天然橡胶（顺式-1,4-聚异戊二烯）是天然高分子化合物,与合成橡胶相比有优良的抗撕裂、耐老化、回弹性、伸展性、较强金属粘合性和应变诱导结晶性能等。其制品遍及民生、交通运输业、医疗制品业、建材业、机械制造业、航天科技和国防军工业等领域,具有不可替代作用,所以天然橡胶具有重要的经济价值和战略意义[1]。巴西橡胶树是当前天然橡胶的主要来源,但由于叶枯病和人类对原始植地的破坏等原因,近些年全球天然橡胶的总产量约1200万~1400万t,已达到生产上限。我国是天然橡胶消费大国,但80%以上的天然橡胶依赖进口来满足,致使天然橡胶产业成为一种典型的资源约束型产业,一旦切断我国天然橡胶进口来源,橡胶产业形势不容乐观[2]。目前,仅通过提高橡胶树单产来提高我国天然橡胶产量进度十分缓慢,其策略也非常不符合现实,必须大胆开辟新的途径,寻找其他产胶作物来增加天然橡胶多元化来源,以缓解当前我国对进口天然橡胶的依赖。在近几十年里,世界科学家在近万种植物中大量筛选试种,在2500多种产胶植物中,最终筛选出新生产胶物种草本植物橡胶草和银胶菊,二者均可在贫瘠和高纬度寒冷地域生长,且具有适合规模化种植采收的特点[3]。研究者们对这几种产胶植物进行了系统性研究,并试图将橡胶草作为潜在产胶经济作物,以期进一步使天然橡胶产业多元化发展。
胶乳是产胶植物中一种专化性乳管细胞的细胞质,乳胶中主要含有橡胶粒子（RPs）、C-乳清（CS）及黄色体（Lutoid）等成分[4],而橡胶粒子是天然橡胶胶乳中的一种用于橡胶生物合成和贮存的特殊细胞器。研究发现,天然橡胶的生物合成是一种典型的植物类异戊二烯的次生代谢途径。甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖醇（MEP）途径是橡胶树中天然橡胶合成的2种主要途径,MVA发生在细胞质中,而MEP发生在质体中,二者均可合成类异戊二烯橡胶单体[5]。天然橡胶的生物合成是将异戊烯基焦磷酸（IPP）作为合成原料,合成过程可分为3个阶：（1）乙酰-CoA合成的起始阶段;（2）乙酰-CoA再经过MVA转化成IPP的延伸过程;（3）最后由多个IPP分子通过顺式聚合的方式形成高分子聚合物——天然橡胶[6]。研究表明,橡胶粒子是橡胶生物合成和贮存的特殊细胞器,天然橡胶主要是通过RPs膜上多种蛋白质共同调控合成[7],并且主要通过调控橡胶粒子上的蛋白质的表达积累量和酶的活性起作用[8]。
如何精准调控橡胶树中天然橡胶的生物合成,一直是天然橡胶基础研究中的核心问题。随着基因组测序研究的快速发展,蛋白质组研究随之不断更新,并广泛应用于生物学和医学的各个研究领域[9],产胶植物的蛋白组学研究也相继展开,研究包括在细胞水平、蛋白质表达水平、蛋白质相互作用、氨基酸翻译后修饰等内容,并取得了很多有价值的新研究成果。本文综述了橡胶树、橡胶草和银胶菊等产胶植物在国内外蛋白质组研究领域的最新进展,以期为解析蛋白质在天然橡胶生物合成中的调控机制提供新思路,为促进我国天然橡胶产业向多元化发展提供一定的潜在作用和建设性意见。
1 天然橡胶生物合成的关键蛋白酶和调控基因研究
早在1969年,Archer等[10]首次提出橡胶转移酶（RT-ase）是天然橡胶生物合成的主要合成酶。2013年,巴西橡胶树的基因组草图首次报道,为解开天然橡胶生物合成机理研究奠定生物信息学基础,并指出天然橡胶的合成并不是RT-ase单一酶的作用结果[11]。2016年,Tang等[12]将橡胶树基因组进一步深度测序,获得基因组93.8%（1.47 Gb）的覆盖率,包含约43 792个预测的蛋白编码基因。2020年,Liu等[13]使用单分子实时测序（SMRT）和Hi-C技术将橡胶树基因组装配到18条假染色体中,与整个橡胶生物合成过程相关基因的显著扩展,还鉴定了许多与产胶相关的候选驯化基因,其中一些基因与橡胶树栽培种中的橡胶生物合成有关。
天然橡胶是在植物类异戊二烯/萜类次生代谢中产生的,细胞质中的类异戊二烯合成单体分子IPP,是由乙酰-CoA在MVA途径或丙酮酸和甘油醛-3-磷酸经质体中的MEP途径生成[14]。在MVA途径中,每种酶的家族基因中至少有一个基因成员在乳胶中大量表达,说明MVA途径是橡胶树天然橡胶生物合成IPP的主要贡献者,也是天然橡胶最主要合成的途径[15]。MVA通过6个主要步骤合成天然橡胶：乙酰辅酶A乙酰转移酶（AACT）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS）[16]、HMG-CoA还原酶（HMGR）、甲羟戊酸激酶（MVK）、磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）[17]。HMG-CoA在胞质中将乙酰-CoA转化为橡胶合成单体IPP,HMGS催化乙酰乙酰-CoA向HMG-CoA转化是不可逆的反应,所以HMGS是MVA途径的决定性步骤和关键限速酶[18],接着MVA途径通过二甲丙烯焦磷酸酯（DMAPP）、牻牛儿基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPPS）等一系列酶促反应后,再经顺式异戊烯基转移酶（CPT）、橡胶延伸因子（REF）、小橡胶粒子膜蛋白（SRPP）和桥接蛋白（HRBP）形成的复合体共同作用下,使IPP单体在橡胶粒子膜上聚合形成IPP长链分子。通常橡胶分子起始物APP的合成与其他植物合成一样,在乳管细胞的细胞质或质体中进行,并且催化过程中的酶都相同,在APP合成过程中法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）是关键酶[19]。橡胶分子延伸是在橡胶粒子膜上进行,通过膜表面蛋白质或蛋白质复合物催化IPP加到橡胶链上形成天然橡胶[7]。Cornish等[20]研究发现,橡胶转移酶（RuTase）是一类顺式异戊二烯转移酶,它将IPP聚合到橡胶分子上,或与APP合成分子量大小不等的顺式-1,4-聚异戊二烯。RuTase也是一个多种酶的合称,均为疏水性蛋白,不同的植物中的RuTase具有相近的性质,能与橡胶粒子膜上的CPT结合,参与橡胶延伸最后一步反应,并决定橡胶分子的大小,但二者之间精确结合位点及互作方式还有待解析。
天然橡胶分子量约为105~106 Da,是由成千上万个IPP聚合构成[1],在橡胶粒子膜上的SRPP和REF蛋白占较大比例,不仅影响天然橡胶生物合成的速度,还可能与橡胶分子量的大小有关,直接关系着橡胶胶乳的产量[21]。REF、SRPP和HRBP等蛋白的合成与内质网（ER）紧密相关,质膜上的CPT是被SRPP转入到ER内,而HRBP蛋白与CPT蛋白结合相互作用后,再将CPT蛋白又重新转至质膜中[6]。虽然CPT、REF、SRPP和HRBP蛋白在橡胶生物合成中起着积极和关键作用,但天然橡胶的分子量大小的决定性因素仍然不清楚。这些蛋白质中未发现具体的催化结构域,还需对每种蛋白的同/异种结构型蛋白及蛋白修饰的确切功能进行深入研究。
2 橡胶树蛋白质组研究
2.1 橡胶树不同组织蛋白质组研究
1991年,Martin[22]通过双向蛋白电泳（2-DE）结合酶学技术,首次报道橡胶树胶乳中黄色体和C-乳清的蛋白表达图谱,并发现几丁质酶和溶菌酶是胶乳蛋白中的主要成分。很多天然橡胶制品都会引起人类的过敏反应现象,通过蛋白质微阵列和2-DE技术,发现胶乳中存在很多过敏原蛋白。2004年,Yagami等[23]在胶乳中鉴定了10个胶乳过敏原蛋白,其中5个是新的过敏原蛋白。在胶乳蛋白联合肽段配体库（Combinatorial Peptide Ligand Libraries）中,共有300多个基因产物。然后通过18个病人的抗体筛选胶乳过敏原,发现除了常规的胶乳过敏原蛋白外,还发现有热激蛋白80、蛋白酶体亚基、蛋白酶抑制剂、几丁质酶A（hevamine A）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等也被认为是胶乳过敏原蛋白。橡胶树不同组织蛋白组研究能够发现组织特异性蛋白质,其具体功能对精确解析相关代谢机制显得尤为重要。
2.1.1 橡胶树树皮蛋白质组研究 橡胶树韧皮部中的乳管列数与胶产量密切相关,是决定橡胶产量的因素之一。对树干和树皮进行细胞学研究发现,形成层与周皮间的乳管位于韧皮部中,呈同心环状排列。胶乳的再生不仅取决于乳管细胞本身的代谢,还取决于乳管周围其他薄壁细胞提供源源不断的蔗糖和碳氮源等有机能量物质[7]。乳管细胞中还存在很多细胞器,如线粒体、高尔基体、核糖体、橡胶粒子、细胞核等。
天然橡胶的生物合成是在橡胶粒子表面进行的,不同含胶植物中橡胶粒子的分布是不同的,如巴西橡胶树和杜仲在各个组织均有分布,橡胶草的橡胶粒子主要分布在根中的乳管细胞中,叶脉中也有少量分布,而银胶菊分布在皮层下薄壁细胞中[25]。2008年,兰芳银[26]在分析橡胶树幼树无性系和老树无性系的差异蛋白时,发现了2个与氢氰酸（HCN）合成相关酶是树皮特有酶,当树皮损伤后,产生的HCN对树皮具有一定的保护作用。另外,在木质部蛋白中发现,S-腺苷甲硫氨酸合成酶和半胱氨酸转甲基酶也是高丰度蛋白[27]。2008年,闫洁等[28]在健康树皮与死皮的胶乳中的黄色体蛋白质组对比差异蛋白时,在死皮蛋白质中发现了一个渗透蛋白,该渗透蛋白在死皮植株中表达下调可能与死皮病的发生有一定的关系。2012年,王斌等[29]比较橡胶树木质部和树皮蛋白质组研究发现,与HCN合成相关的2个酶是树皮特有的,而半胱氨酸转甲基酶（cysteine transmethylase）是木质部的高丰度蛋白,这2个酶与橡胶树木质部早期发育相关。2001年,Sookmark等[30]发现了死皮树胶乳中REF和SRPP蛋白均大量表达,并且在割胶后REF蛋白也明显增多,说明机械损伤能够促进胶乳中REF蛋白高调表达,加速橡胶的合成。此外,在树皮机械损伤后,还发现多酚氧化酶（PPO）使乳胶暴露在空气出现褐变现象[31]。在乳胶中PPO与乳胶凝固和伤口封闭紧密相关,然而,在乙烯刺激橡胶后,树皮中PPO、几丁质酶和葡聚糖酶的积累反而下降,这可能会阻碍橡胶粒子在伤口的聚集,胶乳的外流时间延长增加,从而提升橡胶产量。
2.1.2 橡胶树种子和叶片蛋白质组研究 2011年,在橡胶树种子萌发前后的差异蛋白质功能研究发现,仅在成熟干种子中酸性凝集素和赤霉素20-氧化酶特异性表达;另有淀粉分支酶、假定的β-葡萄糖苷酶及MutT/nudix家族蛋白质在萌发种子中呈下调表达。其中MutT/nudix家族蛋白质和β-葡萄糖苷酶参与控制细胞壁水解的活性,而胞壁水解活性与种子发芽过程中胚乳营养组织生长,或与储藏物的调动密切相关[32]。2009年,林秀琴等[33]发现在干旱胁迫橡胶树叶片中有38个差异蛋白表达量明显增加,这些蛋白主要参与胁迫应激响应、能量代谢、光合作用及信号转导等生物学过程。2012年,王海燕等[34]在对橡胶树幼嫩和成熟叶片蛋白分离鉴定时,发现大多数蛋白参与碳代谢和翻译后修饰过程[35]。
2.2 橡胶树胶乳蛋白质组研究
天然橡胶主要在乳管细胞中合成和积累,目前主要集中在胶乳中蛋白质修饰方面的研究[36]。胶乳成分较为复杂,主要含有天然橡胶、碳氢化合物、水、树脂、油脂和蛋白质等[6]。Wang等[37]从橡胶树全胶乳及胶乳各个组分中提取蛋白质进行蛋白质组研究,在植物酚抽提法的基础上,优化了一套适合分离橡胶树胶乳及纯化其不同组分的技术。还建立了一种能够提取全胶乳、黄色体、橡胶粒子和C-乳清蛋白质的新方法来满足蛋白质组研究要求。随后利用2-DE结合差异凝胶电泳（DIGE）技术,首次公布橡胶树胶乳全蛋白凝胶图谱,质谱鉴定143个乙烯响应蛋白。Habib等[38]在C-乳清、黄色体和橡胶粒子层中获得蛋白包括：磷酸化、赖氨酸乙酰化、N端乙酰化、泛素化和羟基化等在翻译后的蛋白修饰作用,为胶乳蛋白质功能研究提供很大帮助。利用iTRAQ标记共获得1600个胶乳蛋白,其中404个蛋白是响应乙烯刺激调控,再通过磷酸化蛋白质组技术,鉴定了胶乳中59个磷酸化蛋白质[39]。Wang等[40]对胶乳不同组分蛋白质组分进行亚细胞分析,获得了橡胶粒子蛋白质组的可视化图谱,并在乳胶的橡胶粒子洗脱液（WS）、CS和RPs中共鉴定数千种特有蛋白质,发现WS中含有天然橡胶生物合成的关键酶。差异蛋白分析了可能的生物学功能及后续部分功能验证,然而,橡胶生物合成的相关基因并没有受到明显诱导调控,在乙烯刺激胶乳增产主要体现在蛋白质翻译后修饰水平,这也是阻碍橡胶合成调控机理研究进度的重要因素。这项研究是橡胶树胶乳定量蛋白质组研究中获得重要突破性进展。
近些年橡胶树胶乳蛋白质组研究共有26篇文献,根据内容分类发现,胶乳中橡胶粒子蛋白组研究文章占28%,RPs蛋白组研究是破解天然橡胶生物合成机制重要部分。胶乳蛋白生物学功能分类研究占20%,植物防御和橡胶过敏原研究占12%,其它研究占比较少（图1）。
2.2.1 橡胶粒子蛋白质组研究 橡胶粒子是胶乳的主要成分之一（约占胶乳总体积的30%~50%）,平均直径约为1 μm,外面仅由一层约2.5 nm厚的单位生物半膜包。RPs根据直径的不同,通常人们把大于800 nm和小于200 nm的橡胶粒子分别称为大橡胶粒子（LRPs）和小橡胶粒子（SRPs）,相对分子质量为22 kDa的SRPP会与SRPs紧密结合,并且在胶乳中大量表达[41]。乳管细胞内的RPs特别是SRPs是进行橡胶生物合成的主要场所,也是天然橡胶贮存的重要细胞器[42]。橡胶粒子是一种由ER发育而来的特殊细胞器[24],具有磷脂单分子层膜结构特征,膜上富含膜蛋白,这些膜蛋白主要参与调控IPP的合成及类胡萝卜素形成等生物学过程[5]。
橡胶粒子作为乳管细胞质中的重要细胞器,参与了橡胶分子的聚集和延伸[43]。其中,LRPs中包含有分支的橡胶分子,而SRPs中却没有链结形成的分支点。靠近木质部形成层的乳管层中SRPs含量较多,而靠近外表皮的乳管层中LRPs含量较多;从新鲜胶乳中分离出的SRPs具有更高的RT-ase活性[44]。橡胶树中REF、SRPP和银胶菊中的SRPP同源物GHS在橡胶的延伸过程中有正向调节作用,体外实验发现异源表达的GST-SRPP和His-GHS融合蛋白增强了RPs利用IPP的活性,而对REF和SRPP的抗体免疫抑制却减少IPP的利用活性[45]。在橡胶草中沉默SRPP也明显抑制了橡胶合成,说明SRPP很可能是橡胶合成复合体比REF更重要。在橡胶粒子膜上分离出520个蛋白质,质谱鉴定大多高丰度蛋白点为REF和SRPP蛋白的异构体[46]。研究显示,橡胶生物合成的速率和聚合程度主要受到SRPs数量和SRPP种类的影响,并且橡胶粒子中存在非胶组分具有高度的物种特性,可以影响不同植物橡胶的性质[47]。
2.2.2 C-乳清蛋白组研究 2008年,闫洁等[48]在死皮和正常橡胶树中,C-乳清中蛋白表达显著变化,共有40个差异蛋白,并通过质谱鉴定了其中27个蛋白质可能参与了死皮发生和发展的过程。2009年,不同采胶强度下C-乳清的蛋白研究发现,采胶强度高比采胶强度低胶乳C-乳清下调的蛋白质数量更多,而上调的蛋白质数量更少,并且随着采胶强度相差越大,下调与上调的比例也越大[49]。在死皮胶乳的乳清蛋白组的研究中,结果发现REF和SRPP积累明显增加,这暗示着2种蛋白质可能参与了橡胶树死皮应答过程。魏芳等[50]选取采胶强度为严重过度、适中、严重不足的橡胶树胶乳,提取C-乳清中的蛋白质进行比较分析,结果发现不同采胶强度下的C-乳清中存在十几个差异蛋白。在高产和低产胶橡胶树的胶乳差异蛋白对比时,在C-乳清中的上调蛋白数量较少,下调蛋白数量较多,并且随着采胶强度的增加,其上调与下调差异蛋白比例也相应增大。通过研究不同采胶强度下的橡胶树胶乳C-乳清蛋白质差异,找出采胶强度与胶乳C-乳清蛋白质的关系,利用这种关系进行乙烯刺激采胶强度的判断,进而可指导采胶生产和产胶机理研究。
2.2.3 黄色体蛋白质组研究 橡胶树胶乳中黄色体是一种特化的植物液泡,占乳管细胞内比例很大的一种细胞器,其含量约占胶乳鲜重的15%~30%。在橡胶树正常树皮与死皮树的黄色体中有24个差异蛋白,这些差异蛋白可能参与死皮的发生和发展过程,其中一个渗透蛋白质与死皮病的发生呈正相关[51]。黄色体破裂后会释放pH约为5.5的内含物：B-乳清。B-乳清中含有橡胶素、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、大量二价阳离子、防卫蛋白和可溶性蛋白质等物质。B-乳清的主要作用是在橡胶树受到破坏时胶乳中能使RPs失去稳定性后凝集,加快网络蛋白结合[52],在电镜下观察乳管伤口附近的网状结构是由蛋白质构成,称为“蛋白质网”[53],促进胶乳快速凝固加快伤口封闭。据推测,该网还可能是一个化学防护物,主要成分来自于排胶过程中黄色体破裂后释放的防卫蛋白和结合相关酶等内含物相互作用的结果[54]。病原入侵能够提高黄色体内源几丁质酶和葡聚糖酶的活性抑制病原菌增生和生长快速闭塞受侵害部位,不但提供一个物理屏障防止胶乳外流,同时也是一个生化屏障免受病原体侵入乳管细胞内从而产生病变的作用[52]。
2.3 乙烯/茉莉酸/割胶刺激使橡胶树增产的蛋白组研究
研究发现RPs膜上存在乙烯/茉莉酸信号响应蛋白,所以采胶时常用乙烯/茉莉酸刺激割胶部位,延长排胶时间提高产胶量[55]。乙烯处理橡胶树幼苗后,蔗糖含量显著下降,在2-DE图谱中有66个蛋白质点的丰度发生显著变化,其中54个蛋白质表达高调,这些蛋白质主要与筛管中碳水化合物的运输及代谢相关。另外,还发现质膜H+-ATPase的基因与蛋白表达水平变化趋势具有一致性[56],说明乙烯刺激提高了筛管的传输效率,并促进了筛管的能量和蔗糖消耗。在乙烯刺激胶乳乳清iTRAQ标记时,SRPP和REF蛋白也会大量积累,这可能是SRPP和REF存在响应乙烯刺激结构域,从而使橡胶粒子之间相互作用后具有一定的富集作用。随后,Tong等[57]乙烯处理橡胶树后,在胶乳的橡胶粒子对选定的REF（Hevb 1）、SRPP（Hevb 3）和蔗糖磷酸合酶蛋白进行免疫印迹分析,结果发现不同pI和分子量的SRPP存在多个不同亚型蛋白,并且REF2、SRPP1和SRPP3的蛋白在胶乳中均高表达[39, 57]。SRPP和REF的mRNAs在乳管层和胶乳中高表达,并且割胶刺激也会使其高表达[58],免疫金电镜发现SRPs分布于靠近形成层的传导韧皮部中,而REF在所有乳管层均有分布。REF在橡胶合成中的作用可能是辅助性的,而SRPP同源物只能在产生高分子量橡胶的物种中发现（如巴西橡胶树和银胶菊）,在低分子量橡胶的物种（如无花果和孟加拉榕）中并未发现。所以SRPP在橡胶合成延伸过程中可能比REF具有更大的作用[23]。虽然REF和SRPP具有多种型,不同橡胶树无性系的乳胶的REF和SRPP的磷酸化修饰对于橡胶合成可能至关重要,但他们中很少与产胶量或对乙烯刺激的响应相关[52],这与乙烯刺激产胶机理之间的联系还需深入探究。另一方面,乙烯刺激后还能够促使RPs上的几丁质酶和1,3-β葡聚糖酶活性增强[59],并且几丁质代谢的乳胶过敏原Hevb 2和Hevb 9蛋白活性也相应增加。研究还发现,橡胶树乳管细胞内存在COI1-JAZ3-MYC2结构模块,这是响应茉莉酸特定的信号转导模块[60],进一步证实茉莉酸刺激橡胶树能够增加天然橡胶产量。通过DIGE结合iTRAQ对乙烯处理不同SRPs蛋白质组研究[61],发现许多橡胶合成相关蛋白是在乙烯的诱导下急剧高调,所有与橡胶合成相关的蛋白质都可在SRPs中检测到,说明SRPs上有许多蛋白质对乙烯刺激具有积极的反应,从而调节某些关键蛋白质的积累来刺激乳胶产生,还说明SRPs可能充当复杂的天然橡胶生物合成机器合成天然橡胶。Dai等[62]用乙烯利和茉莉酸处理橡胶树,在乳胶中共有101种蛋白质是响应乙烯利/茉莉酸调节,其中包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEP）、乙酰辅酶-A,C-乙酰转移酶（ACCT）和几种REF同种型的蛋白质均受乙烯调控参与乳胶再生。所以外施乙烯/施茉莉酸与割胶刺激增强橡胶合成的作用类似,均能延长排胶时间进而达到增产效果。综上所述,可预测天然橡胶生物合成调控机制关键在蛋白质调控层面,而橡胶粒子膜上蛋白质的调控作用是解析橡胶生物合成机制重要研究方向,如乙烯、茉莉酸和割胶刺激橡胶树的天然橡胶生物合成模式图（图2,红色剪头所指的粉红色间隔线圈出部位）。目前,推测乙烯刺激橡胶增产的机理可能是植物将大量淀粉转为蔗糖,为乳管细胞提供能量,促使蔗糖大量进入乳管细胞,以增加乳管细胞膜上酶的活性,为橡胶合成提供能量动力,从而增强乳管对蔗糖吸收,这种现象也称为“质子蔗糖共运转”效应,更加证实了乙烯刺激橡胶树增产的机理[62]。此外,对乙烯刺激不同蛋白的表达模式可能表明了橡胶生物合成具有一定的离散功能。这些结果揭示乙烯对胶乳乳清蛋白组的影响及其在胶乳产量生产中的作用机制。乙烯作为天然橡胶的产量促进剂,可引起多种复杂的生化和生理变化,其中一些与碳水化合物代谢、植物应激、防御相关反应、细胞稳态及橡胶生物合成均有关[63]。然而,为什么橡胶树能高产胶乳及橡胶树在近一个世纪如何被驯化等是产胶植物研究中长期悬而未决的重大科学问题,随着组学技术的发展,阐明乙烯、茉莉酸和割胶增产的精确调控机制将会越发清晰。
3 其他产胶植物蛋白质组学研究
自然界中产胶植物有2500多种,虽然绝大多数产胶植物的胶乳中不含天然橡胶,但乳白色胶乳也有不少共性,很多植物胶乳中均含有天然橡胶类似组分或者前体物质。橡胶草（Taraxacum kok-saghyz L. Rodin, TKS）和银胶菊（Parthenium argentatum Grey）体内的橡胶与巴西橡胶树所含的天然橡胶结构和性能类似[64],这3种橡胶植物被称为世界三大产胶植物。橡胶草根部可产生高质量的天然橡胶,根部含胶量最高可达28%,是最有潜力替代橡胶树生产天然橡胶的产胶植物[65]。2017年橡胶草基因组测序工作由中国科学家率先完成,基因组大小为1.29 Gb,预测含有46 000多个编码蛋白的基因[66]。橡胶草基因组草图的公布大大降低克隆橡胶生物合成的关键基因的难度,加速推进基于基因组信息的农艺性状的关联分析。在蛋白组研究方面,2012年,Wahler等[67]通过橡胶草近亲物种短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）的胶乳蛋白,首次报道蒲公英属胶乳的凝胶图谱,蛋白质功能分类显示,胶乳蛋白富含与脂质代谢和运输蛋白较多,而参与应激反应的蛋白质相对较少。2019年,Xie等[68]鉴定了橡胶草成熟根全蛋白,其中MVA和MEP途径的蛋白几乎全部鉴定,但每种蛋白的家族成员鉴定还不够全面,有些蛋白在成熟期并未表达,还需外界刺激使蛋白产生作用。随后,Benninghaus等[69]成功地建立了高质量的橡胶草蛋白质组数据集,精确地区分不同营养阶段根系和非根系生理过程,鉴定出乳胶中多种特异性蛋白,其中类脂蛋白类似的蛋白迄今为止尚未在植物中进行讨论。研究结果有望作为在植物与环境相互作用过程中对乳胶进行有价值的前瞻性分析基础,从而阐明整个植物乳胶的进化关系。橡胶草在很大程度上是未被驯化的,并且存在一些固有的问题,如自交不亲和性,在发芽期间需稳定水分含量,生长速度慢,与杂草之间的竞争力差,仅成熟时可测量有生产意义的橡胶含量,以及自身与蒲公英属的其他成员高度杂合等缺点[70]。因此,橡胶草在成为商业上可行且具有竞争力的橡胶作物之前,还需通过分子育种和常规育种手段提高橡胶产量是必不可少的。早期橡胶草研究主要着眼于含胶量提取、品种筛选及田间试种等方面,在蛋白组研究方面刚刚起步,研究所涉及内容较少。橡胶草基因组草图的公布,将为橡胶草蛋白组研究的开展奠定基础。
杜仲也可产生高分子橡胶,但主要成分为反式-1,4-聚异戊二烯,与天然橡胶化学组成相同,互为同分异构体[74]。杜仲也是我国比较常见的中药药材,具有降压和强身健体的保健作用[75]。赵欣等[76]利用杜仲叶片干旱胁迫下的36个差异蛋白进行功能分析,结果显示,杜仲叶片是通过调节可溶性糖含量、胞内脯氨酸和降低胞内渗透势,从而减少水分损失的方式适应干旱胁迫。杜仲在蛋白组研究方面涉及较少,还未真正展开。我国是杜仲资源主要生产国,全球99%杜仲种植在中国,具有资源垄断式的优势[77]。因此,加快我国杜仲橡胶产业发展,不仅可改变我国长期依赖进口天然橡胶的现状,还为我国橡胶资源提供新的后备胶,从而形成以我国杜仲橡胶新兴产业为引领的国际天然橡胶市场新格局。2020年,Cherian等[8]对含胶植物体内天然橡胶的生物合成、橡胶转移酶复合物、代谢工程的进展进行归纳[78]。在田间系统化种植橡胶替代植物研究方面也达到了生产规模的要求[79,80,81],相比我国对橡胶草和银胶菊的蛋白组学研究一直处于初步探索阶段,目前作为替代产胶作物资源,在未来的轮胎市场上展现出巨大的潜力,正逐渐向商业化生产阶段发展。
4 展望
目前在产胶植物蛋白组的研究中,主要聚焦于胶乳和橡胶粒子蛋白质组的研究。然而,橡胶生物合成中涉及的每种蛋白质,以及橡胶粒子膜上的生物发生和橡胶分子量决定因素的确切信息仍然是未知。由于CPT、SRPP、REF和HRBP被确定为橡胶转移酶复合物的组分,所以天然橡胶生物合成机器的精确调控变得越来越清晰。为了揭示产胶机制,各组学将继续成为寻找橡胶转移酶复合物不可缺少的有力工具,再利用CRISPR技术,在橡胶草和银胶菊中确定基因编辑后植物的表型,可作为天然橡胶合成研究的模式植物深入研究,加速关键调控或催化基因的鉴定及高产量突变体的改进。另外,人造体外模拟功能性橡胶粒子的重建,将丰富我们对橡胶粒子生物发生和橡胶转移酶组装的认识,为非植物衍生天然橡胶的生产奠定基础。总之,橡胶植物的蛋白质组研究还处于起步快速发展阶段,需不断完善测定蛋白质内其他物质的干扰因素,需提高橡胶胶乳蛋白质中低丰度蛋白的鉴定,尽可能多维度测定消除高丰度蛋白质的影响。虽然蛋白质组研究还不够成熟,许多技术仍需改进和发展,尤其是蛋白质组学研究方法不断改进,但蛋白质组学应用于产胶植物蛋白酶鉴定研究中会更广泛,结合转基因和基因编辑等技术,展开分子育种普及和深入研究,蛋白质组用于产胶植物能够促进我国橡胶产业发展,对天然橡胶生物合成调控蛋白质组研究具有深远影响,今后蛋白质组的应用将促进我国天然橡胶产业实现可持续的多元化健康快速发展。