响应面法优化香水莲花甾醇的超声提取工艺

付调坤; 周伟; 廖良坤; 付琼; 李积华

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.024

热带作物学报 >

2020 , Vol. 41 >Issue 12: 2541 - 2547

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.024

采后处理与质量安全

响应面法优化香水莲花甾醇的超声提取工艺

付调坤 ¹^,³ ,
周伟 ¹^,³ ,
廖良坤 ¹^,³ ,
付琼 ² ,
李积华 ^,¹^,³^,^*

展开

1.中国热带农业科学院农产品加工研究所/农业农村部热带作物产品加工重点实验室,广东湛江 524001
2.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江 524091
3.海南省果蔬贮藏与加工重点实验室,广东湛江 524001

*李积华,E-mail： foodpaper@126.com

付调坤（1982—）,女,硕士,副研究员,研究方向：热带农产品加工。

收稿日期: 2020-11-09

要求修回日期: 2020-11-27

网络出版日期: 2020-12-25

基金资助

中国热带农业科学院基本科研业务费专项(1630122020008)

“一带一路”热带项目资金项目(BARTP-10)

版权

收起

Optimization of Ultrasonic Extraction Technology of Nymphaea hybrid Sterols by Response Surface Method

FU Tiaokun ¹^,³ ,
ZHOU Wei ¹^,³ ,
LIAO Liangkun ¹^,³ ,
FU Qiong ² ,
LI Jihua ^,¹^,³^,^*

Expand

1. Agricultural Products Processing Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Crop Products Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhanjiang, Guangdong 524001, China
2. South Subtropical Crops Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang, Guangdong 524091, China
3. Hainan Key Laboratory of Storage & Processing of Fruits and Vegetables, Zhanjiang, Guangdong 524001, China

*LI Jihua,E-mail： foodpaper@126.com

Received date: 2020-11-09

Request revised date: 2020-11-27

Online published: 2020-12-25

Copyright

Fold

摘要

为了分析香水莲花的植物甾醇含量并优化其超声提取工艺,采用高效液相色谱（HPLC）法测定香水莲花中菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的含量,再以上述3种甾醇提取量为评价指标,对液料比、超声提取温度和超声提取时间进行单因素试验,在此基础上,再采用Box-Behnken响应面法优化香水莲花甾醇提取工艺并进行验证。结果表明,影响香水莲花甾醇提取量的主次因素是液料比>提取时间>提取温度,其最优工艺条件为以95%乙醇为提取溶剂、超声功率100 W、液料比30∶1（mL/g）、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min;在最优工艺条件下进行验证实验,得出香水莲花中甾醇含量为菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/100 g,总甾醇204.42 mg/100 g,综合评分与预测值相比差异不显著（P<0.05）。研究结果为香水莲花资源的开发和利用提供参考。

关键词： 香水莲花; 植物甾醇; 超声提取工艺; Box-Benhnken响应面法

本文引用格式

付调坤 , 周伟 , 廖良坤 , 付琼 , 李积华 . 响应面法优化香水莲花甾醇的超声提取工艺[J]. 热带作物学报, 2020 , 41(12) : 2541 -2547 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.024

Abstract

To analyze the phytosterol content in Nymphaea hybrid and optimize its ultrasonic extraction technology, high performance liquid chromatography (HPLC) method was adopted for content determination of brassicasterol, campesterol and β-sitosterol in N. hybrid, and the contents of above 3 components were taken as index to carry out single factor test on liquid-solid ratio, ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time. Based on that, Box-Behnken response surface method was used to optimize the extraction process parameter of N. hybrid sterols and the results were tested and verified. The results showed that the factors affecting the sterol amount extracted from N. hybrid were liquid- solid ratio > ultrasonic extraction time > ultrasonic extraction temperature. The optimal process is as follows: 95% ethanol is used as extraction solvent, ultrasonic power is 100 W, liquid-solid ratio is 30∶1 (mL/g), ultrasonic extraction temperature is 60 ℃, ultrasonic extraction time is 30 min. According to the optimal process conditions, the results showed that the sterol content of N. hybrid was as followed: the content of brassicasterol was 64.61 mg/100 g, the content of campesterol was 40.77 mg/100 g, the content of β-sitosterol was 99.04 mg/100 g, the total sterol content was 204.42 mg/100 g. The comprehensive score was not significantly different from the predictive value (P<0.05). The results provide reference for the development and utilization of N. hybrid.

Key words： Nymphaea hybrid; phytosterol; ultrasonic extraction technology; Box-Behnken response surface method

香水莲花（Nymphaea hybrid）是睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Nymphaea）的一种多年水生宿根草本植物,香气宜人,颜色鲜艳,观赏价值高。20世纪70年代香水莲花被引入我国热带亚热带地区,因其有金、黄、紫、蓝、赤、茶、绿、红和白共9种不同色系,故将其称为九品香水莲花^[1]。香水莲花不仅是一种观赏植物,还具有多种药效和保健作用^[2,3],是一种新兴的药食两用植物,具有很高的经济价值。香水莲花中含有丰富的植物性胎盘素^[4,5],还含有蛋白质、多糖、多酚、黄酮、植物甾醇、生物碱等成分^[6]。其中,植物甾醇具有促进胆固醇的降解代谢^[7]、调节免疫^[8]、抑制肿瘤^[9]、抑制乳腺增生^[10]、抗炎抗菌^[11]等作用,在医药、食品、化妆品等领域都有重要应用,具有极大的药用价值和开发价值^[12]。但目前有关香水莲花中的植物甾醇组分、含量及提取的研究报道极少。

根据本课题组的前期研究得知,香水莲花中含有多种植物甾醇,如麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇等。本文以香水莲花为研究对象,采用超声辅助法提取香水莲花中的甾醇,并采用Box-Benhnken响应面法优化提取工艺,旨在为香水莲花的资源开发和高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂香水莲花由海南大地农旅文化投资有限公司提供;95%乙醇（分析纯）、无水甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）,上海麦克林生化科技有限公司;麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇标准品,北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备 ALPHA2-4真空冷冻干燥机,德国Christ公司;SK2210LHC超声波反应器,上海科导公司;N-EVAP-24氮吹仪,美国Organomation公司;LC-20A高效液相色谱仪,日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的预处理将新鲜的香水莲花花瓣洗净后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h,然后将冻干好的香水莲花花瓣用粉碎机粉碎过60目筛,即得到香水莲花冻干粉末,密封冷藏备用。

1.2.2 香水莲花甾醇的提取准确称取一定量的香水莲花冻干粉末,按一定液料比（mL/g）加入95%乙醇,置于超声波反应器中超声辅助提取,提取液于10000 r/min高速离心20 min,取上清液置于氮吹仪中吹干,即得到香水莲花甾醇提取物。

1.2.3 HPLC法检测香水莲花甾醇含量（1）色谱检测条件。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）,流动相为甲醇,流速0.7 mL/min,柱温35 ℃,紫外检测器,检测波长210 nm,进样量20 μL。

（2）绘制标准曲线。通过预实验,在香水莲花中检测到麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇。分别准确称取上述5种甾醇的标准品各25 mg,用无水甲醇配制成1.0 mg/mL的标准溶液,再稀释为不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的标准溶液。按照色谱检测条件进样检测,每个浓度标准品溶液重复检测3次。分别以溶液浓度和峰面积作为横、纵坐标,绘制标准曲线。

（3）混合标准品的配制及色谱检测。分别精密称取5种甾醇标准品各1 mg,用无水甲醇溶解并混合,定容至2 mL,按色谱检测条件进样检测,得到混合标准品的色谱图。

（4）样品检测。提取的香水莲花甾醇提取物用无水甲醇溶解,定容至3 mL,准确移取1.5 mL样品至样品瓶中,按照色谱条件进样检测,每个样品重复进样3次。

1.2.4 单因素实验以95%乙醇为提取溶剂,在超声功率为100 W的条件下,依次分别考察液料比（mL/g）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）、超声提取温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、超声提取时间（30、60、90、120、150、180 min）对香水莲花中甾醇提取量的影响。

1.2.5 响应面实验根据Box-Behnken试验设计原理,在1.2.4实验结果的基础上,以提取的菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇含量的综合评分为响应值,设计3因素3水平实验,对提取工艺参数进行优化,实验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken实验设计的因素和水平

Tab. 1 Factors and levels of Box-Behnken

因素 Factors	水平Levels
因素 Factors	-1	0	1
A液料比/(mL·g^-1)	10	20	30
B超声提取温度/℃	35	47.5	60
C超声提取时间/min	30	105	180

1.3 数据处理

采用Design Expert 8.0软件对数据进行统计分析,并采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 香水莲花的甾醇含量分析

2.1.1 5种甾醇的标准曲线根据不同浓度甾醇标准溶液的色谱图,计算色谱峰面积并绘制标准曲线。结果显示,麦角甾醇标准曲线的回归方程为y=11417858.5x-233800.3,相关系数R²=0.9996;菜籽甾醇标准曲线的回归方程为y=7931156.5x- 135202.7,相关系数R²=0.9946;菜油甾醇标准曲线的回归方程为y=6936456.5x-310802.5,相关系数R²=0.9935;蒲公英甾醇标准曲线的回归方程为y= 14169061.5x-165694.7,相关系数R²=0.9906;β-谷甾醇标准曲线的回归方程为y=5074077.0x- 50681.6,相关系数R²=0.9992。所得回归方程的线性关系均良好。

2.1.2 香水莲花甾醇的定性与定量分析图1和图2分别为5种甾醇混合标准品和香水莲花甾醇提取液（液料比30∶1 mL/g、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min）的HPLC色谱图。将图2与图1对比,根据色谱峰的保留时间,对香水莲花提取液中的甾醇成分进行定性分析,确定保留时间为14.39、16.17、18.51、19.94、20.78 min 的色谱峰分别为麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇的吸收峰。样品中可能含有其他物质,因此保留时间与混合标准品色谱图中的对应成分略有不同。

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图1 5种甾醇混合标准品的HPLC色谱图

Fig. 1 HPLC chromatogram of 5 mixed standard sterols

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图2 香水莲花甾醇提取液的HPLC色谱图

Fig. 2 HPLC chromatogram of the sterol extract of Nymphaea hybrid

根据2.1.1建立的甾醇标准曲线对图2进行定量分析,计算得到香水莲花甾醇提取液中5种甾醇的含量,结果见图3。由图3可知,香水莲花中含量较高的甾醇为菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇（均超过0.4 mg/g）,因此选择这3种甾醇提取量作为提取工艺优化的考察指标。

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图3 高效液相法检测样品中不同甾醇的含量

不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Fig. 3 Determination of different sterols in samples by HPLC

Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).

2.2 单因素实验结果

2.2.1 液料比对香水莲花甾醇提取量的影响从图4A可知,菜籽甾醇的提取量在液料比为10∶1、15∶1（mL/g）时相差不大,且在液料比为15∶1（mL/g）时最高,然后随着液料比增大,菜籽甾醇的提取量呈持续下降趋势;菜油甾醇的提取量在一开始呈下降趋势,然后随着液料比的增大先缓慢上升再下降,在液料比为25∶1（mL/g）时提取量最高;β-谷甾醇的提取量随液料比的增大而上升,在液料比为20∶1（mL/g）达到最大值,然后呈下降趋势。这是因为增加溶剂量,使样品与溶剂更充分接触,甾醇也就溶解的更多;但当液料比分别为15∶1（mL/g）和20∶1（mL/g）时,菜籽甾醇和β-谷甾醇的提取量达到最高值,表明香水莲花中的甾醇已基本提取完全,再增加溶剂反而会降低甾醇的浓度。菜油甾醇的提取量在液料比由10∶1（mL/g）增至15∶1（mL/g）时呈下降趋势,可能是由于其他物质溶出而引起的;但随着液料比继续增大,菜油甾醇的提取量则呈缓慢上升趋势,可能是随着提取溶剂的增加,溶出的菜油甾醇含量也随之增多;但当液料比达25∶1（mL/g）时,提取完全,随后再增加液料比反而会使甾醇的浓度降低。当液料比为20∶1（mL/g）时β-谷甾醇的提取量最高,且菜籽甾醇和菜油甾醇此条件下的提取量相比各自最高的提取量相差较小,故综合考虑后选取液料比20∶1（mL/g）作为最佳液料比。

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图4 液料比（A）、温度（B）、时间（C）对香水莲花甾醇提取量的影响

不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Fig. 4 Effect of liquid-solid ratio (A), temperature (B) and ultrasonic time (C) on the extraction amount of sterol from N. hybrid

Different small letters mean significant difference (P<0.05).

2.2.2 超声提取温度对香水莲花甾醇提取量的影响从图4B可以看出,菜籽甾醇的提取量在35~ 40 ℃呈下降趋势,然后随着温度继续升高整体呈上升趋势,在60 ℃时达到最高值;菜油甾醇的提取量同样在45 ℃之前呈下降趋势,然后呈先上升后下降趋势,在50 ℃时达到最高值;β-谷甾醇的提取量在45 ℃之前呈下降趋势,然后随着温度升高呈上升趋势,在60 ℃时达到最高值。随着温度的升高,各甾醇的提取量均呈先下降后上升的趋势,这可能是因为一开始有杂质溶出,降低了甾醇的含量,之后随着温度的升高,甾醇的溶解度增大,所以呈上升趋势;但是菜油甾醇提取量在50 ℃达到最大值后,再继续升高温度时,可能由于甾醇分子的结构被破坏而导致甾醇含量呈下降趋势^[13]。综合考虑,选取60 ℃作为最佳提取温度。

2.2.3 超声提取时间对香水莲花甾醇提取量的影响由图4C可以看出,提取时间的增加使得菜籽甾醇和菜油甾醇的提取量均呈先上升后下降的趋势,菜籽甾醇的提取量在提取90 min时达最高值,菜油甾醇的提取量在提取120 min时最高。这是因为随着提取时间的增加,甾醇会分解^[14],所以会出现提取时间越长、甾醇提取含量越低的情况。β-谷甾醇的提取量在30~90 min呈逐渐上升的趋势,90 min时提取量达到最大值;但随着提取时间继续增加,其提取量先下降再上升,这是因为其他物质的溶出可能导致甾醇含量降低。综合考虑,选取90 min作为最佳提取时间。

2.3 响应面实验结果

选取菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇的提取量作为评价指标,这3个指标都是越大越好。对于欲达到最大值的指标,其指标隶属度=(指标值-指标最小值)/(指标最大值-指标最小值)。由于选取的3个指标的重要性一样,因此直接将各个指标隶属度相加作为综合评分,并对结果进行回归分析。实验结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

Tab. 2 Design and results of Box-Behnken experiment

实验号 Number	A液料比 A liquid-solid ratio /(mL·g^-1)	B提取温度 B temperature/℃	C提取时间 C time/min	菜籽甾醇 Brassicasterol /[mg·(100 g)^-1]	菜油甾醇Campesterol /[mg·(100 g)^-1]	β-谷甾醇β-sitosterol /[mg·(100 g)^-1]	综合评分 The comprehensive score
1	20.00	47.50	105.00	49.03	52.00	22.01	1.55
2	20.00	47.50	105.00	43.68	39.74	26.69	1.27
3	20.00	60.00	180.00	23.31	21.79	57.69	0.96
4	10.00	35.00	105.00	28.42	23.52	15.61	0.50
5	20.00	60.00	30.00	60.70	40.62	81.39	2.38
6	20.00	47.50	105.00	34.78	33.02	30.88	1.03
7	30.00	47.50	30.00	69.67	37.97	54.50	2.13
8	10.00	47.50	30.00	17.88	12.53	9.82	0.00
9	20.00	35.00	30.00	45.87	63.04	20.13	1.68
10	20.00	47.50	105.00	39.55	33.76	24.53	1.04
11	30.00	47.50	180.00	31.18	25.80	30.50	0.81
12	30.00	60.00	105.00	33.73	40.15	66.26	1.64
13	30.00	35.00	105.00	49.41	58.00	24.93	1.72
14	20.00	47.50	105.00	43.28	43.40	28.86	1.37
15	10.00	60.00	105.00	47.04	34.81	26.60	1.24
16	10.00	47.50	180.00	57.03	40.15	34.11	1.64
17	20.00	35.00	180.00	39.21	31.12	18.22	0.90

对实验结果进行回归分析,得到回归方程如下：

综合评分=1.29+0.37A+0.18B-0.24C-0.21AB- 0.74AC-0.16BC

对方程进行方差分析,结果见表3。

表3 回归模型的方差分析

Tab. 3 Variance analysis of the regression model

方差源Source	平均和Sum of Squares	自由度df	均方Mean Square	F值F value	P值P value	显著性Significance
模型	4.2200	6.0000	0.7000	5.6700	0.0084	**
A液料比	1.0700	1.0000	1.0700	8.5900	0.0150	*
B提取温度	0.2500	1.0000	0.2500	2.0300	0.1846
C提取时间	0.4400	1.0000	0.4400	3.5600	0.0886
AB	0.1700	1.0000	0.1700	1.3500	0.2716
AC	2.1900	1.0000	2.1900	17.6400	0.0018	**
BC	0.1000	1.0000	0.1000	0.8200	0.3851
残差	1.2400	10.0000	0.1200
失拟项	1.0400	6.0000	0.1700	3.5300	0.1213
纯误差	0.2000	4.0000	0.0490
总和	5.4600	16.0000

	注：和*分别表示差异显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）。
	Note: * and ** represent significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively.

由表3可以看出,回归方程模型P=0.0084< 0.01,表明模型极显著,且失拟项P=0.1213>0.05（不显著）,表明实验结果和数学模型拟合度很好,因此可用该模型预测香水莲花中甾醇的提取结果。通过方差分析可知,模型中一次项对综合评分的影响大小顺序是A（液料比）>C（提取时间）>B（提取温度）,交互项AC影响极显著（P<0.01）,其余交互项均不显著。

根据模型回归方程,绘制响应面,由液料比、提取温度、提取时间等各因素相互影响构成三维空间曲面图,Box-Benhnken响应面图及等高线图见图5。

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图5 3种因素对综合评分的响应面图和等高线图

Fig. 5 Response surface plot and contour map of 3 factors on comprehensive score

图5A1和图5A2分别是液料比与提取温度对综合评分影响的响应面图和等高线图,由图可知,随着提取温度和液料比的增加,综合评分呈增加趋势;图5B1和图5B2分别是液料比与提取时间对综合评分影响的响应面图和等高线图,由图可知,液料比对综合评分影响非常大,随着液料比的增大,综合评分也随之增加,但当液料比增大到30∶1,综合评分反而下降。提取时间对综合评分的影响不明显,可能是因为提取时间较长导致甾醇成分降解。图5C1和图5C2分别是提取温度与提取时间对综合评分影响的响应面图和等高线图,由图可知,综合评分随着提取温度的升高而增加,但提取时间对于综合评分的影响不是很明显。由响应曲面的陡峭程度可知,液料比对综合评分影响显著,其次是提取时间,曲面最平缓的提取温度对综合评分影响最小。

经过响应面回归分析优化提取条件,得到最优工艺条件为液料比30∶1（mL/g）、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min,预测综合评分为2.7584。在最优工艺条件下进行验证实验,香水莲花中甾醇含量分别为菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/ 100 g,总甾醇204.42 mg/100 g,综合评分为2.7423,与预测值相比差异不显著。

3 讨论

香水莲花除了作为观赏植物,因其含有黄酮、多酚、多糖、生物碱等生物活性成份,具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、降脂降糖、保护肝脏、美容护肤等多种功效^[15,16,17]。作为一种新型药食两用资源,香水莲花成为当前研究的热点,但相关报道大多集中在对香水莲花中的黄酮、多酚、多糖、氨基酸、挥发油的研究,而关于香水莲花中甾醇组分的含量及提取工艺的研究目前还未见报道。本文以香水莲花为研究对象,采用超声辅助法提取香水莲花中的甾醇,并采用Box-Benhnken响应面法优化提取工艺,既可以实现香水莲花的综合利用,又可为香水莲花资源的高值化开发提供理论依据和参考。

本文采用高效液相色谱法测得香水莲花中含量较高的为菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇,以这3种甾醇提取量为评价指标,对液料比、超声提取温度和超声提取时间进行单因素实验;在此基础上,采用Box-Behnken响应面法优化香水莲花甾醇提取工艺并进行验证。结果表明,影响香水莲花甾醇提取量的主次因素是液料比>提取时间>提取温度,其最优工艺条件为以95%乙醇为提取溶剂、超声功率100 W、液料比30∶1（mL/g）、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min,预测综合评分为2.7584;在最优工艺条件下进行验证实验,香水莲花中甾醇含量为：菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/100 g,总甾醇204.42 mg/100 g,综合评分为2.7423,与预测值相比差异不显著。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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