1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 黄瓜、西红柿、茄子、辣椒、白萝卜等样品均购自海口本地市场。
阿维菌素（B1a）标准品（1000 µg/mL）,天津农业部环境质量监督检验测试中心;氟吡菌酰胺标准品（纯度>99%）,Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇均为色谱纯,美国Fisher Scientific公司;氯化钠和无水硫酸镁均为分析纯,广州化学试剂厂;PSA吸附剂（乙二胺-N-丙基硅烷）为分析纯,安谱仪器（上海）有限公司。水为超纯水。
1.1.2 仪器与设备 Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪,美国Waters公司;AB 4500三重四级杆质谱仪,美国AB SCIEX公司;PL303电子天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;ULTRA-TURRAX T25 digital高速匀浆机,德国IKA公司;GL-10C高速离心机,上海安亭科学仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 样品的提取 采用改进的QuEChERS方法[18]对蔬菜样品中的阿维菌素和氟吡菌酰胺进行提取。首先准确称取蔬菜样品(10.0±0.1)g,置于50 mL离心管中,加入20.0 mL乙腈溶剂进行提取,在15000 r/min转速下高速匀浆1 min,使样品中目标物被充分提取;加入氯化钠2~3 g,继续在15000 r/min转速下高速匀浆1 min,通过盐析作用去除样品中的蛋白质等杂质;将离心管在4000 r/min转速下离心5 min,使液体和固体相完全分离,同时使有机相与水相分层,取上层乙腈相溶液待净化。
1.2.2 样品的净化 在10 mL离心管中预先加入100 mg的无水硫酸镁和100 mg的PSA吸附剂,准确吸取5.0 mL乙腈相溶液,加入离心管剧烈振荡2 min,以4000 r/min的转速离心5 min,取上清液2.0 mL,过0.22 μm有机相微膜,待仪器分析。
1.2.3 仪器分析条件 色谱条件：选择ACQUITY UPLC®BEH C18液相色谱柱（2.1 mm× 50 mm,1.7 μm）对样品进行分离,设置柱温为35 ℃。流动相为乙腈（A）和0.05%乙酸铵水溶液（B）,流速为0.25 mL/min,以梯度洗脱模式对目标物进行洗脱,并通过预实验对梯度模式进行优化,确保阿维菌素和氟吡菌酰胺得到良好分离。
质谱条件：选择三重四级杆质谱电喷雾正离子扫描和多反应监测模式,主要的工作条件包括喷雾电压5500 kV、雾化气压力379.225 kPa、毛细管温度600 ℃。同时检测阿维菌素和氟吡菌酰胺,其中阿维菌素的定量和定性离子对分别为m/z 890.5/305.2和890.5/567.2,碰撞能量为37/20 V,去簇电压为82 V;氟吡菌酰胺的定量和定性离子对分别为m/z 397.1/173.0和397.1/208.0,碰撞能量为40/31 V,去簇电压为87 V。
1.2.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 阿维菌素直接使用1000 µg/mL的标准储备溶液,氟吡菌酰胺使用甲醇配制1000 µg/mL标准储备溶液,并分别吸取1 mL的阿维菌素和氟吡菌酰胺储备溶液,使用甲醇稀释准确定容至100 mL,配制得到2种目标物的10 µg/mL混合标准工作液。在样品测定时,分别使用蔬菜样品的空白提取液逐级稀释配制系列基质标准溶液,浓度分别为0.005、0.02、0.05、0.20、0.50 µg/mL。以进样标准溶液中目标物的浓度（µg/mL）作为横坐标,以定量离子的峰面积作为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.5 基质效应 为评价不同蔬菜基质对阿维菌素和氟吡菌酰胺定量的基质效应,分别以0.05 µg/mL的基质标准和纯溶剂标准溶液上机测定,记录测定结果并分析不同蔬菜的绩效效应。使用公式（1）计算样品的基质效应[19],并对其进行评价。
蔬菜基质效应=蔬菜基质标准溶液响应值/纯溶剂标准溶液响应值×100%
2 结果与分析
2.1 提取条件的优化
分别测试了100 mg的3种不同吸附剂（弗罗里硅土、C18和PSA）对黄瓜、西红柿、茄子、辣椒、白萝卜样品中目标物质的净化能力,结果见图1。结果表明,弗罗里硅土吸附剂对阿维菌素存在较强的吸附,其回收率仅为54%~64%,不能满足分析的需求;PSA和C18粉末对阿维菌素和氟吡菌酰胺均可以取得较好的净化效果,回收率均大于80%,可满足分析的需求。由于PSA粉末成本较低,因此在后续试验中选择PSA粉末进行样品净化。
2.2 质谱条件的优化
采用多反应监测模式进行检测,分别以0.5 µg/mL的阿维菌素和氟吡菌酰胺标准溶液直接注入电喷雾离子源中,优化其质谱条件。在正离子检测方式下进行一级质谱分析,分别得到阿维菌素和氟吡菌酰胺稳定且丰度高的母离子碎片。对比了阿维菌素分别为加氢、钠和铵的母离子,发现加铵母离子的信号强度比其他2种模式提高了100倍以上,因此选择[M+NH4]+作为阿维菌素的母离子,其m/z为890.5;氟吡菌酰胺的加氢母离子具有良好的灵敏度,选择[M+H]+作为氟吡菌酰胺的母离子,其m/z为397.1。以母离子作为目标碎片,优化质谱的去簇电压,确定阿维菌素和氟吡菌酰胺的去簇电压分别为82.1、87.0 V。分析母离子的二级质谱碎片,得到二级质谱碎片的全谱信息,选择信号强度最高的两个离子分别作为定量和定性离子,并进一步仪器的碰撞电压。方法的具体质谱条件见表1,分别选择阿维菌素和氟吡菌酰胺的信号最强碎片离子m/z 305.2和m/z 173.0作为方法的定量离子。
表1 阿维菌素和氟吡菌酰胺的质谱检测参数Tab. 1 Mass spectrometric parameters for abamectin and fluopyram |
| 分析物Analytes | 母离子Parent ion m/z | 子离子 Product ion m/z | 碰撞电压DP/V | 去簇电压CE/V |
|---|---|---|---|---|
| 阿维菌素 | 890.5 | 305.2* 567.2 | 37 20 | 82.1 82.1 |
| 氟吡菌酰胺 | 397.1 | 173.0* 208.0 | 40 31 | 87.0 87.0 |
注：*表示定量离子。 | |
Note: * means quantitation ion. |
2.3 色谱条件的优化
质谱检测器具有多通道模式,可以实现分析目标物的良好分离。因此,在色谱条件中重点考虑提高阿维菌素和氟吡菌酰胺的分析灵敏度。考虑到阿维菌素在质谱条件下的母离子为加铵模式,因此在流动相中加入0.05%乙酸铵（V/V）,可提高阿维菌素的分析灵敏度5倍左右,同时对于氟吡菌酰胺的分析灵敏度没有显著影响。选择乙腈（A）和0.05%乙酸铵水溶液（B）作为流动相,通过调整梯度洗脱中2种流动相的比例,确保阿维菌素和氟吡菌酰胺的快速流出,同时具有良好的分离度。最终确定的洗脱程序为：0~1.0 min,25% B;1.0~4.5 min,60% A;4.5~ 5.5 min,25% A。在该条件下,阿维菌素和氟吡菌酰胺的保留时间分别为3.50 min和2.84 min左右,可在实现快速检测的同时获得良好的检测效果。其中,蔬菜样品（黄瓜）的典型色谱图见图2。
图2 蔬菜样品（黄瓜）基质中阿维菌素和氟吡菌酰胺（0.005 µg/mL）典型色谱图A1、A2、A3：分别为阿维菌素的黄瓜空白、基质标准和添加回收样品;B1、B2、B3：分别为氟吡菌酰胺的黄瓜空白、基质标准和添加回收样品。 Fig. 2 Typical chromatogram of abamectin and fluopyram in cucumber (0.005 µg/mL) A1, A2 and A3: Blank, standard in matrix solution and recovery samples of abamectin; B1, B2 and B3: Blank, standard in matrix solution and recovery samples of fluopyram. |
2.4 基质效应
分别检测了黄瓜、西红柿和茄子这3种不同蔬菜样品基质对阿维菌素和氟吡菌酰胺的基质效应,结果见图3。根据结果,基质效应分别为84%~ 92%和96%~107%,说明基质效应对样品定量存在一定影响。为去除蔬菜样品在阿维菌素和氟吡菌酰胺测定过程中的基质效应,在测定实际样品时,均采用对应样品的空白溶液配制基质标准,并绘制标准曲线对目标物进行定量。
2.5 方法的线性范围和检出限
表2 阿维菌素和氟吡菌酰胺在3种蔬菜基质中的标准曲线Tab. 2 Standard curves of abamectin and fluopyram in 3 kinds of vegetables |
| 基质 Matrixs | 化合物 Compounds | 回归方程 Regression equation | 相关系数 Correlation coefficient |
|---|---|---|---|
| 黄瓜 | 阿维菌素 | y=6.02×106x+4.43×104 | 0.9995 |
| 氟吡菌酰胺 | y=3.17×107x-2.93×105 | 0.9993 | |
| 西红柿 | 阿维菌素 | y=6.16×106x+2.56×104 | 0.9994 |
| 氟吡菌酰胺 | y=3.31×107x+1.59×105 | 0.9995 | |
| 茄子 | 阿维菌素 | y=5.59×106x+3.28×104 | 0.9991 |
| 氟吡菌酰胺 | y=2.79×107x+8.72×105 | 0.9993 |
2.6 回收率与精密度
表3 阿维菌素和氟吡菌酰胺在3种蔬菜中的添加回收率及相对标准偏差（n=5）Tab. 3 Recovery and RSD of abamectin and fluopyram in 3 kinds of vegetables matrix (n=5) |
| 基质 Matrix | 化合物 Compound | 添加水平Spiked level/(mg·kg-1) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.01 | 0.02 | 1.0 | |||||
| 平均回收率 Recovery/% | RSD/% | 平均回收率 Recovery/% | RSD/% | 平均回收率 Recovery/% | RSD/% | ||
| 黄瓜 | 阿维菌素 | 106 | 3.6 | 96 | 2.0 | 105 | 5.2 |
| 氟吡菌酰胺 | 98 | 6.1 | 91 | 3.9 | 101 | 3.5 | |
| 西红柿 | 阿维菌素 | 106 | 1.2 | 83 | 3.4 | 91 | 1.0 |
| 氟吡菌酰胺 | 108 | 1.4 | 96 | 1.2 | 102 | 8.4 | |
| 茄子 | 阿维菌素 | 91 | 3.2 | 101 | 1.4 | 90 | 0.5 |
| 氟吡菌酰胺 | 93 | 1.8 | 103 | 3.2 | 90 | 1.6 | |
2.7 实际样品检测
在海口本地市场抽取的黄瓜、西红柿、茄子、辣椒、白萝卜共5种蔬菜样品,每种各40个,利用本方法进行检测,所有样品均配制基质标准进行定量分析。结果表明,所抽取的蔬菜样品均未检出阿维菌素和氟吡菌酰胺。本方法具有良好的灵敏度和的重现性,可用于满足市场样品监测的需求。
3 讨论
3.1 阿维菌素和氟吡菌酰胺质谱碎片的选择
阿维菌素是一种十六元大环内酯化合物生物农药,其分子结构中含有大量的羟基。质谱ESI离子源属于一种软电离源,常规的化学分子在离子源正离子模式下有加氢、加钠和加铵3种模式。由于阿维菌素分子量较大,并且含有大量的羟基,其加钠和加铵的信号大于加氢的信号,因此现有报道通常选择加钠和加铵离子作为检测的母离子[20]。但是钠离子不易挥发,容易对质谱造成污染,因此本研究在流动相中加入乙酸铵,保证了目标物形成稳定的母离子,并进一步激发获得子离子,提高了阿维菌素检测的灵敏度和稳定性。与阿维菌素相比,氟吡菌酰胺分子量相对较小,在ESI离子源正离子模式下加氢峰信号稳定、灵敏,因此选择其加氢峰进行分析。
3.2 阿维菌素和氟吡菌酰胺在质谱中的基质效应
串联质谱在复杂样品的农药残留分析时容易受到基质效应的干扰,对结果产生影响。本研究针对可能使用阿维菌素和氟吡菌酰胺防治根结线虫的作物,如黄瓜、西红柿、茄子,其基质中含杂质较少。同时,本研究建立的方法通过PSA和C18粉末对样品中极性和非极性杂质进行净化,均可以有效降低不同样品中杂质的影响。根据结果,阿维菌素和氟吡菌酰胺的基质效应分别为84%~92%和96%~107%,方法的回收率和RSD均满足检测要求[19],可很好的满足样品中阿维菌素和氟吡菌酰胺残留量的检测分析要求。
3.3 阿维菌素和氟吡菌酰胺的检测灵敏度
阿维菌素和氟吡菌酰胺混用防治蔬菜根结线虫,近年来在生产中广泛使用,其可能的残留为蔬菜带来潜在的安全风险。其中阿维菌素为非内吸性农药,并且阿维菌素的半衰期较短,在灌根的施药方式下,植株果实不直接接触药剂,因此阿维菌素在蔬菜中残留量极小[21]。氟吡菌酰胺则为内吸传导活性的杀菌剂,因此其在灌根使用后可能在植株果实中残留。我国食品安全国家标准中规定,阿维菌素和氟吡菌酰胺在蔬菜中的最大残留限量最低值均为0.01 mg/kg,因此阿维菌素和氟吡菌酰胺的检测方法需要极高的灵敏度。本研究建立的分析方法中,阿维菌素和氟吡菌酰胺的检出限分别达到1.0、0.2 µg/kg,可以很好的满足检测的需求。