海滨木巴戟（Morinda citrifolia L.）,俗称诺尼,茜草科巴戟天属,誉为“天赐之物”“长寿之物”,为海南珍贵乡土树种,种植粗放、成本低、收益高、功效良好,兼具经济和生态价值[1]。诺尼果氨基酸种类多且蛋白质含量高,早在2000多年前波利尼西亚人就以其为治疗疼痛的最主要药用植物[2,3,4]。有研究表明,药用植物体内含有大量功能内生菌,为新的活性物质和抗生素分离提供了重要的微生物资源。因此,开展诺尼内生细菌鉴定和功能研究可为开发微生物菌剂提供重要的基础。
植物内生菌在现今耕作竞争中优势日渐明显[5]。内生菌可将连作中秸秆碳氮等消耗和酚类化感物质等累积物的木质素、纤维素等降解为土壤微生物易吸收的小分子物质,从而促进碳氮源的有效循环,使土壤微生物种群主导结构从真菌向细菌转变,有效抑制重金属离子对土壤酶活性和微生物活动的胁迫,提高土壤质量[6]。国内外正逐渐关注植物内生菌的潜在功能,童文君[7]从美花石斛（Dendrobium loddigesii Rolfe）内生菌种群中分离到67株具不同解磷、解钾和产生长素（IAA）的潜能细菌,对菌株进行分类确定芽孢杆菌属为优势属。邓平香等[8]研究了内生菌对富集重金属土壤的修复作用,从东南景天（Sedum alfredii）根系分离纯化到荧光假单胞菌R1,对不同处理的锌、镉污染土接种R1,R1代谢产酸能促进东南景天生长和溶解土壤Zn和Cd。由此,探究创新农业循环模式,发掘植物内生菌促生优势及改良土壤潜力,具有广阔的应用前景。本研究以药用植物诺尼为研究对象,从植株各部位分离和鉴定内生细菌,对其生理生化特性进行表征,通过田间试验分析其对番茄生长和发育的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源及处理 诺尼的根、茎、叶、花和果实采自海南省澄迈县桥头镇（19°58′35″N,109°55′35″E）,分别将样品进行分类标记,装袋编号,4 ℃保存。
1.1.2 培养基[9] LB培养基：酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,氯化钠l0 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH 7.2~7.5;解磷培养基：葡萄糖10 g,磷酸二氢钾0.2 g,硫酸铵0.5 g,氯化钠0.3 g,硫酸镁0.3 g,氯化钾0.2 g,0.5%硫酸锰6 mL,0.5%硫酸亚铁6 mL,磷酸三钙5 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L,pH 7.2~7.4。
1.1.3 供试作物 供试材料为番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）,由海南澄迈老城济光农资店提供的常规主栽品种‘京丹1号’。
1.2 方法
1.2.1 内生细菌分离、初筛 样品消毒：取诺尼植株根、茎、叶、花、果实洗净风干。为了对各组织进行灭菌处理,首先将各组织用75%乙醇处理5 min,后用次氯酸钠（棕色瓶）处理20 min,再用10%的碳酸氢钠浸泡10 min,无菌水冲洗5次,在灭菌滤纸上晾干并标注。
样品印迹试验[10]：采用组织印迹法将样品贴放于LB培养基中5 min,28 ℃培养3 d作为无菌检查。
样品研磨：样品徒手切成薄片后置于灭菌研钵中研磨至糊状,各取汁液1 mL于离心管中（样品之间处理需注意消毒）,加入4 mL LB培养基,室温180 r/min培养1 h,涡旋振荡。
分离筛选：配制浓度梯度为10-1、10-2、10-3的样品悬浮液,充分振荡后各取200 μL滴于LB培养基上,涂布均匀,重复3次,常温下倒置培养2 d,观察菌落形态（样品之间处理注意消毒）。用平板划线法多次纯化特征相异的单菌落至纯培养。
1.2.2 内生细菌复筛 将纯化菌株转接到固体解磷培养基上,37 ℃培养2 d,观察其是否产溶磷圈,产透明溶磷圈初定为解磷菌,选取溶磷圈明显的10株菌株,扩大培养并保存,进行功能测定。
（1）解磷能力测定。将初筛解磷菌制成菌悬液过滤离心,按磷含量0、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mg/L的浓度梯度配制磷标准曲线,采用钼锑抗比色法测定各浓度磷含量[9],以未接种空白培养基为对照,每个浓度重复3次,利用分光光度计读取OD700值,根据标准曲线计算滤液中的磷含量（mg/L）。
（2）产生长素（IAA）能力评估。将菌株接种于含100 mg/L L-色氨酸的LB培养基中,设3个重复,室温、180 r/min培养2 d,取50 μL菌悬液滴于白色点滴板上,加入等体积“显示剂”（Salkowski比色液）,对照设置2组：等体积未接菌LB培养基和比色液的混合液为阴性对照,等体积50 μg/mL IAA液和比色液的混合液为阳性对照,室温避光静置15 min,颜色不变色为阴性,不产IAA;变粉红则为产IAA菌,可进行IAA含量测定[11]。
产IAA能力测定：配制IAA母液（100 μg/mL）,在25 mL定容瓶中定容浓度为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的IAA溶液,用分光光度计测定OD530,绘制IAA标准曲线。将菌悬液离心（10 000 r/min,10 min）,取上清液,加入等体积Salkowski比色液,方法同上,根据IAA标准曲线计算菌株IAA产量[11]。
（2）分子生物学鉴定。将活化菌株接种于LB培养基中,用细菌通用引物（27F: 5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′）扩增16S rDNA基因[9]。PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA模板1 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL,反应条件包括94 ℃预变性5 min,94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,72 ℃后延伸10 min,4 ℃保存。
取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳预检测,并送至华大基因测序。将序列与Genebank数据库进行Blast比对,选取同源性较高序列,运用MEGA 7.0软件邻接法[14]进行聚类分析和构建系统发育树。
1.2.4 内生细菌对多种抗生素的药敏性分析 在LB培养基中滴加100 μL菌悬液,涂布均匀后放置抗菌药物药敏纸片,封口培养2 d,观察记录透明圈大小。
1.2.5 内生细菌对番茄种子萌芽和生长的影响 将菌种接入LB培养基中,常温下摇瓶培养（180 r/min,2 d）,以不接菌种LB培养基为空白对照。对番茄种子进行表面消毒[15]。
将番茄种子放入铺有无菌滤纸的培养皿中,设置菌原液、不同菌液浓度（10-1、10-2、10-3）、清水、培养基6个处理,各重复3次,每皿放置15粒种子。人工气候培养箱中以温度30 ℃、湿度80%、光照40%,培养7 d,观察记录其萌芽情况（胚芽长度1.5 mm以上）,计算萌芽率：萌芽率=(萌芽终期正常萌芽种子数/供试种子总数)× 100%。相同条件培养至10 d,并用游标卡尺测算记录胚轴长度、胚根长度、胚轴粗壮程度等。
1.2.6 内生细菌发酵液田间试验 试验地概况：坐标为19°30'21"N,109°29'42"E,受热带季风气候影响光热充足,土壤类型为砖红壤,肥力中等。
发酵液制备：以平板划线法将复筛所得目标菌株接于LB培养基上,37 ℃培养2 d。挑取单菌落于LB培养基中,37 ℃、180 r/min培养24 h。发酵液以豆粕和糖蜜为培养基（C/N=1∶16）,加入6%种子液,常温140 r/min培养7 d,吸取100 µL稀释10倍涂板计数,将发酵液活菌数稀释至105 CFU/mL备用。
试验设计：设计3个处理,以农户常规种植方式为对照,按自沤沼泽肥∶复合肥=40∶1的混合配比浇施;按2.5%和5%浓度发酵液浇施。各处理施肥次数及时间保持一致,试验数据测量采取随机取样方式。
田间管理：2018年10月8日播种育苗;11月27日定植移栽,株距55 cm,行距120 cm,保苗株数1株/m2[16];2019年1月15日为开花坐果期;2月20日左右开始采摘,4月12日试验结束。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2007软件和单因素方差分析试验数据,运用邓肯氏新复极差检验法（DMRT法）进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 促生内生菌的筛选
对诺尼植株不同部位样品进行消毒制成悬浊液,通过稀释平板法初步分离纯化到621株内生细菌,选取10株优势菌进行解磷及促生功能复筛,挑取其中效果最佳的果实内生菌为研究对象,命名QN2MO-1。该菌落在LB培养基上呈椭圆形,呈淡黄色,不透明,表面平整,边缘锯齿状,中央隆起,椭圆或短杆状,属于革兰氏阳性菌（图1）。随着培养时间延长,菌落趋向干燥扁平、边缘褶皱不规则。
2.2 QN2MO-1内生细菌解磷能力和IAA产出分析
采用钼锑抗比色法测定菌悬液水解磷能力,紫外分光光度计OD700测定磷标准曲线各浓度吸光度,得出标准曲线方程y=0.415x+0.0132（R2= 0.9935）。将QN2MO-1悬浮液稀释100倍后测得OD700值为0.416,根据标准曲线方程得到该菌解磷能力为(103.42±1.07)mg/L,说明该菌株具有高效解磷能力。
根据Salkowski比色法鉴定结果（图2）,菌株QN2MO-1混合液与IAA阳性对照组呈粉红色,而未接菌阴性对照组无颜色变化,说明菌株QN2MO-1可分泌IAA。利用紫外分光光度计分析IAA的标准曲线y=0.0069x+0.0058（R2=0.9989）,计算QN2MO-1在含L-色氨酸LB培养基下分泌IAA量为(39.81±0.31)μg/mL。
2.3 QN2MO-1内生细菌生理生化特征分析
试验测定结果显示,QN2MO-1在淀粉水解、明胶液化、过氧化氢酶活性和H2S产出中呈阳性反应,V-P试验代谢得出QN2MO-1可发酵葡萄糖产丙酮酸,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐;但酶脂、脲酶和甲基红（MR）试验表现出阴性反应。
碳源利用试验发现,QN2MO-1可利用肌醇、D-果糖、山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉、蜜二糖、松三糖、海藻糖、α-乳糖、无水乳糖、D-甘露醇等碳源,不可利用麦芽糖、甘露醇、D-半乳糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖;在氮源利用试验中可利用天门冬酰胺、组氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、草氨酸、苯丙氨酸、硝铵酸、硫氨酸和甲硫氨酸,但是不可利用精氨酸、丝氨酸、乙酸铵、氯化铵、酪氨酸、半胱氨酸和四水合钼酸铵。
2.4 内生细菌对多种抗生素的敏感性
由表1可知,QN2MO-1菌株对供试抗生素表现出不同的敏感性,尤其对青霉素、硫酸链霉素和氨苄西林3种抗生素表现出明显抗性,而对其他抗生素不具有抗性,这些抗生素可用于后期选择性培养QN2MO-1菌株。
表1 QN2MO-1菌株对不同抗生素的敏感性Tab. 1 Sensitivity of strain QN2MO-1 to different antibiotics |
| 抗生素 Antibiotics | 抗敏性 Antibiotics sensitivity | 抗生素 Antibiotics | 抗敏性 Antibiotics sensitivity |
|---|---|---|---|
| 克林霉素 | + | 庆大霉素 | + |
| 氯霉素 | + | 丁胺卡那 | + |
| 呋喃唑酮 | + | 头孢哌酮 | + |
| 复方新诺明 | + | 头孢曲松 | + |
| 多粘菌素B | + | 头孢他啶 | + |
| 万古霉素 | + | 头孢呋辛 | + |
| 环丙沙星 | + | 头孢拉定 | + |
| 氧氟沙星 | + | 头孢唑林 | + |
| 诺氟沙星 | + | 头孢氨苄 | + |
| 青霉素 | - | 麦迪霉素 | + |
| 红霉素 | + | 羧苄西林 | + |
| 米诺环素 | + | 氨苄西林 | - |
| 多西环素 | + | 苯唑西林 | + |
| 四环素 | + | 哌拉西林 | + |
| 新霉素 | + | 硫酸链霉素 | - |
| 卡那霉素 | + |
注：“+”“-”表示是否产生透明圈,“+”表示对抗生素敏感度;“–”表示耐药。 | |
Note: “+” and “-” indicate whether transparent rings are generated, “+” indicates sensitivity to antibiotics, “-” indicates resistance. |
2.5 QN2MO-1细菌分子生物学鉴定
通过PCR扩增反应和测序得到1个QN2MO-1共1456 bp序列片段,在GeneBank和EzBioCloud数据库中进行比对分析,通过MEGA 7.0软件邻接距离矩阵法将选取的24株与QN2MO-1同源性较高的16S rDNA基因序列共建系统发育树（图3）。结果表明,菌株QN2MO-1与Bacillus siamensis KCTC 13613T（AJVF01000043）和Bacillus amyloliquefaciens DSM 7T（FN597644）有较高同源性,处于同一分支,Bootstrap值为54%,且相似率分别为99.04%和98.76%。根据16S rDNA序列分析及进化学结果,结合形态、培养及生理生化特征,初步鉴定该菌为Bacillus sp. QN2MO-1。
2.6 内生细菌对番茄种子萌芽率的影响
设定不同浓度（10-1、10-2、10-3）的菌悬液分别处理平板的番茄种子,以菌原液和水作为对照。种子培养7 d后,10-1菌悬液处理的种子萌芽率为53.3%,是水（对照）的1.26倍;10-2菌悬液萌芽率与水处理的结果差异不显著;当菌悬液浓度下降时种子萌发率有所下降;菌原液浓度过高导致种子不萌发。因此,说明该菌液在一定浓度时具有催芽效果,尤其在10-1时处理效果最佳（图4）。
2.7 内生细菌对番茄幼苗生长的影响
番茄发芽10 d后,分析不同浓度菌液对番茄幼体生长的影响。稀释菌悬液对萌芽幼苗地上部生长影响明显优于水,10-1浓度处理的萌芽幼苗胚轴比对照的长0.46倍,10-2处理的幼苗胚轴直径比对照的增加0.29 mm,说明10-2浓度可使幼苗茎部粗壮;10-3使幼苗整体长势均匀,胚根比对照处理长2.86 mm,幼苗总长平均值为12.01 mm;观察种子总体发育情况,处理组幼苗叶片数均多于对照组（图5）。结果表明,QN2MO-1菌悬液可促进幼苗的生长。
2.8 内生细菌发酵液对番茄田间试验的结果分析
由图6可知,发酵液对开花坐果期番茄生物学性状作用均优于常规组,2.5%和5%浓度处理组的株高分别比对照高13.80 cm和33.00 cm,茎围分别增1.17 cm和1.25 cm;发酵液浓度可提高植株的开花率,分别比对照提高32.86%和52.09%。经方差分析,3个处理间叶绿素和叶表面积无明显差异。
在采果期,发现5%发酵液使叶绿素含量比对照高4.65;不同处理间可溶性固形物含量无明显差异;较常规施肥方式,茎粗随发酵液浓度增加而提高,2.5%、5%浓度处理的茎粗分别为17.17 mm和19.92 mm;从农艺学性状看,果实纵径和横径也呈递增趋势,果纵径分别增加1.78 mm和2.55 mm,果横径则分别增加1.74 mm和2.52 mm,而常规组果实大小差异明显,果纵径差74.13%,果横径差57.15%;但3个处理果形指数均为1.06,果形呈长圆形,差异不显著;在产量上,2.5%发酵液处理的单果重比对照增加16.96%,5%发酵液处理的则增加26.72%（图7）。
图7 不同浓度发酵液对番茄植株采果期形态指标的影响性状指标单位：茎粗、果纵径、果横径：mm;可溶性固形物：%;单果重：g;叶绿素含量用SPAD值表示。 Fig. 7 Effects of different fermentation liquid on fruit morphology indicators of tomato Character index units: Stem diameter, fruit longitudinal diameter, fruit transect diameter: mm; Soluble solids: %; Average weight: g; Chlorophyll content is expressed by SPAD value. |
采果后,植株生物量测定结果表明,发酵液处理组的植株长势优,浇施2.5%和5%浓度发酵液分别使整体株高比CK高0.14 m和0.38 m,整齐度也比对照91.03%高0.49%和0.84%,鲜重增加3.44%和10.78%。生物量增长则增加3.7%和6.55%（表2）。
表2 不同浓度发酵液对采果后番茄植株生物量的影响Tab. 2 Effects of different fermentation liquid on biomass of tomato plants after harvest |
| 指标 Index | 处理Treatments | ||
|---|---|---|---|
| 常规施肥（CK） Coventional fertilizing (CK) | 2.5%发酵液 2.5% Fermented liquid | 5%发酵液 5% Fermented liquid | |
| 株高/m | 3.270±0.29b | 3.410±0.29b | 3.650±0.30a |
| 鲜重/kg | 1.104±0.09b | 1.142±0.07b | 1.223±0.07a |
| 干重/kg | 0.162±0.02a | 0.168±0.01b | 0.179±0.01b |
注：不同小写字母表示0.05水平上不同处理间差异显著。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level between treatments. |
3 讨论
植物内生菌种类多样性取决于自身和寄主种类多样性,以及寄主不同部位分布的可选性[19],目前报道的原料研究对象中,内生菌多为芽孢杆菌属（Bacillu）、假单孢菌属（Pseudomonas）等,存在于至少129种大田作物及工业原料作物中[20]。2010年发现的暹罗芽孢杆菌（B. siamensis）是从泰国螃蟹腌制品中分离获得的芽孢杆菌属新种,其功能研究报道甚少,Raquel Pastor-Bueis等[21]在大田试验研究了B. siamensis液态肥对甜椒的增产效果,Amanul Islam等[22]从豆科作物中分离出一株暹罗芽孢杆菌,该菌使番茄株高增加14.66%~15.68%。作为芽孢杆菌属新种,开发功能性暹罗芽胞杆菌类菌剂有很大的研究空间。近年来,随着微生物资源库的不断扩宽,“不烂果”——诺尼的奇特药用功效早在数十年前已被科学家验证,国内学者郑学勤发现诺尼富含八碳酸可抗氧化[23],而近年来关于诺尼内生菌的报道以鉴定为主[24],并未对其功能进行研究。
基于充分开发种间横向传播微生物资源库和拓展促生剂有效成分来源的理念,从来源安全、方便收集的角度考虑,以保健性药用植物诺尼为对象,研究其内生细菌的农业应用潜能,本研究从诺尼叶、茎、果、根、花共分离筛选到621株内生细菌,分离部位的菌株数量茎>果>叶>花>根,发现除根际内生菌外,植株的其他功能部位也含有丰富的内生菌资源,并从诺尼果实中发现并分离得到Bacillus sp.。通过菌株功能测定,发现其具有高效解磷和产IAA能力。众所周知,磷是植物生长所需的营养元素之一,特别是在我国缺磷耕地达2/3以上,筛选优势解磷菌不仅可以促进作物生长[25],也可以缓解磷资源枯竭的压力。另外,已有大量研究证明植物生长素活跃于植物整个生长发育期,可促进嫩叶、茎端、根尖等细胞分化,也是种子萌发过程中生物合成的重要来源[26],早在1999年Shafiq就提出了促生菌产IAA等激素参与植物生命活动的调控过程[27,28],而且当浓度过高时反而抑制植物生长,可见IAA具有两重性,分泌量的多寡也直接干预植物生理性状的表达[29]。大量研究以根际土壤为产IAA菌株的分离筛选材料,贾西贝等[30]从碱蓬根际土壤中筛选并优化一株IAA分泌量达87.86 μg/mL的短小芽孢杆菌（B. pumilus）。本研究从诺尼果实中分离内生菌拓宽了产生长素内生菌的筛选范围。许明双[31]从番茄和水稻种子中分离得到兼具溶磷、产IAA或固氮等促生特性的内生菌可影响番茄幼苗根茎长度,Goudjal等[32]也研究发现植物内生菌可产IAA并促进番茄幼苗的生长,随着IAA处理浸泡时间的延长,可能因IAA浓度增加而抑制根部生长,另外,唐玉娟[33]通过研究论证了促生内生菌对宿主植株个体发育均有明显促进作用,经处理,植株株高、茎粗、果重、鲜重、干重等生长指标显著提高。
番茄营养丰富,既是蔬菜也是水果,全球消费量大。本研究从诺尼果实中分离到一株解磷能力达(103.42±1.07) mg/L和产IAA能力达(39.81± 0.31) μg/mL的内生细菌Bacillus sp. QN2MO-1对番茄具有明显促生效果。通过种子萌芽试验验证,不同浓度菌悬液对番茄种子和幼苗的作用有差异,菌原液可能因浓度过高反而抑制种子萌发,稀释至一定浓度时则促进幼苗不同部位的萌发和生长,说明菌液对不同部位的促进作用因浓度不同而异,可根据培养需要动态调节菌液浓度达到最佳促生效果。通过大田试验,发现发酵液对番茄生物学性状和农艺性状均具促进作用,5%发酵液更能提高番茄光合效率和有机物质总量积累,田间对照组中为农户常规施肥方式,自沤肥可能造成新的农业污染,因此,可考虑该发酵液在常规施肥中自沤肥与复合肥的替代作用,以提高养分利用率及产量,降低农业化学污染源。后续将通过抗生素标记方法对QN2MO-1菌株在番茄植株中的定殖作进一步研究。