在生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等多种植物激素响应相关的顺式作用元件。进一步对这些顺式作用元件的种类与数量进行分析表明,在13个硫苷合成相关SOT基因的启动子序列中,与逆境胁迫响应相关的顺式作用元件要明显多于与生长发育调控响应相关的顺式作用元件。此外,Bra008132、Bra027117和Bra025668三个BcSOTs还分别含有与叶肉细胞分化响应、种子形态发育调控和细胞周期调控相关的一些元件（表3,表4）。

表3 白菜硫苷合成相关SOT基因启动子顺式作用元件

Tab. 3 Putative cis-elements identified in promoter sequences of glucosinolate biosynthesis related BcSOTs

基因编号 Gene code	生长发育相关顺式作用元件 Development related cis-elements	逆境胁迫相关顺式作用元件 Stress related cis-elements
Bra008132	5UTR Py-rich stretch、HD-Zip 1、HD-Zip 2、O2-site、Skn-1_motif⁴	ABRE²、ARE²、AuxRR-core、Box-W1、CAAT-box³⁰、HSE、LTR、P-box、TC-rich repeats、TCA-element
Bra015935	CCGTCC-box、O2-site、Skn-1_motif³	ARE、Box-W1、TCA-element
Bra015936	CAT-box、O2-site、Skn-1_motif⁵、circadian	ABRE²、ARE²、GARE-motif²、MBS²、P-box、TC-rich repeats²、TCA-element
Bra015938	Skn-1_motif²、circadian²	ABRE²、ARE²、CGTCA-motif²、TC-rich repeats、TGA-element、TGACG-motif、WUN-motif
Bra003817	CAT-box、O2-site、Skn-1_motif²、Circadian³	ABRE²、ARE²、CGTCA-motif、GARE-motif²、P-box、TCA-element²、TGA-element²、TGACG-motif
Bra027623	Skn-1_motif、Circadian³	ABRE、ARE²、AuxRR-core、Box-W1、HSE⁵、P-box、TATC-box、TC-rich repeats⁴
Bra003726	GCN4_motif、Skn-1_motif⁴	ARE²、AuxRR-core、CGTCA-motif、GARE-motif²、HSE、MBS³、TC-rich repeats、TGA-element²、TGACG-motif、circadian²
Bra003818	O2-site、Skn-1_motif⁶、GCN4_motif、circadian²	ABRE、ARE³、CGTCA-motif、MBS、P-box、TCA-element、TGACG-motif
Bra027880	Skn-1_motif⁴、circadian	ABRE、ARE、CGTCA-motif⁵、HSE⁴、HSE⁴、MBS、TC-rich repeats、TCA-element、TGA-element、TGACG-motif⁵
Bra027118	CCGTCC-box、circadian	ARE²、AuxRR-core、CGTCA-motif、MBS³、P-box²、TC-rich repeats⁴、TCA-element、TGACG-motif
Bra031476	CAT-box、CCGTCC-box、Skn-1_motif³、Circadian	ABRE³、CE3、MBS、TC-rich repeats、TCA-element
Bra027117	O2-site、RY-element²、Skn-1_motif²、Circadian⁴	ABRE、ARE、GARE-motif、HSE⁴、MBS、TCA-element³、TCA-element³、WUN-motif
Bra025668	GCN4_motif²、MSA-like²、Skn-1_motif³	ARE⁵、CGTCA-motif⁴、GARE-motif、HSE、LTR、MBS²、TGA-element、TGACG-motif⁴

	注：各元件右上角数值代表顺式作用元件的个数,无数值代表该顺式元件只有1个。
	Note: The number in the upper right corner of each component represents the number of the cis-acting components, and no number means that there is only one cis-component.

表4 白菜硫苷合成相关SOT基因启动子序列中存在的重要顺式作用元件

Tab. 4 Putative cis-acting regulatory elements in the promoter sequence of the BcSOTs related to glucosinolates synthesis

顺式作用元件Cis-acting elements	功能Function
HD-Zip 2	element involved in the control of leaf morphology development
Skn-1_motif	cis-acting regulatory element required for endosperm expression
CCGTCC-box/CAT-box	cis-acting regulatory element related to meristem specific activation
circadian	cis-acting regulatory element involved in circadian control
GCN4_motif	cis-regulatory element involved in endosperm expression
HD-Zip 1	element involved in differentiation of the palisade mesophyll cells
RY-element	cis-acting regulatory element involved in seed-specific regulation
MSA-like	cis-acting element involved in cell cycle regulation
P-box/GARE-motif	gibberellin-responsive element
AuxRR-core	cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness
ABRE	cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
TCA-element	cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness
CGTCA-moti/TGACG-motif	cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
CE3	cis-acting element involved in ABA and VP1 responsiveness
TC-rich repeats	cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
ARE	cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
WUN-motif	wound-responsive element
LTR	cis-acting element involved in low-temperature responsiveness
Box-W1	fungal elicitor responsive element
HSE	cis-acting element involved in heat stress responsiveness

2.3 害虫胁迫后白菜硫苷合成相关SOT基因的表达分析

为明确白菜硫苷合成相关的SOT基因在白菜抵御害虫胁迫过程中的功能,本研究进一步利用qRT-PCR技术对甜菜夜蛾取食不同时间（1、24、48、72 h）后叶片中BcSOTs的相对表达量进行了分析,结果表明在受到取食胁迫后BcSOTs出现明显的差异表达,但是随着取食胁迫时间的延长,它们表达水平变化的趋势有所不同（图3）,主要可以分为5类,其中：

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT

图3 甜菜夜蛾取食后白菜SOT基因的相对表达量分析

Fig. 3 Relative expression analysis of BcSOTs analyzed by qRT-PCR upon feeding by Spodoptera exigua in B. campestris

A类：3个BcSOTs（Bra015936、Bra027623、Bra003726）的相对表达量随着取食时间的延长呈现逐渐升高的趋势;B类：4个BcSOTs（Bra015935、Bra015938、Bra027118、Bra025668）的相对表达量随着取食时间的延长呈现先上升后下降的趋势;C类：1个BcSOT（Bra003817）的相对表达量随着取食时间的延长呈现先下降后上升的趋势;D类：2个BcSOTs（Bra031476、Bra027117）的相对表达量随着取食时间的延长呈现先上升后下降再上升的趋势;E类：2个BcSOTs（Bra008132、Bra027880）的相对表达量随着取食时间的延长呈现先下降后上升再下降的趋势。

此外,在害虫取食胁迫时间延长后,除了Bra027118、Bra015938和Bra027880在甜菜夜蛾取食72 h后的相对表达量低于对照外,其他基因的相对表达量都高于对照。

3 讨论

白菜在进化过程中,与硫苷合成相关的SOT基因产生了大量的复制和串联重复等事件,共含有多达13个BcSOTs^[15]。本研究对白菜硫苷合成相关SOT进行序列结构分析发现,除了Bra003817和Bra003726含有内含子外,其余的SOT基因都没有内含子,Dantas-Santos等^[20]和Hashiguchi等^[21]也发现拟南芥和海藻中与硫苷合成相关的SOT基因中没有内含子,因此一般情况下与硫苷合成相关的SOT基因可能不含有内含子,而Bra003817和Bra003726含有内含子可能与白菜进化有关,更有利于白菜对抗病虫的伤害。二级结构与三级结构分析表明白菜硫苷合成相关的SOT蛋白在结构上相似性较高,只有Bra015935二级结构中的无规卷曲明显少于其他成员。Bra015935和Bra003726的三级结构也与其他成员有很大不同,说明Bra015935和Bra003726 可能在白菜发育过程中的硫苷代谢中具有与其他成员不同的生物学功能。值得注意的是Bra015935的序列显著短于其他成员,且蛋白三级结构也有很大差异,因此该基因是否还具有磺基转移酶的完整功能、在进化过程中是否产生了新功能化或亚功能化,这些都需要进一步对其生物学功能进行深入研究。

Castillo-davis等^[22]研究表明大部分蛋白在亲缘关系较远的物种间仍然存在明显的保守性,因此其调控序列可能在高等多细胞生物的形态多样性的形成中起到非常重要的作用。分析功能基因启动子序列中顺式调控元件的组成及差异,对于研究功能基因在植物受害虫胁迫后所扮演的角色具有重要意义。本研究对白菜硫苷合成相关SOT基因的启动子序列分析表明,绝大多数SOT基因的启动子序列中与胁迫相关的顺式作用元件均多于与发育相关的顺式作用元件,说明其可能在白菜不同发育时期中更多地参与硫苷介导的一些抵御逆境胁迫的过程中发挥着重要作用。此外,Bra008132启动子序列中还包含了与叶肉细胞分化相关的元件,因此可能在叶片受到胁迫时会表现出不同于其他基因的响应模式;Bra027117还包含与种子形态发育相关的调控元件,该基因的表达异常可能会影响种子的形态与正常发育过程;Bra025668还包含与细胞周期相关的元件,可能会受到参与细胞周期调控的一系列蛋白的调控。

甜菜夜蛾属鳞翅目夜蛾科,是一种杂食性害虫,以幼虫取食叶片或钻蛀大白菜菜心等方式危害白菜类蔬菜作物的栽培与生产,是十字花科蔬菜作物的重要害虫之一^[23]。研究表明,拟南芥在被甜菜夜蛾取食后,能够引起其自身吲哚族硫苷和脂肪族硫苷含量的上升^[24]。本研究对8叶期的白菜进行甜菜夜蛾接虫处理,对处理后叶片中硫苷合成相关SOT基因的表达模式分析表明,尽管取食胁迫不同时间后的表达量升高的程度有所不同,但表达模式均出现显著升高的趋势,说明BcSOTs在抵御甜菜夜蛾幼虫的取食胁迫中起到了重要作用。Bra008132、Bra003817、Bra027880等7个BcSOTs在害虫取食胁迫1 h后表达含量明显高于对照,说明它们的表达受到了白菜响应甜菜夜蛾取食胁迫的调控因子的应激调控,在很短的时间内表达模式出现显著升高以尽快提高相应硫苷的合成速率来抵御该生物胁迫。Bra031476、Bra025668和Bra003726分别只在取食胁迫24、48、72 h后呈显著性表达来抵御生物胁迫,说明白菜硫苷合成相关SOT基因的表达具有时序性和一定的专一性,这可能是由于白菜特有的生理及防御机制决定的,也可能与茉莉酸、水杨酸等抵御环境生物胁迫相关植物激素的不同调控机制有关。

BcSOTs在核苷酸和蛋白序列上具有高度保守性,qRT-PCR分析结果表明BcSOTs在不同程度上参与了白菜抵御害虫胁迫的这一抗逆过程,Bra015936、Bra027623和Bra003726这3个成员在这一抗逆过程中起着相对更加重要的作用。研究结果将为进一步深入解析白菜硫苷合成关键SOT基因的生物学功能提供重要的数据支撑,进而为利用基因工程技术调控植物体内硫苷组分和含量以及高品质白菜育种奠定理论基础。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

[1]	胡天华, 包崇来, 胡海娇, 等. 白菜浙青5号的选育及应用[J]. 浙江农业科学, 2019,60(9):1563-1565.

[2]	Hanson P, Yang R Y, Chang L C, et al. Contents of carotenoids, ascorbic acid, minerals and total glucosinolates in leafy Brassica pakchoi (Brassica rapa L. chinensis) as affected by season and variety[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009,89(5):906-914.

[3]	Kliebenstein D J, Osbourn A. Making new molecules-evolution of pathways for novel metabolites in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2012,15(4):415-423. PMID

[4]	Sønderby I E, Geu-Flores F, Halkier B A. Biosynjournal of glucosinolates - gene discovery and beyond[J]. Trends in Plant Science, 2010,15(5):283-290. PMID

[5]	Schonhof I, Krumbein A, Brückner B. Genotypic effects on glucosinolates and sensory properties of broccoli and cauliflower[J]. Nahrung, 2004,48(1):25-33. PMID

[6]	Bones A M, Rossiter J T. The enzymic and chemically induced decomposition of glucosinolates[J]. Phytochemistry, 2006,67(11):1053-1067. PMID

[7]	Keck A S, Finley J W. Cruciferous vegetables: cancer protective mechanisms of glucosinolate hydrolysis products and selenium[J]. Integrative Cancer Therapies, 2004,3(1):5-12. PMID

[8]	Choi H S, Cho M C, Lee H G, et al. Indole-3-carbinol induces apoptosis through p53 and activation of caspase-8 pathway in lung cancer A549 cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010,48(3):883-890. PMID

[9]	Nakajima M, Yoshida R, Shimada N, et al. Inhibition and inactivation of human cytochrome P450 isoforms by phenethyl isothiocyanate[J]. Drug Metabolism & Disposition, 2001,29(8):1110-1113. PMID

[10]	Glendening T M, Poulton J E. Partial purification and characterization of a 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate: Desulfoglucosinolate sulfotransferase from cress (Lepidium sativum)[J]. Plant Physiology, 1990,94(2):811-818. PMID

[11]	郝瑞娟, 郑哲, 王庆恒, 等. 马氏珠母贝磺基转移酶PmCHST9基因的分子特征与表达分析[J]. 基因组学与应用生物学, 2015,34(11):2387-2394.

[12]	李琛, 郝瑞娟, 王庆恒, 等. 马氏珠母贝磺基转移酶基因PmCHST11基因的分子特征与表达分析[J], 基因组学与应用生物学, 2017,36(1):150-157.

[13]	李珍珍. 水稻白叶枯病菌磺基转移酶RaxST的活性分析[D]. 金华: 浙江师范大学, 2014.

[14]	黄家保. 小菜蛾取食诱导的菜心mRNA表达谱及差异表达基因克隆[D]. 福州: 福建农林大学, 2010.

[15]	Wang H, Wu J, Sun S L, et al. Glucosinolate biosynthetic genes in Brassica rapa[J]. Gene, 2011,487(2):135-142. PMID

[16]	Piotrowski M, Schemenewitz A, Lopukhina A, et al. Desulfoglucosinolate sulfotransferases from Arabidopsis thaliana catalyze the final step in the biosynjournal of the glucosinolate core structure[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004,279(49):50717-50725.

[17]	Marsolais F, Sebastià C H, Rousseau A, et al. Molecular and biochemical characterization of BNST4, an ethanol-inducible steroid sulfotransferase from Brassica napus, and regulation of BNST genes by chemical stress and during development[J]. Plant Science, 2004,166(5):1359-1370.

[18]	Zang Y X, Hyun U Kim, Jin A Kim, et al. Genome-wide identification of glucosinolate synjournal genes in Brassica rapa[J]. FEBS Journal, 2009,276(13):3559-3574.

[19]	Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001,25:402-408. PMID

[20]	Dantas-Santos N, Gomes D L, Costa L S, et al. Freshwater plants synthesize sulfated polysaccharides: heterogalactans from water hyacinth (Eicchornia crassipes)[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012,13(1):961-976. DOI PMID

[21]	Hashiguchi T, Sakakibara Y, Hara Y, et al. Identification and characterization of a novel kaempferol sulfotransferase from Arabidopsis thaliana[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2013,434(4):829-835. PMID

[22]	Castillo-davis C I, Hartl D L, Achaz G. Cis-regulatory and protein evolution in orthologous and duplicate genes[J]. Genome Research, 2004,14(8):1530. PMID

[23]	徐仕林. 大白菜甜菜夜蛾的发生危害与防治[J]. 农民致富之友, 2014(20):67.

[24]	Zhang J H, Sun L W, Liu L L, et al. Proteomic analysis of interactions between the generalist herbivore Spodoptera exigua(Lepidoptera: Noctuidae) and Arabidopsis thaliana[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 28(2):324-333.

Options

文章导航