火龙果（Hylocereus undatus Britt. et Rose）属于仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）,是一种具有较高经济价值和营养价值的集水果、花卉为一体的热带、亚热带果树,被誉为保健食品和果品珍品[1],于20世纪90年代初引种到中国台湾。随着种植规模的扩大,火龙果已逐步成为我国南方地区农民经济收入的重要来源。在火龙果种植过程中,由于种植集中,种植品种单一化,火龙果溃疡病（Neoscytalidium dimidiatum）、白绢病（Sclerotium rolfsii）和煤烟病（Blastocladia pringsheimii）逐年加重,致使火龙果产量和品质急剧下降。目前,这些病害的防治主要以化学防治为主,但化学防治会对人类健康和生态环境造成危害和破坏作用,也易导致病原菌产生抗药性。因此,寻求安全有效且环境友好的病害防治手段将有助于火龙果产业的绿色健康发展。
木霉菌（Trichoderma spp.）是广泛分布于森林、农田等潮湿生境中土壤、腐木、落叶以及真菌子实体上的拮抗微生物[2],在生物防治中的应用和研究非常广泛。木霉菌对植物病原菌的广谱拮抗作用,已被用于曲霉菌（Aspergillus spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、假单胞菌（Pseudomons adaceae）、轮枝孢菌（Pseudomons adaceae）等多种病原菌引起的植物病害的防治[3,4,5,6]。本研究拟通过测定7株木霉菌与火龙果3种病原菌的对峙培养、发酵液和挥发性物质抑制作用及几丁质酶的活性,研究木霉菌对火龙果病原菌的拮抗效果,为下一步开发木霉菌复合制剂防治火龙果病害提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 靶标病原菌为引起火龙果溃疡病的新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）、煤烟病的芽枝霉（Blastocladia pringsheimii）和白绢病的齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）,均由海南大学植物保护学院谢昌平副教授惠赠。哈茨木霉2325-2（T. harzianum）、哈茨木霉XJ035（T. harzianum）、棘孢木霉FJ069（T. asperellum）、棘孢木霉HL119（T. asperellum）、棘孢木霉HL135（T. asperellum）、棘孢木霉JX013（T. asperellum）和棘孢木霉SC012（T. asperellum）,均由海南大学植物保护学院木霉菌研究课题组提供。
1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：200 g马铃薯煮熟后滤液,葡萄糖20 g,琼脂15 g,蒸馏水定容至1 L。
马铃薯葡萄糖水（PD）培养基：200 g马铃薯煮熟后滤液,葡萄糖20 g,蒸馏水定容至1 L。
几丁质酶产酶培养基[7]：粉末状几丁质0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.06 g,KH2PO4 0.2 g,NH4NO3 0.3 g,蒸馏水定容至100 mL。
3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液[8]：37.4 g酒石酸钾钠溶于少量蒸馏水中,加热至75 ℃,依次加入3,5-二硝基水杨酸1.26 g,NaOH 4.2 g,无水硫酸钠1.0 g,搅拌至溶解,冷却后用蒸馏水定容至200 mL。
1.2 方法
1.2.1 对峙培养 将7株木霉菌和3种病原菌分别接种于PDA平板上,28 ℃培养3 d,用打孔器分别切取木霉菌菌饼（d=5 mm）与病原菌菌饼（d=5 mm）接种于PDA平板两侧,二者相距6 cm,28 ℃暗培养3 d,测量病原菌菌落半径,计算其抑制率。抑制率=[(对照病原菌菌落半径-处理病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径]×100%。对照只接病原菌菌饼,重复3次。
1.2.2 发酵液对病原菌抑制作用 7株木霉菌分别转接于PD培养基中,150 r/min,25 ℃培养7 d,分别收集其发酵液,0.22 μm无菌滤膜过滤,滤液置于无菌离心管中备用。将10 mL无菌木霉菌发酵液与40 mL PDA培养基混合均匀后倒平板,待其冷却后在平板中央转接病原菌,28 ℃暗培养3 d,测量菌落直径并计算抑制率。对照为10 mL无菌PD培养基与40 mL PDA培养基均匀混合倒平板。重复3次。抑制率计算公式同1.2.1。
1.2.3 挥发性物质对病原菌抑制作用 挥发性物质对病原菌抑制作用参照对扣培养法[9]。用打孔器分别切取7株木霉菌菌饼（d=5 mm）接种于PDA平板中央,28 ℃培养2 d,平板上方铺盖一张直径为9 cm的单层无菌玻璃纸,然后对扣一个大小相等,且接有直径5 mm的病原菌菌饼的PDA平板,密封,28 ℃恒温培养。以只接病原菌的平板为对照。重复3次。3 d后计算抑制率,抑制率计算公式同1.2.1。
1.2.4 几丁质酶活检测 胶态几丁质制备参考Berger的方法[10]。将10 g粉末状几丁质置于研钵中,少量多次加入4 ℃预冷浓盐酸,研磨至呈糊状,置于4 ℃冰箱静置24 h。静置后的几丁质用纱布过滤,滤液用蒸馏水搅拌稀释,3000 r/min离心10 min,弃上清液,蒸馏水冲洗沉淀,反复溶解后再离心。重复上述操作直至溶液pH=7,蒸馏水定容至1000 mL。
用5 mm打孔器分别切取培养3 d的木霉菌菌饼,转接于产酶液体培养基,28 ℃,180 r/min培养4 d,取滤液进行几丁质酶活性检测。几丁质酶活性测定采用DNS方法,取5 mL滤液加入2 mL上述胶态几丁质,37 ℃水浴3 h,然后取2.0 mL滤液加入1.5 mL DNS、1.0 mL缓冲液,沸水浴10 min,冷却至室温,540 nm处比色测定OD值。以100 ℃灭活10 min的酶液为空白对照,以1 mL粗酶液每小时分解胶态几丁质产生l μmol还原糖（葡萄糖）的酶量定义为一个酶单位（U）。重复3次。
1.3 数据处理
采用EXCEL软件和SPSS 20.0软件对相关数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 木霉菌与火龙果3种病原菌的对峙培养
通过对峙培养发现7株木霉菌对火龙果3种病原菌均具有明显的抑制作用（图1,表1）。7株木霉菌对引起火龙果煤烟病的芽枝霉、白绢病的齐整小核菌和溃疡病的新暗色柱节孢的抑制率分别为57.58%~84.85%、71.25%~80.63%和59.22%~67.60%。其中木霉菌FJ069、2325-2和HL135分别对煤烟病菌芽枝霉、白绢病菌齐整小核菌和溃疡病菌新暗色柱节孢的抑制率最高,分别为(84.85±5.25)%、(80.63±1.20)%和(67.60± 0.85)%。所有木霉菌株对煤烟病菌芽枝霉和白绢病菌齐整小核菌的抑制效果均高于溃疡病菌新暗色柱节孢,表明不同木霉菌株在对峙培养中对不同病原菌的抑制效果存在一定差异,其中对煤烟病菌芽枝霉的抑制效果最明显。
图1 7株木霉菌对火龙果3种病原菌生长抑制作用A：火龙果煤烟病菌芽枝霉;B~H：7株木霉对火龙果煤烟病菌芽枝霉的生长抑制作用;I：火龙果白绢病菌齐整小核菌;J~P：7株木霉对火龙果白绢病菌齐整小核菌的生长抑制作用;Q：火龙果溃疡病菌新暗色柱节孢;R~X：7株木霉菌对火龙果溃疡病菌新暗色柱节孢的生长抑制作用。 Fig. 1 Antagonism of seven Trichoderma strains against growth of three pathogens of pitaya A: B. pringsheimii; B-H: Growth inhibition and antagonism of seven Trichoderma against B. pringsheimii;I: S. rolfsii; J-P: Growth inhibition and antagonism of seven Trichoderma against S. rolfsii;Q: N. dimidiatum; R-X: Growth inhibition and antagonism of seven Trichoderma against N. dimidiatum. |
表1 7株木霉菌对火龙果3种病原菌生长抑制作用Tab. 1 Growth inhibition and antagonism of seven Trichoderma strains against three pathogens of pitaya |
| 菌株 Strain | 抑制率Inhibitory rate/% | ||
|---|---|---|---|
| 火龙果煤烟病菌 B. pringsheimii | 火龙果白绢病菌 S. rolfsii | 火龙果溃疡病菌 N. dimidiatum | |
| XJ035 | 75.76±5.25bc | 76.88±1.23b | 63.69±1.18c |
| FJ069 | 84.85±5.25a | 72.50±0.97cd | 62.01±1.19d |
| HL135 | 72.73±0.00cd | 71.25±0.77d | 67.60±0.85a |
| HL119 | 66.67±5.25d | 72.50±1.37cd | 65.36±1.17b |
| 2325-2 | 75.76±5.25bc | 80.63±1.20a | 59.22±1.37e |
| JX013 | 81.82±0.00ab | 74.38±1.35c | 62.57±1.34cd |
| SC012 | 57.58±5.25e | 76.88±1.23b | 60.34±1.21e |
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.2 木霉菌发酵液对火龙果3种病原菌的抑制作用
通过测定7株木霉菌发酵液对火龙果3种病原菌的抑制作用,显示7株木霉菌对火龙果3种病原菌均有一定的抑制作用（表2）,但是对不同病原菌的抑制作用存在显著差异（P<0.05）。其中木霉菌SC012、HL135和FJ069发酵液分别对火龙果煤烟病菌芽枝霉、白绢病菌齐整小核菌和溃疡病菌新暗色柱节孢的抑制效果最好,分别为(56.52± 3.77)%、(62.12±1.40)%和(77.08±2.48)%,结果表明不同木霉菌株可能产生了不同的代谢产物,导致其对不同病原菌的抑制作用存在差异。
表2 7株木霉菌发酵液对火龙果3种病原菌的抑制作用Tab. 2 Inhibition of seven Trichoderma fermentation broth against three pathogens of pitaya |
| 菌株 Strain | 抑制率Inhibitory rate/% | ||
|---|---|---|---|
| 火龙果煤烟病菌 B. pringsheimii | 火龙果白绢病菌 S. rolfsii | 火龙果溃疡病菌 N. dimidiatum | |
| XJ035 | 30.43±3.77cd | 51.52±4.61de | 57.29±0.94b |
| FJ069 | 34.78±0.00cd | 57.58±1.34bc | 77.08±2.48a |
| HL135 | 50.00±3.77a | 62.12±1.40a | 42.71±3.51d |
| HL119 | 39.13±3.77bc | 48.48±1.32e | 47.92±0.90c |
| 2325-2 | 26.09±7.53d | 54.55±2.49cd | 52.08±3.22c |
| JX013 | 47.83±11.30ab | 56.06±1.36c | 58.33±3.04b |
| SC012 | 56.52±3.77a | 60.61±1.42ab | 48.96±3.32c |
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.3 木霉菌挥发性物质对火龙果3种病原菌的抑制作用
试验结果表明,7株木霉菌挥发性物质对3种病原菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用,由表3可知,7株木霉菌对煤烟病菌芽枝霉和白绢病菌齐整小核菌的抑制率较高,其抑菌率介于34.78%~13.04%和37.84%~14.86%之间;对溃疡病菌新暗色柱节孢的抑菌效果较差,其抑菌率仅介于15.12%~3.49%之间。
表3 7株木霉菌挥发性物质对火龙果3种病原菌的抑制作用Tab. 3 Inhibition of seven Trichoderma volatile substances against three pathogens of pitaya |
| 菌株 Strain | 抑制率Inhibitory rate/% | ||
|---|---|---|---|
| 火龙果煤烟病菌 B. pringsheimii | 火龙果白绢病菌 S. rolfsii | 火龙果溃疡病菌 N. dimidiatum | |
| XJ035 | 21.74±0ab | 24.32±2.34c | 15.12±2.01a |
| FJ069 | 34.78±13.04a | 29.73±4.68bc | 6.98±2.01cd |
| HL135 | 17.39±7.53ab | 35.14±4.05ab | 11.63±2.01ab |
| HL119 | 26.09±7.53ab | 37.84±2.34a | 3.49±2.01d |
| 2325-2 | 13.04±7.53b | 17.57±2.34d | 4.65±2.01cd |
| JX013 | 26.09±15.06ab | 14.86±4.05d | 8.14±2.01bc |
| SC012 | 30.43±15.06ab | 28.38±4.68c | 13.95±2.01a |
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.4 木霉菌几丁质酶活性
7株木霉菌震荡培养4 d后检测几丁质酶活性,结果表明：木霉菌SC012的几丁质酶活性最高,达到1.83 U/mL,与其他木霉菌株的几丁质酶活性差异显著（P<0.05）,而木霉菌FJ069的几丁质酶活性最低,为0.83 U/mL,只有木霉菌SC012几丁质酶活性的45%,结果表明不同木霉菌株产生几丁质酶的能力存在一定的差异。
3 讨论
木霉菌对环境的适应能力强,生长速度快,能够抢夺病原菌的营养和生存空间,致使病原菌的生长受到抑制[11]。平板对峙试验可直观地观察到木霉菌对病原菌的抑菌效果,因此可以快速筛选出具有较强拮抗作用的木霉菌株。夏海波等[12]用平板对峙实验,筛选出8株对蔬菜病害防治效果良好的菌株。张建等[13]筛选得到9株棘孢木霉,对桑葚菌核病菌的抑菌率达到80%以上。Jiang等[14]通过对峙培养、细胞学和超微结构显示,棘孢木霉CGMCC 6422对辣椒疫霉病具有较强的抑制作用。本研究通过对峙培养试验,筛选到对火龙果煤烟病菌具有较好拮抗效果的木霉菌FJ069和JX013,对火龙果白绢病菌具有较好拮抗效果的木霉菌2325-2,抑菌率均达80%以上。而所有供试木霉菌对火龙果溃疡病菌的抑制率均不高,表明对于生长速度较快的病原菌,木霉菌难以通过快速生长占领其生存空间,致使抑制率降低。因此在利用木霉菌防治病原菌时,应以预防为主,才能达到更好的防治效果。
几丁质酶是木霉菌产生的细胞壁降解酶类（CWDEs）之一[15],木霉菌在重寄生过程中可以通过释放细胞壁降解酶降解病原菌的细胞壁来杀死病原菌,在丝状真菌中,木霉菌所含的几丁质酶基因是最多的[16]。木霉菌可以产生抗真菌活性的几丁质酶和水解几丁质酶,且不同几丁质酶对病原菌的拮抗活性表现出特异性,部分几丁质酶无拮抗真菌的活性[17]。本研究测定了7株木霉菌的几丁质酶活性,其中木霉菌SC012和HL135具有较高的几丁质酶活性,这2株木霉菌在发酵液和挥发性物质抑菌试验中均表现出了较好的抑菌效果,但在对峙培养中抑菌效果较差,可能是由于木霉菌SC012和HL135的生长速度较其他木霉菌慢,不能快速地占领病原物的生存空间,以及其几丁质酶中拮抗真菌活性的几丁质酶较少所致。Lorito等[18,19,20]通过研究指出,木霉菌几丁质酶只有几种同时具有水解几丁质活性和抗真菌活性。李华[21]也发现木霉菌对病原菌的生防能力与几丁质酶活性高低没有直接的相关性。因此,在评定木霉菌的拮抗作用时,应当结合多种影响因子进行分析。
木霉菌可以产生较丰富的抗生次生代谢产物,目前已经确定的抗生代谢产物已经超过了140种,而且不同菌株之间产生的次生代谢产物种类存在一定差异[22]。例如,陈凯等[23]发现绿色木霉LTR-2产生的吡喃酮类物质5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮在20 mg/L的浓度下对11种植物病原菌均有抑制作用。Liu等[24]从哈茨木霉中提取的6种蒽醌类化合物,以及Vinale等[25]从木霉T. cerinum的培养滤液中分离出一种新的羟基内酯对灰葡萄孢菌具有抑制作用。本研究中,7株木霉菌的发酵液对3种病原菌均有抑制作用,但木霉菌HL135对火龙果煤烟病菌的抑制率达(50.00±3.77)%,而木霉菌FJ069对火龙果煤烟病的抑制率仅为(34.78±0.00)%,表明木霉菌产生抗生次生代谢物的种类有一定的差异。
除了产生次生代谢产物外,木霉菌还可以产生一些抗病原真菌的活性挥发性物质,其中挥发性物质吡喃酮-6-戊基-2H-吡喃-2-酮（简称6PP）研究较为广泛,在多种木霉菌中被检测到。例如,Vos等[26]报道了木霉菌挥发性物质6PP对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢菌均具有抑制作用。另外木霉菌产生的一些挥发性小分子化合物能够诱导植物的抗性反应,例如,Martínez-Medina等[27]报道了棘孢木霉T-34和哈茨木霉T-78产生的挥发性物质能够引发拟南芥的系统性防御反应,提高对灰霉病的抗性,且能促进根部对铁离子的吸收。本研究结果显示,木霉菌产生的挥发性物质对病原菌有一定的抑制作用,其中,木霉菌SC012和木霉菌HL135的挥发性物质都显示出较强抑菌活性,表明这2株木霉菌可能产生具有抑菌活性的挥发性物质。供试木霉菌挥发性物质对病原菌的抑制率在3.49%~37.84%之间,低于对峙培养对病原菌的抑制率（57.58%~84.85%）以及发酵液对病原菌的抑制率（26.09%~77.08%）,表明木霉菌产生的挥发性物质对病原菌的抑制率不高,暗示了木霉菌产生挥发性物质的主要作用不仅仅为抑菌,可能还具有诱导植物抗性等其他作用。目前对于木霉菌挥发性物质的研究不多,对于挥发性物质的成分以及作用等尚待进一步挖掘和研究。
木霉菌种类繁多,生防机制复杂[28],在生防过程中对病原菌的生防机制包括竞争作用、重寄生作用、产生抑菌物质、诱导植物产生抗性以及促进植物生长等作用,且菌株之间的生防能力也存在着较大的差异[29]。在本研究中,木霉菌HL135有较高的几丁质酶活性,且其挥发性物质、发酵液均有较强的抑菌率,但其发酵液对火龙果溃疡病菌抑制效果较差,木霉菌FJ069的几丁质酶活性最低,但其发酵液对火龙果溃疡病菌的抑制率都较其他6株木霉菌高,虽然木霉菌JX013的几丁质酶活性不高,且其对火龙果白绢病菌、火龙果溃疡病菌的抑制效果均不理想,但是其对峙培养、发酵液以及挥发性物质对火龙果煤烟病菌有着良好的抑制效果。因此,在筛选生防菌的时候,应该结合多因素筛选方法,才能够合理地筛选出针对不同病原菌、不同拮抗特点的生防菌株。针对不同木霉菌对不同病原菌的防治效果具有差异的特点,可以采用不同木霉菌复配使用,以提高对多种病原菌的综合防治效果。