石斛为兰科石斛属（Dendrobium）植物,是重要的药用植物和观赏植物[1]。在观赏应用方面,石斛兰因其花色鲜艳、花形花姿优美、花期长,深受各国人们的喜爱,与卡特兰（Cattleya）、蝴蝶兰（Phalaenopsis）、万代兰（Vanda）并列为观赏价值最高的“四大观赏洋兰”。目前,观赏石斛兰主要分为两大类,一类是金钗型石斛兰,也就是通常说的春石斛,这一类石斛兰的特点是花序从假鳞茎的结上长出,几乎每个假鳞茎的结都可以长出花序,每个花序着花3~4朵,这一类石斛兰喜欢冷凉环境,花芽分化需要低温、干旱的刺激,春季开花;另一类为蝴蝶型石斛,也就是通常说的秋石斛,这一类石斛兰花序着生于假鳞茎顶部,每个假鳞茎生长1~3个花序,每个花序着花7~30朵,有的品种可达40朵以上[2],这一类石斛兰喜欢较高温环境,开花需要短日照刺激。
秋石斛为附生兰,主要生产于热带亚热带地区,如泰国、新加坡、马来西亚、印度尼西亚、澳大利亚、夏威夷等。秋石斛已成为这些国家和地区花卉产业的重要组成部分,如世界兰花出口第二大国的泰国,秋石斛是出口创汇的主要花卉,2012年兰花切花的出口额达到6360万美元,其中秋石斛切花占到94.73%,盆花出口额达到1780万美元,秋石斛占到51.40%[3,4]。我国大陆在改革开放之后才开始引种秋石斛,主要在海南、广东、广西、福建及云南等地栽培,开始主要以生产切花为目的,但由于自然环境等因素,切花产量及质量均不如热带地区,因此多数以失败而告终。近年来,根据自然环境和市场需求的变化,国内的秋石斛生产主要以盆花为主,并且发展迅速,年出圃量已经超过1000万株,产值超过1.5亿人民币,而且带动了栽培基质、物流运输、农民就业等的发展,是热区农业发展的朝阳产业。
但是我国秋石斛产业起步较晚,随着产业的迅速发展,许多限制产业发展的因素开始显现出来。如缺少自主知识产权的新品种,缺少种苗繁育技术等,近年来虽然育有少量的品种,但主要是以观赏性状为主要育种目标,极少关注新品种的耐寒性问题,如‘广林紫嫣’[5]、‘广林紫韵’[6]、‘锦云’[7]、‘万泉宝石’[8]、‘朝阳’和‘白雪’[9]等。秋石斛原产热带亚热带地区,适宜的生长温度为25~30 ℃,低于15 ℃时营养生长会全部停止,12 ℃左右的低温,可使叶片全部脱落,长时间7 ℃左右的低温会造成深度伤害,很难恢复[10]。但由于我国自然环境与热带地区有明显的差别,冬季平均气温或者极限低温要低于热带地区,导致很多从国外引进的品种在冬季低温季节易受低温严寒伤害,不仅限制了秋石斛冬季的供花,而且由于低温伤害还影响了来年的开花质量和品质[11]。但我国秋石斛的基础研究仍然比较薄弱,对秋石斛的耐寒性研究比较欠缺,仅有少量的文献报道,如何嘉琦等[11,12]通过自然低温条件下的秋石斛田间表型评价发现在13~18 ℃的持续低温条件下大部分品种出现严重的黄落叶现象,秋石斛‘三亚阳光’幼苗在低温处理条件下可溶性蛋白质、叶绿素、丙二醛（MDA）、游离脯氨酸发生了不同程度的变化,而且出现大量的黄落叶现象等。
秋石斛‘三亚阳光’是目前国内市场上流通最为广泛、最受欢迎的品种,何嘉琦等[12]对‘三亚阳光’幼苗在不同程度低温胁迫下的生理响应进行了研究,为‘三亚阳光’幼苗在冬季严寒伤害的防治方面提供了理论指导。但同一品种不同苗龄的植物对低温胁迫的抗性及生理响应是不一致的,本研究以秋石斛‘三亚阳光’中苗为研究对象,分析其耐寒生理指标在不同程度低温胁迫下的变化规律,探索其对不同程度低温的耐受时间,为秋石斛‘三亚阳光’中苗低温伤害防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
用于试验的秋石斛‘三亚阳光’中苗栽植于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带兰花资源圃内。挑选移栽6个月,植株高约20~25 cm,叶片6~8片,生长状态较为一致的植株,分别置于15、10和5 ℃的人工气候箱中进行低温处理,每个温度分别处理0（CK）、1、2、4、8 h和1、2、4、8、16 d,每个处理20株,重复3次。气候箱的光照时间设为光照/黑暗=14 h/10 h,光照强度为20 000 lx,空气相对湿度为85%。
1.2 方法
1.2.1 生理指标的测定 随机剪取各处理3株的顶端全展叶片用于可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）、游离脯氨酸、叶绿素、电导率等生理指标测定,测定方法参考李合生《植物生理生化实验原理和技术》[13],每个指标重复测定3次。
1.2.2 相对电导率的测定 将供试的秋石斛植株放人工气候箱中,设置温度梯度10、5、0、-5 ℃,分别低温处理12 h,光照时间设为光照/黑暗= 14 h/10 h,光照强度为20 000 lx,空气相对湿度为85%。随机剪取3株顶端新鲜全展叶片用于相对电导率的测定,每个处理重复3次。
1.2.3 形态学指标的测定 每个处理在采集用于测定生理指标的叶片后立即移出人工气候箱,置于大棚中进行常规栽培,10 d后观察恢复情况和统计落叶率（落叶率=掉落叶片数/总叶片数×100%）。
1.3 数据处理
数据的平均值、标准差、显著性分析、相关性分析及主成分分析通过SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, Illinois）软件进行。
2 结果与分析
2.1 不同低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’中苗生理指标的影响
2.1.1 不同低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’中苗可溶性蛋白含量影响 可溶性蛋白是植物抵抗低温胁迫的重要物质。由图1A可见,秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片的可溶性蛋白含量在15、10、5 ℃低温胁迫下均呈现出下降-上升-下降-上升的变化趋势。在低温胁迫条件下,可溶性蛋白含量在处理开始后显著下降,1 h之后显著上升,15 ℃和10 ℃处理的到2h之后又开始下降,而5 ℃处理继续显著上升,至4 h之后才开始又显著下降。15 ℃和10 ℃在处理4 d时达到最低点,5 ℃处理的则是在处理1 d后达到最低点之后又开始上升,10 ℃和5 ℃处理的在4 d之后含量显著上升,而15 ℃的则在8 d之后才开始显著上升。
2.1.2 不同低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’中苗可溶性糖含量的影响 在植物的抗寒生理中,可溶性糖通过提高细胞的渗透浓度、降低水势,从而降低植物的冰点。由图1B可见,秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片的可溶性糖含量在15、10、5 ℃低温胁迫开始时均呈现略微的下降,在15 ℃条件下处理1 d时降到最低,之后开始显著上升,而10、5 ℃条件下均是在处理8 h后开始显著上升。
2.1.3 不同低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’中苗游离脯氨酸和MDA含量的影响 对低温胁迫下秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片的游离脯氨酸和MDA含量的测定表明,秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片的游离脯氨酸和MDA含量均随着低温处理时间的延长呈现逐步上升的趋势（图1C、图1D）。由图1C可见,15、10、5 ℃低温胁迫下,秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片的游离脯氨酸含量先出现略微的下降之后就一直呈现上升的趋势,其中,15 ℃处理在8 h之后开始呈显著性上升,而10、5 ℃则在4 h之后开始呈显著性上升。由图1D可见,MDA的含量在15 ℃处理时呈现的趋势是升-降-升-降-升,但每个处理时间点的含量均显著高于对照,而10、5 ℃处理的MDA含量则一直呈现上升的趋势,且每个处理的含量也显著高于对照。
2.1.4 不同低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片叶绿素含量的影响 由图1E可见,在不同低温胁迫下,秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片叶绿素含量随着处理时间的延长而逐渐下降,其中15 ℃处理的下降趋势比较缓慢,在处理16 d的时候叶片的叶绿素含量仍有0.30 mg/g以上,但仍显著低于对照。10 ℃处理1 d以前叶绿素含量与15 ℃处理的下降幅度基本一致,但处理1 d后下降幅度开始增大,在处理16 d时叶绿素含量降低到0.25 mg/g。5 ℃处理的叶绿素含量在处理2 h之前与10 ℃处理的降低程度一致,但在2 h之后含量迅速下降,在处理16 d时含量仅有0.21 mg/g,是3个处理温度中含量最低的。统计分析发现,3个处理温度的每一个时间点的叶绿素含量均显著低于对照。
2.1.5 不同低温胁迫下秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片相对电导率及半致死温度 随着处理温度的降低,秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片的相对电导率逐渐升高,在15、10、5、0 ℃时电导率分别为19.88%、(24.29±3.03)%、(57.20±5.53)%、(71.18±7.65)%,在-5 ℃时达到(98.20±1.35)%。根据不同温度处理下的相对电导率,拟合Logistic方程,求得‘三亚阳光’中苗的半致死温度（LT50）为5.67 ℃。
2.2 不同低温胁迫对秋石斛‘三亚阳光’中苗落叶的影响
图2 秋石斛‘三亚阳光’中苗15 ℃处理前后的情况Fig. 2 The condition of Dendrobium ‘Sonia Hiasakul’ middle age plantlet before and after 15 ℃ treatment |
图3 秋石斛‘三亚阳光’中苗10 ℃处理前后的情况Fig. 3 The condition of Dendrobium ‘Sonia Hiasakul’ middle age plantlet before and after 10 ℃ treatment |
2.3 秋石斛‘三亚阳光’耐寒性指标的相关性分析
通过耐寒性指标的相关性分析发现（表1）,可溶性糖、游离脯氨酸、MDA含量和落叶率均与LT50有极显著的正相关,而叶绿素含量与LT50呈极显著的负相关。可溶性糖含量与游离脯氨酸、MDA含量和落叶率呈极显著的正相关,与叶绿素含量呈极显著的负相关。叶绿素含量与可溶性糖、游离脯氨酸、MDA含量和落叶率呈显著或极显著的负相关。而可溶性蛋白与其他耐寒性指标均没有显著的相关性。
表1 不同程度低温胁迫下秋石斛‘三亚阳光’中苗叶片各生理指标及形态指标的相关性Tab. 1 The correlation between physiological and morphological indexes of leaves of Dendrobium ‘Sonia Hiasakul’ middle age plantlet under different degrees of low temperature stress |
| 项目 Item | LT50 | 可溶性蛋白 Soluble protein | 可溶性糖 Soluble sugar | 叶绿素 Chlorophyll | 游离脯氨酸 Free proline | MDA | 落叶率 Defoliation rate |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| LT50 | |||||||
| 可溶性蛋白 | 0.275 | ||||||
| 可溶性糖 | 0.949** | 0.145 | |||||
| 叶绿素 | -0.946** | -0.239 | -0.911** | ||||
| 游离脯氨酸 | 0.918** | 0.460 | 0.881** | -0.862* | |||
| MDA | 0.958** | 0.297 | 0.885** | -0.922** | 0.882** | ||
| 落叶率 | 0.909** | 0.551 | 0.844** | -0.838** | 0.982** | 0.888** |
注：* 表示在0.05水平上显著相关（P<0.05）,** 表示在0.01水平上极显著相关（P<0.01）。 | |
Note: * indicates significant correlation (P<0.05), ** indicates extremely significant correlation (P<0.01). |
3 讨论
低温胁迫是影响植物生长发育、地理分布等方面的主要环境因素,低温胁迫会造成植物膜系统、生理指标、酶活性、形态指标等方面的改变,从而抵抗低温的胁迫。在生理指标方面,主要的耐寒性指标有相对电导率、可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素、酶活性等,这些指标都与植物的耐寒性有密切的关系。
植物对低温的敏感程度与其起源地密切相关,温带或者寒带起源的植物经过漫长的低温驯化,对低温的敏感程度较低,耐寒性较高,如小麦、拟南芥等。而起源于热带、亚热带地区的植物对低温的敏感程度高,耐寒性较低,如水稻、大豆等。
在低温胁迫下,秋石斛‘三亚阳光’叶片的可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸、丙二醛含量总体上呈现出上升的趋势,其中可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸含量的变化与热带亚热带起源的植物果蔗[14]一致,可溶性糖和游离脯氨酸含量变化也与热带地区的海巴戟一致[23]。但温带起源的北美海棠的可溶性糖和可溶性蛋白在低温条件下呈现的是变化是先升高后降低的趋势[21],而温带起源的欧洲冬青的可溶性糖含量也是呈现先上升后下降的趋势[19]。秋石斛‘三亚阳光’中苗在低温胁迫下,MDA含量总体呈现逐渐上升的趋势,与海巴戟、木本曼陀罗、金边假连翘和双荚决明的变化趋势一致[23,24],但与同样起源于热带亚热带地区的望天树在低温胁迫下MDA含量持续下降不一致[18, 25]。研究发现,在3个不同温度低温胁迫下,秋石斛‘三亚阳光’叶片的叶绿素含量随处理温度的降低和处理时间的延长呈现持续下降的趋势,表明在低温胁迫下,秋石斛‘三亚阳光’叶片的叶绿素合成受到抑制,而降解却加速,最终导致总体叶绿素含量的下降,这与热带亚热带起源的柱花草[16]、闽楠[26]以及寒温带起源的欧洲冬青[19]一致,但与高海拔植物垂穗披碱草[27]、绿绒蒿[28]等叶绿素含量先降低后增加的变化趋势不一致。说明植物的低温胁迫生理指标的变化不仅与起源地的纬度有关,可能还与起源地的海拔有关,同时也与栽培驯化的程度有关。
植物对低温胁迫的耐受是一系列分子及生理的响应过程,单个指标可以在一定程度上体现植物对低温胁迫的耐受程度,但存在一定的片面性。因此,对植物的耐寒性指标进行评价筛选,利用筛选的指标对植物的耐寒性进行综合性分析才能更好地对植物进行耐寒性评价。本研究发现,可溶性糖、游离脯氨酸、MDA含量和落叶率都与LT50有极显著的正相关,而叶绿素含量与LT50呈极显著的负相关,可以作为秋石斛‘三亚阳光’的耐寒性综合评价指标。研究发现,MDA含量在很多植物中与LT50有显著的相关性,如热带亚热带起源的果蔗幼苗[14]、菠萝幼苗[29]、烤烟[30]以及寒温带起源的葡萄[31]、芍药[32]、华中冬青[33]、紫薇[34]、毛桃[35]等。在兰科植物方面,田丹青等[36]研究发现,保护酶活性和丙二醛含量与蝴蝶兰抗寒性关联度较大,可以作为评价抗寒性的主要指标,高冬冬等[37]研究也发现MDA含量可作为蝴蝶兰耐寒性鉴定的指标之一;而周桂英等[38]研究发现大花惠兰的MDA含量与寒害指数呈极显著的相关性,是大花惠兰抗寒性筛选的可靠指标之一;文心兰的MDA含量在低温胁迫过程中呈规律性变化,可作为文心兰耐寒性鉴定关键指标[25],这与秋石斛的研究结果一致。
本研究表明测定的几个秋石斛‘三亚阳光’中苗的耐寒指标均对低温胁迫有响应,而关联分析表明可溶性糖、游离脯氨酸、MDA、叶绿素含量和落叶率均可以作为秋石斛‘三亚阳光’中苗的耐寒性综合评价指标。通过生理和形态指标分析发现,秋石斛‘三亚阳光’中苗可以耐受10 ℃低温4 d时间和5 ℃低温2 d时间,为秋石斛‘三亚阳光’中苗实际生产提供了耐寒防控依据。