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2021 , Vol. 42 >Issue 3: 637 - 648

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.004

组学与生物技术

香蕉MaSULTR3家族成员的全基因组鉴定与不同温度下表达模式分析

  • 倪珊珊 ,
  • 林争春 ,
  • 刘彦英 ,
  • 陈裕坤 ,
  • 田栩瑞 ,
  • 王秀美 ,
  • 李小芳 ,
  • 张舒婷 ,
  • 赖钟雄 , *
展开
  • 福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州 350002
*赖钟雄,E-mail：

倪珊珊（1995—）,女,硕士,研究方向：果树生物技术。

收稿日期: 2020-06-11

  要求修回日期: 2020-07-12

  网络出版日期: 2021-03-25

基金资助

国家重点研发专项(2019YFD1000901)

国家现代农业产业技术体系(香蕉)专项资金(GARS-31-15)

福建省高原学科建设经费(102/71201801101)

版权

版权所有，未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
收起

Genome-wide Identification of Banana MaSULTR3 Family Members, Cloning of MaSULTR3.1-2 Gene and Analysis of Expression Patterns

  • NI Shanshan ,
  • LIN Zhengchun ,
  • LIU Yanying ,
  • CHEN Yukun ,
  • TIAN Xurui ,
  • WANG Xiumei ,
  • LI Xiaofang ,
  • ZHANG Shuting ,
  • LAI Zhongxiong , *
Expand
  • Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
*LAI Zhongxiong,E-mail：

Received date: 2020-06-11

  Request revised date: 2020-07-12

  Online published: 2021-03-25

Copyright

Copyright reserved © 2021.
Fold

摘要

利用生物信息学分析法对香蕉MaSULTR3基因家族成员进行全基因组鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、启动子顺式作用元件分析以及低温胁迫下叶片转录组的FPKM值分析;其后,利用基因组数据结合RT-PCR方法克隆了‘天宝蕉’（Musa spp., AAA Group）组培苗MaSULTR3.1-2基因的ORF序列;最后,利用qPCR技术分析了该基因在低温胁迫下的表达模式。结果表明,香蕉MaSULTR3家族有12个成员;MaSULTR3启动子区域含有光响应、激素响应、低温、干旱等逆境胁迫相关的响应元件;分子进化树分析表明MaSULTR3家族成员可分为4类：Class Ⅰ包含2个MaSULTR3成员（MaSULTR3.3-2、MaSULTR3.3-1）,与单子叶植物香蕉和水稻的SULTR3.3聚在一起;Class Ⅱ包含3个MaSULTR3成员（MaSULTR3.4-2、MaSULTR3.4-1的2个不同转录本）,与大部分物种的SULTR3.4和拟南芥的SULTR3.3/4聚在一起;Class Ⅲ包含4个MaSULTR3成员（MaSULTR3.1-6、MaSULTR3.1-2、MaSULTR3.5-1、MaSULTR3.5-2）,与香蕉和水稻的SULTR3.5聚在一起;Class Ⅳ包含4个MaSULTR3成员（MaSULTR3.1-4、MaSULTR3.1-3、MaSULTR3.1-5、MaSULTR3.1-1）,拟南芥、水稻和香蕉的SULTR3.1/2聚在一起。不同温度下叶片转录组的FPKM值分析表明：MaSULTR3在低温下整体呈上调趋势,在13 ℃处理下表达量最高,且MaSULTR3不同成员在应对低温胁迫下有不同的分工。天宝蕉MaSULTR3.1-2基因的ORF序列包含1959 bp的完整开放阅读框,编码652个氨基酸残基,属于SULTR3基因家族,不含信号肽,具有双向跨膜,为疏水性蛋白,PI为8.55,含有55个蛋白磷酸化位点,三级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比较大。亚细胞定位预测结果显示MaSULTR3.1-2可能定位于细胞质。qRT-PCR结果显示,‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因在所有检测组织部位均有表达,其中在叶片的表达量最高,并且在叶片表达量为随温度下降,表达量先下降后上升,在28 ℃表达量最高。本研究结果表明MaSULTR3.1-2基因可能参与低温胁迫下香蕉的抗寒响应。

关键词： 香蕉; MaSULTR3家族; 基因克隆; 低温胁迫

本文引用格式

倪珊珊 , 林争春 , 刘彦英 , 陈裕坤 , 田栩瑞 , 王秀美 , 李小芳 , 张舒婷 , 赖钟雄 . 香蕉MaSULTR3家族成员的全基因组鉴定与不同温度下表达模式分析[J]. 热带作物学报, 2021 , 42(3) : 637 -648 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.004

Abstract

Bioinformatics analysis was used to perform genome-wide identification, protein characterization analysis, molecular evolutionary tree analysis, promoter cis-acting element analysis, and FPKM analysis of leaf transcriptomes under low temperature stress on MaSULTR3 gene family members. The ORF sequence of MaSULTR3.1-2 of 'Tianbaojiao’ (Musa spp., AAA Group) tissue culture seedlings was cloned using genomic data combined with RT-PCR. Finally, the expression of the gene under low temperature stress was analyzed using the qPCR technology mode. The results showed that there were 12 members of the MaSULTR3 family of bananas; the MaSULTR3 promoter region contained response elements related to stress stress such as light response, hormone response, low temperature, and drought. Molecular evolution tree analysis showed that the members of the MaSULTR3 family could be divided into 4 categories: ClassⅠcontaining 2 MaSULTR3 members (MaSULTR3.3-2, MaSULTR3.3-1), and SULTR3.3 of monocotyledonous bananas and rice; ClassⅡContaining 3 members of MaSULTR3 (two different transcripts of MaSULTR3.4-2 and MaSULTR3.4-1), clustering together with SULTR3.4 of most species and SULTR3.3/4 of Arabidopsis; ClassⅢcontaining 4 MaSULTR3 members (MaSULTR3.1-6, MaSULTR3.1-2, MaSULTR3.5-1, MaSULTR3.5-2), clustering together with banana and rice SULTR3.5; Class Ⅳ containing 4 MaSULTR3 members (MaSULTR3.1-4, MaSULTR3.1-3, MaSULTR3.1-5, MaSULTR3.1-1), clustering together with SULTR3.1/2 of Arabidopsis, rice and banana.are grouped. The analysis of the FPKM value of the leaf transcriptome at different temperatures showed that MaSULTR3 showed an overall upward trend at low temperature and the highest expression level at 13 ℃, and different members of MaSULTR3 had different divisions of labor in response to low temperature stress. The ORF sequence of MaSULTR3.1-2 of Tianbaojiao contained a complete open reading frame of 1959 bp, encoding 652 amino acid residues. It belonged to the SULTR3 gene family contained no signal peptide, had a bidirectional transmembrane, was a hydrophobic protein, and had a PI of 8.55, Contained 55 protein phosphorylation sites, α-helix and random coil account for a large proportion of tertiary structure. The prediction results of subcellular localization indicated that MaSULTR3.1-2 may be localized in the cytoplasm. The qRT-PCR results showed that the ‘Tianbaojiao’ banana MaSULTR3.1-2 gene was expressed in all tissues tested, of which the expression level in the leaves was the highest, and the expression level in the leaves decreased with temperature, and the expression level decreased first and then increased. The highest expression level was at 28 ℃. The results of this study indicate that MaSULTR3.1-2 gene may be involved in the cold resistance of bananas under low temperature stress.

Key words： banana; MaSULTR3 family; gene cloning; low temperature stress

硫是植物体内有机物的重要组成部分,如半胱氨酸、甲硫氨酸、辅酶、铁氧还蛋白、生物素和硫胺素[1],是植物所需的6种大量元素之一,也是合成次生代谢产物芥子油苷的重要原料[2],广泛参与植物生物学过程[3]。硫酸盐是土壤中硫营养的主要存在形式,植物体对硫酸盐的吸收、运输和分配过程都需通过专门的载体蛋白——硫酸盐转运蛋白（sulfate transporter, SULTR）来实现[4]。目前,运用分子生物学相关技术,已经从柱花草[5]、大麦[6]、玉米[7]、番茄[8]、萝卜[9]等多种植物中克隆获得硫转运蛋白基因（SULTR）。在拟南芥中,SULTR家族有12个成员,划分为4个亚家族：SULTR1、SULTR2、SULTR3和SULTR4[10]。水稻鉴定出11个SULTR家族成员,SULTR成员的差异表达和可变剪接,在调节水稻生长发育以及逆境响应方面起着重要作用[11]。杨树有13个SULTR家族成员,其中PtaSULTR4;2和PtaSULTR3;3a的转录水平与树皮硫酸盐含量呈负相关,与环境参数呈正相关[12]。
植物生长发育过程中经常遇到不利的生长条件[13],其中低温是非常容易遭受的胁迫之一[14]。低温胁迫影响植物的各种代谢活动,会破坏细胞结构并损害关键的生理功能[15]。已有研究表明[16,17],植物体内的硫化合物和硫蛋白能够清除超氧离子自由基,提高植物的抗逆性。逆境胁迫下,植物也可以通过合成含硫氨基酸——甲硫氨酸或二甲硫氨酸,改变渗透物质,调节植株抗性[7]。研究表明,SULTR广泛参与植物的胁迫应答过程,如硫缺乏[18,19]、硒缺乏[18]、重金属胁迫[20,21]、干旱胁迫[7]等。硫缺乏促使芥子油苷水解,其水解产物SO42-可通过硫酸盐转运蛋白转运,从而作为硫资源被植物利用[22];也会促使植物合成吲哚乙酸（IAA）促进根系的生长,增加硫营养的吸收[23]。吲哚硫苷是芥子油苷的一种[24],吲哚硫苷生物合成相关基因CYP79B2、MYB51和TGG2的表达容易受到病原菌、虫害、高温等逆境胁迫的影响,并且与硫苷合成途径相关基因的表达模式具有较高的相关性[25]。吲哚硫苷和IAA都以色氨酸为前体氨基酸[26,27]。硫代谢、生长素、色氨酸代谢之间交织在一起,是植物对逆境胁迫做出的响应。
香蕉（Musa spp.）属于芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）多年生草本植物,是世界第一大宗贸易水果[28,29]。香蕉生长于热带及亚热带地区,喜温忌寒冷[30]。中国栽培香蕉的历史悠久,每年香蕉的产量约占全球总产量的10%。然而,福建作为中国香蕉栽培的北缘地区,冬季的持续低温严重阻碍了其产业化的发展[31,32]。长期以来,培育抗寒品种是香蕉育种研究的重要工作。目前,香蕉全基因组测序工作的完成,为深入研究香蕉响应低温胁迫的分子机制,并通过分子育种技术提高香蕉抗寒性提供了良好的条件。关于香蕉抗寒的研究报道较多,如刘炜婳等[33]分离出‘天宝蕉’HOS1启动子并通过生物信息学分析得出其含有跟低温胁迫相关的顺式作用元件,HOS1基因可能与‘天宝蕉’低温响应有关。杨洋[34]认为Why1基因能够响应‘天宝蕉’的低温胁迫,水杨酸和氯化钠处理提高了Why1基因的表达量。赖志宸等[35]以‘天宝蕉’为材料,克隆了与抗寒相关基因FAD7。刘彦英等[36,37]研究‘天宝蕉’中MaPFK3基因、香蕉中的miR408b靶基因Chemocyanin及低温下的表达分析,发现它们积极参与香蕉响应低温胁迫。Han等[38]发现MaC2H2s通过调节MaICE1参与香蕉果实的冷应激反应,MaC2H2s典型的C2H2-ZFP-TF结构域可能与低温响应相关。课题组前期利用RNA-Seq技术对经不同低温胁迫处理及28 ℃处理（CK）的三明野生蕉进行转录组、lncRNA和miRNA测序[39,40],筛选获得了1个受低温诱导显著上调表达的SULTR基因。鉴于此,本研究以栽培蕉漳州‘天宝蕉’为材料,通过RT-PCR技术克隆获得硫酸盐转运蛋白基因的cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析,同时采用qRT-PCR技术检测该基因在不同低温胁迫及不同组织部位中的表达模式,以探讨‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2对低温胁迫的响应机理,为后续深入研究香蕉SULTR基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘天宝蕉’（Musa spp., AAA Group）组培苗由福建农林大学园艺植物生物工程研究所种质资源圃提供。
香蕉A基因组数据从香蕉基因组网站（http://banana-genome -hub.southgreen.fr）下载获得[30];三明野生蕉低温处理转录组,由本实验室前期建立（SRA：SRS3320042）[39]。拟南芥SULTR3家族成员氨基酸序列下载于phytozome网站（https://phytozome.html）;水稻SULTR3家族成员氨基酸序列下载于水稻基因组数据库（Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology. msu.edu/）[41]。
qRT-PCR试验材料处理为：选取健壮的长势一致的‘天宝蕉’组培苗,置于人工气候箱进行0、4、13 ℃的低温处理,28 ℃处理作为对照,光照强度均为2000 lx、处理24 h后（12 h光照/12 h黑暗）对组培苗叶片、假茎、根取样。所有样品取样后立即用液氮冻存,-80 ℃超低温冰箱中保存,用于后续试验。

1.2 方法

1.2.1 MaSULTR3基因家族成员的全基因组鉴定及进化树构建 香蕉MaSULTR3基因家族成员鉴定：以模式植物拟南芥和水稻SULTR3基因作为探针序列,利用本地Blast软件在野生蕉低温转录组数据中进行Blast搜索比对（e值设置在0.0001）,并以“sulfate transporter”为关键词直接检索,以同样的比对方法获得香蕉A基因组中MaSULTR3成员。去除重复序列后,利用HMMER（https:// www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）在线软件对序列的保守结构域进行鉴定,选择具有完整SulP transporter和STAS结构域的序列作为候选的MaSULTR3成员。根据拟南芥和水稻SULTR3基因命名方法和香蕉数据中的注释,对香蕉MaSULTR3进行命名鉴定。利用MEGA 7.0软件,采用邻接法（NJ法,Bootstrap设为1000,其他参数为默认值）对香蕉A基因组、三明野生蕉低温处理转录组、拟南芥和水稻的SULTR3基因家族成员,共34条氨基酸序列构建系统进化树。
1.2.2 生物信息学分析 采用在线软件ExPASy（https://web.expasy.org/prot-param）对MaSULTR3基因家族成员进行理化性质分析;采用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）在线软件对MaSULTR3蛋白进行亚细胞定位预测;采用Gene Structure Display Server 2.0（http://gsds.cbi.pku. edu.cn/）对MaSULTR3进行基因结构分析;利用在线软件PlantCARE （http://bioin forma tics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）对MaSULTR3启动子顺式作用元件进行分析。此外,利用在线软件NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos）对‘天宝蕉’的MaSULTR3.1-2蛋白进行磷酸化位点进行分析、采用SignalIP 5.0（https: //web.expasy.org/Protparam/）对MaSULTR3.1-2进行信号肽预测、采用Tmpred（https://embnet. vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）在线软件对MaSULTR3.1-2进行跨膜结构分析;采用在线软件NCBI Conserved Domain Searcg（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对MaSULTR3.1-2进行保守结构域分析;采用SOPMA（https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bi n/secpred sopma. pl）在线软件对MaSULTR3.1-2二级结构预测、采用SWISS-MODE（https://swissmodel.expasy. org/）在线软件对MaSULTR3.1-2三级结构预测。
1.2.3 ‘天宝蕉’总RNA提取 采用RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN,中国）试剂盒分别提取不同温度处理‘天宝蕉’的总RNA,并用浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度仪检测RNA完整性。选取电泳条带完整、无拖带,OD260/OD280范围1.9~2.1,浓度在100 ng/μL以上的RNA用于后续的实验。采用RevertAidTM First- Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas,立陶宛）试剂盒进行cDNA第1条链合成。采用PrimeScript™ RT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa,日本）试剂盒进行cDNA的合成,用于qRT-PCR试验。
1.2.4 MaSULTR3.1-2基因克隆 参考小果野蕉（Musa acuminata）MaSULTR3.1-2基因的CDS序列,设计包含完整编码区的引物,以‘天宝蕉’叶片cDNA作为模板,进行PCR扩增,克隆MaSULTR3.1-2的ORF区。PCR反应体系：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35个循环;72 ℃终延伸10 min。纯化PCR产物后,进行连接、转化、培养,挑单克隆用于菌液PCR鉴定,挑选阳性克隆子,委托华大基因生物技术有限公司测序。实验所用引物序列见表1。
表1 引物序列

Tab. 1 Primer sequences

引物 Primer 引物序列 Primer sequence (5°-3°) 用途 Functions
MaSULTR3.1-2 F GTATTGTGGTACTCATGGG MaSULTR3.1-2的ORF扩增
MaSULTR3.1-2 R CTTACTGCTTAAACCACGGCTTC MaSULTR3.1-2的ORF扩增
qMaSULTR3.1-2 F GCCATTCCTCGATACCTTCA MaSULTR3.1-2实时荧光定量PCR
qMaSULTR3.1-2 R AACCCCAGGATCACTCGAC MaSULTR3.1-2实时荧光定量PCR
CAC-q F AACTCCTATGTTGCTCGCTTATG CAC实时荧光定量PCR
CAC-q R GGCTACTACTTCGGTTCTTTCAC CAC实时荧光定量PCR
1.2.5 MaSULTR3基因家族成员及MaSULTR3.1-2基因的表达分析 为研究MaSULTR3家族成员在不同温度下的表达情况,参考三明野生蕉低温转录组数据库[21],提取不同温度胁迫（0、4、13、28 ℃为对照温度）时特异表达的FPKM值,用于MaSULTR3基因成员在低温下的表达分析。
为进一步分析MaSULTR3.1-2基因的表达,采用qRT-PCR方法获得MaSULTR3.1-2基因在‘天宝蕉’不同组织部位的不同温度的表达情况。设计MaSULTR3.1-2基因的qRT-PCR引物,用CAC基因作内参基因。用荧光定量qPCR仪（Light Cycler480）进行检测,进行3次生物学重复。采用2-△△CT法计算基因的表达情况,采用Excel软件进行数据处理,用SPSS进行差异显著性分析。引物委托福州尚亚生物技术有限公司合成。

2 结果与分析

2.1 香蕉MaSULTR3基因家族成员的全基因组鉴定与蛋白特性分析

由于SULTR家族中第三亚族所占成员数量大且相关报道与抗逆性相关,故选择SULTR3作为研究香蕉抗寒机制的对象。通过比对筛选,获得香蕉12个SULTR3成员,并借鉴拟南芥、水稻的基因命名规则对SULTR3进行命名（表2）。
表2 香蕉SULTR3基因家族蛋白质特性分析

Tab. 2 Characteristics analysis of SULTR3 family proteins

基因ID
Gene ID		 氨基酸数
Amino acid number		 等电点
PI		 稳定性
Instability index		 亲水性
Hydrophilic		 亚细胞定位
Predicted localization
Ma03_p15840 SULTR3.1-1 660 8.57 35.49 0.476 细胞核、细胞外
Ma01_p20480 SULTR3.1-2 652 8.55 35.13 0.541 细胞质、液泡、高尔基体、内质网
Ma06_p25800 SULTR3.1-3 649 8.72 36.22 0.549 细胞质、内质网、液泡
Ma03_p26650 SULTR3.1-4 662 8.24 37.08 0.481 细胞质、液泡、内质网
Ma03_p21470 SULTR3.1-5 634 8.35 36.74 0.490 细胞质、液泡、内质网、高尔基体
Ma06_p04020 SULTR3.3-1 646 9.19 36.82 0.416 细胞质、内质网、细胞核、液泡
Ma10_p29980 SULTR3.3-2 655 9.33 36.82 0.434 细胞质、液泡、内质网
Ma10_p27220 SULTR3.4-1 656 8.98 39.36 0.454 细胞质、液泡、内质网
Ma07_p09650 SULTR3.4-2 666 9.28 36.58 0.504 细胞质、液泡、内质网
Ma04_p37290 SULTR3.4-3 653 8.97 42.22 0.452 细胞质、液泡
Ma05_p09480 SULTR3.5-1 639 8.84 33.85 0.479 细胞质、内质网、线粒体
Ma03_p21480 SULTR3.5-2 643 8.72 37.62 0.481 细胞质、高尔基体、液泡
对MaSULTR3基因家族成员的蛋白质特性进行分析（表2）,发现香蕉MaSULTR3基因家族成员的氨基酸长度主要在639~666 aa之间;等电点在8.24~9.33之间,均为碱性蛋白;不稳定系数分析发现,除了MaSULTR3.4-3为不稳定蛋白,其他成员均为稳定蛋白（不稳定系数<40）;MaSULTR3家族成员均为疏水蛋白;亚细胞定位预测分析发现,MaSULTR3家族成员绝大多数定位于细胞质,MaSULTR3.1-1比较特殊,定位于细胞核,推测MaSULTR3.1-1可能具有不同的生物学特性。

2.2 香蕉MaSULTR3基因家族成员基因结构及系统进化树构建

为了进一步了解香蕉MaSULTR3基因家族成员的生物学功能,对12条MaSULTR3基因进行基因结构的分析。结果发现（图1）,SULTR3基因家族成员大多数都具有内含子,其中,7个成员包含11个内含子,12个外显子;5个成员包含12个内含子,13个外显子。
图1 MaSULTR3基因家族成员结构

Fig. 1 Gene structure of the MaSULTR3 family

为了解不同物种间SULTR3的进化关系,采用MEGA7构建香蕉A基因组、野生蕉低温处理转录组、拟南芥、水稻等34条SULTR3蛋白进化树（图2）。进化树分析将SULTR3分为4大类：ClassⅠ包含2个MaSULTR3成员（MaSULTR3.3- 2、MaSULTR3.3-1）,与单子叶植物香蕉和水稻的SULTR3.3聚在一起;ClassⅡ包含3个MaSULTR3成员（MaSULTR3.4-2、MaSULTR3.4-1的2个不同转录本）,与大部分物种的SULTR3.4和拟南芥的SULTR3.3/4聚在一起;ClassⅢ包含4个MaSULTR3成员（MaSULTR3.1-6、MaSULTR3.1-2、MaSULTR3.5-1、MaSULTR3.5-2）,与香蕉和水稻的SULTR3.5聚在一起;ClassⅣ包含4个MaSULTR3成员（MaSULTR3.1-4、MaSULTR3.1-3、MaSULTR3.1-5、MaSULTR3.1-1）,拟南芥、水稻和香蕉的SULTR3.1/2聚在一起,说明同为单子叶的水稻和香蕉的亲缘关系更近。
图2 不同物种SULTR3家族成员氨基酸序列系统进化树分析

Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequence of SULTR3 family members in different species

2.3 香蕉MaSULTR3基因家族启动子的顺式作用元件分析

对香蕉A基因组MaSULTR3基因上游2000 bp序列进行的启动子顺式作用元件预测,结果如图3所示。香蕉MaSULTR3基因家族启动子均包含TATA-box和CAAT-box,说明MaSULTR3家族基因都可正常转录。对MaSULTR3基因组启动子的主要顺式作用元件分析（图4）,发现MaSULTR3基因家族成员大部分都包含光响应元件、厌氧诱导响应元件、脱落酸及茉莉酸甲酯响应元件。部分基因包含响应低温、干旱、生长素、生物钟、防御和胁迫、缺氧特异性诱导、Myb结合位点参与光响应等作用元件。推测该家族在参与植物非生物胁迫中发挥重要功能。
图3 香蕉MaSULTR3家族基因核心启动子序列分布

Fig. 3 Core promoter sequence of banana MaSULTR3 family gene

图4 香蕉MaSULTR3家族启动子序列顺式作用元件

Fig. 4 Distribution of cis acting elements in promoter sequence of banana MaSULTR3 family

2.4 MaSULTR3基因在不同温度下表达模式的FPKM值分析

为了解MaSULTR3基因家族成员在香蕉不同温度处理下的表达情况,根据野生蕉低温转录组中的MaSULTR3基因家族成员FPKM值作聚类表达分析（图5）。MaSULTR3基因的表达模式大致分为3种：在各个温度下不表达（MaSULTR3.5-2、MaSULTR3.4-3）;表达量在13 ℃为最大值（MaSULTR3.4-2、MaSULTR3.5-1、MaSULTR3.1- 4、MaSULTR3.1-1、MaSULTR3.3-2）;表达量在28 ℃为峰值（MaSULTR3.1-2、MaSULTR3.1-3、MaSULTR3.4-1、MaSULTR3.3-1、MaSULTR3.3-3）。MaSULTR3在低温下整体呈上调趋势,在13 ℃处理下表达量最高。
图5 野生蕉SULTR3家族在不同温度下的表达分析

Fig. 5 Expression analysis of wild SULTR3 family at different temperatures

2.5 MaSULTR3.1-2基因ORF的克隆、生物信息学分析及低温下表达的qRT-PCR分析

2.5.1 MaSULTR3.1-2基因ORF的克隆 通过RT-PCR技术,从福建传统主栽品种‘天宝蕉’中克隆了MaSULTR3家族中代表性的MaSULTR3.1- 2基因（图6）。获得1 959 bp序列,编码652个氨基酸,与小果野蕉基因组序列相似性为99.34%。通过NCBI网站进行核苷酸序列同源比对（图7）,发现MaSULTR3.1-2与小果野蕉硫酸盐转运蛋白基因的（XM_009420921.2、XM_ 009407675.2）覆盖率接近为100%,相似度分别为99.34%、87.58%;与海枣（XM_008811166.3）、芝麻（XM_011081597.2）覆盖率均为95%,相似度在72%以上,说明MaSULTR3.1-2基因物种间保守性较高。
图6 ‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2各个阶段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

M: DL2000 marker;1：‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2 ORF区的PCR产物;2：‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2 ORF区菌检的PCR产物。

Fig. 6 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplification products in various stages of ‘Tianbao’ banana MaSULTR3.1-2

M: DL2000 marker; 1: PCR product of ‘Tianbao’ banana MaSULTR3.1-2; 2: Test PCR product of ‘Tianbao’ banana MaSULTR3.1-2.

图7 ‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2 ORF序列与小果野蕉基因组的MaST3.1序列比对

Fig. 7 Alignment of MaSULTR3.1-2 ORF sequence with MaST3.1 sequence of Musa acuminata genome

2.5.2 MaSULTR3.1-2的生物信息学分析 对MaSULTR3.1-2进行蛋白理化性质分析,结果显示MaSULTR3.1-2蛋白分子表达式为C3244H5101 N821O881S29,该蛋白共有10 076个原子,相对分子质量为70 629.90 Da,理论等电点pI为8.55,属于碱性蛋白;该蛋白不稳定系数达35.63,故该蛋白为稳定蛋白;脂肪系数为109.79;总平均疏水性0.543,为疏水蛋白。信号肽预测发现,MaSULTR3.1-2蛋白不存在切割位点、不具信号肽;亚细胞定位结果显示可能定位于胞浆、高尔基体、细胞壁、液泡、内质网。
用Tmpred软件进行MaSULTR3.1-2跨膜结构预测,发现MaSULTR3.1-2存在2种跨膜模型,其中第1种模型为STRONGLY prefered model: N-terminus inside,包含13种跨膜螺旋,总分值为19 877,其中由膜内向膜外的有7个,由膜外向膜内的有6个;第2种模型为alternative model,包含12种跨膜螺旋,总分值为17 083,其中由膜内向膜外的有6个,由膜外向膜内的有6个。磷酸化位点预测结果表明MaSULTR3.1-2含有55个蛋白磷酸化位点,包含了33个丝氨酸（Ser）位点,16个苏氨酸（Thr）位点,6个酪氨酸（Tyr）位点。
MaSULTR3.1-2的基因结构（图8）和保守结构域（图9）分析发现MaSULTR3.1-2基因包含11个内含子,12个外显子。MaSULTR3.1-2具有完整的膜蛋白硫酸盐转运蛋白（Sultr）家族保守结构域。
图8 MaSULTR3.1-2基因结构

Fig. 8 Genomic structure of MaSULTR3.1-2

图9 MaSULTR3.1-2保守结构域

Fig. 9 Conserved domains of MaSULTR3.1-2

MaSULTR3.1-2蛋白二级结构预测发现MaSULTR3.1-2的主要构成元件是α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲（图10）。在MaSULTR3.1-2中,α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲所占的比例分别为：50.46%、3.83%、32.21%。MaSULTR3.1-2蛋白三级结构预测结果和二级结构预测一致,该蛋白主要组成原件是α-螺旋和无规则卷曲（图11）。
图10 MaSULTR3.1-2蛋白的二级结构预测结果

Fig. 10 Prediction results of secondary structure of ‘Tianbao’ banana MaSULTR3.1-2 protein

图11 MaSULTR3.1-2蛋白三级结构预测结果

Fig. 11 Prediction results of the tertiary structure of ‘Tianbao’ banana MaSULTR3.1-2 protein

为进一步了解‘天宝蕉’中MaSULTR3.1-2蛋白与其他植物的进化关系,通过NCBI中下载和MaSULTR3.1-2相似度较高的20种植物的SULTR3.1蛋白序列同MaSULTR3.1-2一起构建进化树。结果发现（图12）,SULTR3.1分为两大支,一支主要包含双子叶植物;另一支则只包含单子叶植物。‘天宝蕉’的MaSULTR3.1-2聚类在单子叶植物分支,和芋艿、油棕、海枣、菠萝关系等单子叶植物亲缘关系近,和双子叶植物的关系远。
图12 ‘天宝蕉’与其他植物MaSULTR3.1的进化树分析

Fig. 12 Phylogenetic tree based on protein sequence of MaSULTR3.1 from ‘Tianbao’ and other plants

2.5.3 ‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因表达的组织特异性分析以及在低温处理下表达分析 对‘天宝蕉’不同组织部位（叶片、假茎、根）的MaSULTR3.1-2进行qPCR分析。结果表明（图13）,MaSULTR3.1-2在叶片、假茎和根中都有表达,在叶片中的表达量最高,约为根和假茎中表达量的12倍,推测MaSULTR3.1-2基因可能在叶片中发挥重要作用。
图13 ‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因在不同组织中的表达分析

Fig. 13 Expression analysis of MaSULTR3.1-2 gene in different tissues

对不同组织部位在不同温度处理下进行qPCR分析发现（图14）,MaSULTR3.1-2在根部的表达量随温度变化不显著;在假茎中的表达趋势随温度的下降表达量先上升后下降,在13 ℃表达量最高而在其他温度（28、4、0 ℃）表达量为1.0左右;MaSULTR3.1-2在叶片表达趋势随着温度下降,表达量先下降后上升,在28℃表达量最高,在4 ℃表达量最低。以上结果表明‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因与低温响应有关,且不同组织部位响应模式存在差异。
图14 低温胁迫下‘天宝蕉’的不同组织部位MaSULTR3.1-2的表达分析

Fig. 14 Expression analysis of MaSULTR3.1-2 in different tissues of ‘Tianbao’ banana under low temperature stress

3 讨论

3.1 香蕉MaSULTR3可能具有功能上的多样性

目前关于植物SULTR家族的全基因组分析已经有相关报道,主要有拟南芥[42]、苜蓿[42]、高粱[43]、马铃薯[44]、玉米[45],而关于芭蕉科植物SULTR家族全基因组分析尚未见报道。本研究对SULTR第三亚族MaSULTR3进行家族鉴定与分析,共鉴定出12条基因。拟南芥、苜蓿、高粱、马铃薯、玉米基因组中分别鉴定出5、7、5、7、4个SULTR3家族成员,香蕉MaSULTR3成员个数多于上述植物。
亚细胞定位预测绝大多数定位在细胞质,除了MaSULTR3.1-1定位于细胞核,而高粱则全部定位于细胞膜[43],推测MaSULTR3.1-1可能具有不同的生物学功能。对‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因进行克隆和生物信息学分析,亚细胞定位发现,定位于细胞质的可能性最大,这和张晶晶等[18]研究的茶树CsSULTR3定位相同,而Cao等[46]研究的拟南芥SULTR3定位在叶绿体。通过香蕉MaSULTR3启动子序列分析发现,有7个成员具有低温响应元件,这些成员可能在植株遭受低温为害中发挥作用。香蕉MaSULTR包含大量的光响应元件和厌氧诱导响应元件等,60%左右的基因包含响应低温、干旱、生长素作用元件。40%左右的基因包含生物钟、防御和胁迫、缺氧特异性诱导、Myb结合位点参与光响应等作用元件。结合启动子顺式作用元件特点推测MaSULTR3成员可能响应多种非生物胁迫——低温、干旱、缺氧等胁迫。Gallardo等[42]研究的拟南芥和苜蓿中SULTR3对非生物胁迫强烈响应,特别是sultr3;1基因在遭受干旱和盐胁迫的两个物种的根中的上调表达。Cao等[47]在拟南芥中研究的Atsultr3;4,Mtsultr3;4a也响应干旱和盐胁迫应答。Vatansever等[44]通过分析StSULTR3成员的表达谱,表明StSULTR3成员参与了植物胁迫反应,在热胁迫、干旱、植物激素和盐胁迫处理下,StSULTR3基因成员的表达具有差异性。Hyung等[48]研究的拟南芥和截形苜蓿的跨物种转化研究中,SULTR3基因在非生物胁迫响应中表现出相似的特性,特别是在盐胁迫、冷胁迫和干旱胁迫下。由此推测SULTR3成员在植物胁迫防御中起着关键作用。
此外我们分析了三明野生蕉低温转录组中SULTR3成员在不同温度处理下表达差异显著,这暗示着SULTR3不同成员在香蕉低温胁迫下发挥着不同的生物学功能。Vatansever等[44]利用RNA-seq检测多种胁迫条件下STSULTR的转录,发现存在可变剪接且SULTR3基因各成员在非生物胁迫下表达差异显著。SULTR与植物吸收同化硫相关,SULTR主要通过硫代谢响应逆境胁迫。硫同化会提高H2O2含量,H2O2能够提高NiR的含量而促进NO的产生,最终促进气孔的关闭从而响应低温胁迫[49]。植物体内含硫化合物如谷胱甘肽可降低逆境中产生的自由基从而提高植物的抗性[50]。硫是蛋白质的重要组分,主要以-SH和二硫键形式存在,二硫键将连接不同多肽组成稳定的蛋白质结构,通常蛋白质链内含有二硫键,植物抗逆能力更强[51]。然而关于SULTR3成员响应低温胁迫的研究仅局限在转录组测序和低温胁迫下的表达量分析。SULTR3在低温胁迫下的作用机制还有待于进一步验证。

3.2 香蕉MaSULTR3.1-2可能参与香蕉低温响应

本研究对‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因在低温下的表达进行分析,结果发现低温处理明显影响‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因的表达,且不同组织部位对低温的应答有差异。常温下MaSULTR3.1-2在叶片中的表达量最高,在不同温度处理下,在叶片中的表达量在28 ℃最高。在假茎和根中,基因在低温下的表达量比对照高,特别是在假茎中,基因在13 ℃的表达量最高。在4 ℃表达量最低。植物以硫酸盐阴离子的形式吸收硫,这些硫首先进入根细胞,硫酸盐转运蛋白（SULTR）在植物细胞之间和内部运输[52],香蕉在低温胁迫下,硫酸盐转运蛋白在根和茎中表达量较高,以应对低温胁迫,硫代谢途径产生多种化合物,这些化合物对干旱、强光等胁迫应答起着关键作用。初级硫同化产生半胱氨酸,用于蛋白质合成,也是谷胱甘肽的前体。次生硫代谢途径产生硫甙和硫肽等硫化合物,以及相应的副产物3′-磷酸腺苷5′-磷酸（PAP）。植物体内硫酸化合物和PAP对激素信号的调节,气孔关闭以及生长的调节等方面响应逆境胁迫[53,54]。低温下叶片中的硫酸盐转运蛋白表达量减少,可能跟该蛋白的功能有关,由于硫酸根的运输顺序是从根到假茎最后到叶片,故SULTR基因率先转到根和假茎中表达,这是植株在低温胁迫下应激反应的结果。由此可得出‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因可能与响应低温胁迫有关,MaSULTR3.1-2基因调控硫的吸收和同化,硫和含硫化合物与低温胁迫相关,含硫化合物如谷胱甘肽,能够清除植物体内因低温胁迫产生的超氧自由基[55]。H2O2含量的提高最终导致气孔关闭,延缓植株生长从而应对低温胁迫,这进一步佐证‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因可能与低温胁迫相关。但这个基因与温度胁迫相关的研究鲜见报道,MaSULTR3.1-2基因响应低温胁迫的相关作用机制还需进一步研究。

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