开花是植物由营养生长向生殖生长的转变过程,是植物个体发育和繁殖的关键环节,适时开花对植物的繁殖成功至关重要[1],故关于开花的课题属于热点研究。与草本植物相比,木本果树通常具有较长的童期,严重制约木本果树新品种的选育,直接影响经济效益。因此,对木本果树成花分子机制开展研究具有重要的意义[2]。
植物成花过程受内部遗传因子和外界环境因素的协同诱导[3],涉及复杂的基因调控网络途径主要包括：光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径、温敏途径和年龄途径[4,5]。许多植物需要一段时间的低温春化作用才能开花[6],FRIGIDA（FRI）和FLOWERING LOCUS C（FLC）是拟南芥春化途径中的关键调控基因,FRI通过促进FLC的表达延迟植物的开花时间[7]。自然条件下拟南芥开花时间的多样性可归因于FRI显性基因的等位变异,冬性生态型拟南芥通常具有FRI显性基因,能促进开花抑制基因FLC的高表达,造成晚花表型[8],而丧失功能（即显性基因等位突变）的FRI使FLC表达量降低,则出现早花表型[9]。Risk等[10]发现拟南芥中至少有7个FRI同源基因构成FRIGIDA基因家族。目前对FRI基因的研究主要集中在模式植物拟南芥和一些依赖春化作用来促进成花的植物上,木本植物也只在雷竹[11]、枳[12]和银杏[13]中有报道。
芒果（Mangifera indica L.）是漆树科芒果属的多年生木本植物,是重要的热带亚热带经济果树。芒果实生苗需要经历较长的童期才能开花结果,严重制约了芒果新品种的选育进程。目前在芒果成花研究中已有一些成花基因的研究报道[14],但还尚未有FRI基因的报道。本研究在前期研究的基础上,以‘四季蜜芒’为材料,对通过RT-PCR法获得的2个MiFRI基因序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR分析这2个基因在不同组织不同时期的表达模式,为深入研究该基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以‘四季蜜芒’（Mangifera indica L cv. ‘Sijimi’）为供试材料,栽培于广西大学农学院教学科研基地果树标本园。基因克隆样品叶片采集于2018年11月5日;组织器官和不同发育时期样本分别采集于2018年11月5日、2018年12月5日、2019年1月4日、2019年1月29日的叶、茎、芽以及2019年3月6日的叶、茎、花。样品采集后立即放入-80 ℃冰箱冻存备用。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取及cDNA合成 使用RNA perp Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的完整性和浓度。采用宝生物工程（大连）有限公司的M-MLV逆转录酶cDNA第一链合成,反应体系与程序参照试剂盒说明书进行,琼脂糖凝胶电泳检测逆转录效果。逆转录合成的cDNA用于后续基因克隆和表达模式分析。
1.2.2 芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆 根据前期芒果转录组获得的2个FRI基因全长序列,设计扩增基因编码区的特异引物FRI1-F/R和FRI2-F/R（表1）,以‘四季蜜芒’叶片的cDNA为模板,进行RT-PCR扩增。PCR反应体系为：10 mmol/L dNTPs 0.5 µL、10×PCR buffer 2.5 µL、10 µmol的上下游引物各1 µL、Trans Taq 0.15 µL、cDNA模板1 µL、补超纯水至25 µL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 40 s,54 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收,连接到pMD18-T载体上,构建重组质粒,转化E. coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
表1 引物序列信息Tab. 1 Sequences information of primers |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5°-3°） Primer sequences (5°-3°) | 退火温度 Annealing temperature/℃ | 用途 Application |
|---|---|---|---|
| FRI1-F | ATGGAGCAACAAAACGCGCC | 54 | MiFRI1克隆 |
| FRI1-R | TTATTGACATCGATTGATGCTGG | ||
| FRI2-F | ATGGCGACACTTGAAACAAT | 55 | MiFRI2克隆 |
| FRI2-R | CTACTGAGGGTAGTAAGATGG | ||
| qFRI1-F | ATGGAATGCATGTTGAAGCA | 60 | MiFRI1 qRT-PCR |
| qFRI1-R | AAGAAGCTTGGCAGGATCAA | ||
| qFRI2-F | GGAAGCCACAAAAGATTGGA | 60 | MiFRI2 qRT-PCR |
| qFRI2-R | ATACGACCTGCTGGGTGAAC | ||
| qActin1-F | CCGAGACATGAAGGAGAAGC | 60 | qRT-PCR内参基因 |
| qActin1-R | GTGGTCTCATGGATACCAGCA |
1.2.3 生物信息学分析 运用BioXM 2.6软件对获得的基因核苷酸序列进行氨基酸序列推测;用在线软件ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白分子质量;利用Conserved Domain Search（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测蛋白的保守结构域;在NCBI下载FRI氨基酸同源序列,使用DNAMAN 5.2.2软件进行序列比对和同源性分析,用MEGA 6.0软件构建系统发育树。
1.2.4 芒果MiFRI1和MiFRI2基因表达特性分析 以芒果MiActin1为内参基因[15],根据基因序列设计荧光定量引物（表1）,分别提取芒果不同部位的总RNA,采用宝生物工程（大连）有限公司的M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链,实时荧光定量PCR所用仪器为ABI 7500 Real Time PCR仪（Applied Biosystems,美国加利福尼亚）,反应体系和程序参照SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ试剂（TaKaRa,中国大连）说明书。具体如下：以50 µg/L的cDNA为模板,反应体系（20 µL）：SYBRⅡ 10 µL,ROXⅡ 0.4 µL,cDNA 2 µL,上下游引物各0.5 µL,超纯水6.6 µL。反应程序为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火34 s,40个循环;循环结束后95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s进行熔解。每个样品重复3次,采用2-ΔΔCT法[16]计算基因的相对表达量。使用SPSS 22.0软件对数据进行差异显著性分析（P<0.01）,用Excel 2016绘制表达图。
2 结果与分析
2.1 芒果MiFRIs基因的克隆与序列分析
在前期芒果转录组研究中获得2个FRI同源基因,分别命名为MiFRI1和MiFRI2。为了验证基因序列的正确性,以‘四季蜜芒’叶片cDNA为模板,用特异性引物FRI1F/R和FRI2F/R对其编码区全长序列进行RT-PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测分别得到长度约1700~1800 bp大小的特异条带（图1）,克隆测序获得序列与转录组获得序列一致。MiFRI1基因（GenBank登录号：MT239367）编码区序列长度为1752 bp,MiFRI2基因（GenBank登录号：MT239368）编码区序列长度为1815 bp,分别编码584、605个氨基酸（图2）,蛋白质分子质量分别为64.98、66.86 kDa。
2.2 芒果MiFRIs同源性及进化树分析
通过NCBI-Conserved Domain Search预测到2个MiFRIs都含有Frigida结构域,属于FRIGIDA基因家族（图3）。经同源性分析结果显示,MiFRI1 和MiFRI2基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为39.89%和19.22%,同源性较低。芒果MiFRI1与柑橘CcFRI（XP_006437019.2）、甜橙CsFRI（XP_006485045.1）、龙眼DlFRI（AIN75611.1）编码氨基酸的同源性分别为56.65%、56.65%和53.23%,MiFRI2与阿月浑子PvFRL 1（XP_ 031253371.1）同源性为74.00%。使用DNAMAN 5.2.2将2个MiFRIs的氨基酸序列与上述物种氨基酸序列进行多序列比对,结果显示,FRI氨基酸序列整体保守性较低,但MiFRI1、CsFRI、CcFRI和DlFRI之间保守性较高,MiFRI2与PvFRL1彼此间也很保守（图4）,说明同一类型基因在不同物种间具有保守性,推测MiFRI1和MiFRI2可能属于不同类型的FRI家族。
从NCBI数据库下载不同物种FRIGIDA和FRIGIDA-like（FRL）的氨基酸序列,用MEGA 6.0构建系统进化树,结果见图5。整个进化树被分为五类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ,芒果MiFRI1与拟南芥AtFRI、阿月浑子PvFRI、榴莲DzFRI、可可TcFRI聚在Ⅰ类,而芒果MiFRI2与拟南芥AtFRL1/2、阿月浑子PvFRL、榴莲DzFRL1/2、可可TcFRL1/2聚在Ⅱ类,说明MiFRI1和MiFRI2属于FRIGIDA家族不同类型的亚族,MiFRI1属于Ⅰ类亚族,MiFRI2属于Ⅱ类亚族。
2.3 芒果MiFRIs基因的组织表达特性分析
为了探讨MiFRIs基因在芒果成花过程中的表达特性,利用实时荧光定量PCR技术检测MiFRI1和MiFRI2在‘四季蜜芒’不同花发育阶段不同组织中的表达模式。结果显示,MiFRI1和MiFRI2在不同时期内的各组织中均表达,但在各个组织中表达水平存在差异（图6）。
MiFRI1基因从营养期到花芽分化前期之间的各个组织中表达水平均偏低,而从花芽分化期开始,其表达水平在叶片和芽中迅速上升。MiFRI1基因的表达最高峰出现花芽分化后期的叶中,而此时MiFRI1基因在顶芽中也达到表达高峰,而在花序伸长及开花期的叶片和花中的表达水平则有所下降,但依然极显著高于营养时期相应的组织,但在茎中的表达一直维持在较低的水平。MiFRI2基因在不同组织中的表达模式存在差异。在叶片中,MiFRI2基因表达水平先下降后上升,表达高峰出现在花芽分化后期,而后稍微有些下降,这与MiFRI1基因在叶片中的表达模式类似。在茎中,MiFRI2基因呈现先上升再下降的表达模式,这与MiFRI1基因相反。在顶芽中,MiFRI2基因的表达水平为先下降后上升,从营养期到花芽分化前期之间的表达模式与MiFRI1基因类似,在花芽分化后期MiFRI2基因表达水平上升,但上升幅度低于MiFRI1基因。
3 讨论
目前FRI基因已在大豆[21]、紫花苜蓿[22]、咖啡树[23]、雷竹[11]、枳[12]等物种中被分离克隆,但尚未见有芒果FRI基因的研究报道。本研究在前期研究的基础上,从芒果转录组中挖掘获得2个FRI基因,通过RT-PCR技术对其序列的准确性进行了验证。生物信息学分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2的编码区序列长度分别为1752、1815 bp,分别编码584、605个氨基酸,编码蛋白含有Frigida结构域,属于FRIGIDA基因家族。但2个FRI基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很低,进化树分析结果显示,MiFRI1与AtFRI聚类在一起,属于Ⅰ类亚族,而MiFRI2与AtFRL1/2聚类在一起,属于Ⅱ类亚族,表明二者由不同祖先进化而来。
FRIGIDA家族成员基因在被子植物和裸子植物中广泛存在,Risk等[10]将拟南芥FRIGIDA家族的7个同源蛋白依据其N-端序列保守性分为FRI (Ⅰ)、FRL1/2 (Ⅱ)、FRL3 (Ⅲ)、FRL4a/4b (IV)和FRL5 (V)五类亚族,认为Ⅰ、Ⅱ类亚族仅在双子叶植物存在,Ⅲ、Ⅳ类亚族同时存在于单子叶植物和双子叶植物中,Ⅴ亚族只在拟南芥和毛果杨中发现。另外,Michelle等[24]研究证实拟南芥中的AtFRI和AtFRL1均为成花抑制因子,能够促进成花抑制基因FLC的表达,在AtFRI缺失时,AtFRL1具有冗余的功能。而AtFRL2存在于Landsberg erecta（Ler）型拟南芥中,属于无功能基因[25],其他亚族的功能还未见报道。
根据目前已经报道的一些物种的功能研究显示,枳中的PtFRI基因属于Ⅰ亚族,主要在叶和花中表达较高,异源表达抑制拟南芥开花[12]。雷竹是单子叶植物,PvFRL基因属于Ⅲ亚族,在营养组织和生殖器官中均有表达,但在花期表达水平明显下降,超量表达抑制拟南芥成花[11]。咖啡CaFRL4基因是Ⅳ亚族,主要在叶片中表达[23]。而银杏属于裸子植物,GbFRI基因在雄花中高度表达,而在叶中表达水平最低[13]。在其他植物中,拟南芥中的AtFRI基因在各个组织中的表达水平均很低,主要在发育中的种子中表达,而AtFRL2基因在各个组织中表达水平也很低,但在发育中的种子和花粉中具有较高的表达水平[10]。油菜BnaA.FRI.a基因在叶和茎中少量表达,而在花芽和花中高表达[26]。油菜中的BnaA3.FRI基因在种子中表达水平最高,其次在根、叶、芽中表达,在茎中最低[27]。白菜中的BrFRIa和BrFRIb基因的表达水平与成花时间早晚不相关,但超量表达的BrFRIb可延迟转基因拟南芥成花[28]。上述研究结果表明,不同物种中的FRI基因的表达模式存在差异,但功能相对保守,均抑制转基因植株成花。本研究中,MiFRI1和MiFRI2在‘四季蜜芒’成花过程中不同时期内的各组织中均有表达,其中MiFRI1基因主要在花芽分化后期的叶和芽/花中高度表达;MiFRI2基因主要在营养期的顶芽和花芽分化后期的叶片中高度表达。这与雷竹中的PvFRI-L基因花期表达水平下降的模式存在差异。2个MiFRIs基因在营养芽转向花芽发育的过程中的顶芽中表达水平下降,但在花芽分化后期的芽中表达水平又再次上升,且MiFRI1基因的上升水平显著高于MiFRI2基因。说明MiFRIs基因与芒果的成花有关,但2个基因发挥的功能强弱可能存在差异,有待进一步研究。