杂草稻（Oryza sativa f. spontanea）广泛分布于世界各地的稻作产区,是一种形态上介于野生稻（Oryza rufipogon）和栽培稻（Oryza sativa）之间的稻田伴生杂草,在一些稻区已成为仅次于稗草和千金子的第三大杂草。我国自古就有杂草稻的记载,如江苏的“稆稻”“穞稻”,广东的“落禾”“野禾”,海南的“鬼禾”等。研究表明,黑色颖壳、红色果皮、易落粒等是普通野生稻的基本特征,而栽培稻主要为黄色颖壳和白色果皮,难落粒。我国杂草稻的表型丰富多样,一些杂草稻与野生稻相似,具有红色果皮、黑色颖壳等特征,部分杂草稻则具有栽培稻的黄色颖壳和白色果皮。因此,鉴定杂草稻的黑色颖壳和红色果皮的基因型对探索我国杂草稻的来源有重要的意义。
颖壳颜色是野生稻和栽培稻分化的重要表型鉴定指标之一。Maekawa[1]报道了水稻黑色颖壳性状由3对互补基因Bh-a、Bh-b和Bh-c共同调控。Gu等[2]发现了控制水稻颖壳颜色的2个QTL,位于第4染色体上的qHC4是1个主效基因,而第7染色体上的qHC7则起修饰作用。谭禄宾等[3]和邓伟等[4]以野生稻为研究材料,将黑色颖壳基因定位在第4染色体长臂端,为显性单基因控制。黄大辉等[5]发现广西普通野生稻的黑色颖壳性状也受显性单基因控制。Zhu 等[6]克隆了控制普通野生稻黑色颖壳的基因Bh4 ,栽培稻的Bh4 基因的第3外显子上有1个22 bp的缺失,导致该蛋白功能的丧失,使得颖壳变为黄色。另有研究认为水稻黑色颖壳性状受2对互补基因Bh4 和Phr1控制,只有当这2个基因都为野生型时,颖壳才表现为黑色[7,8,9]。
红色果皮也是普通野生稻和杂草稻的基本特征之一。水稻的红色果皮受2对互补基因Rc和Rd控制[10]。Rc是水稻果皮原花色素积累途径中的调节基因之一,是调控水稻红色果皮最重要的基因,Rc全长约6.4 kb,位于第7染色体上,编码1个具有bHLH结构域的调节蛋白[11,12]。绝大部分水稻白米品种中的Rc基因第7个外显子存在14 bp缺失（rc型）,小于3%的白米品种中的Rc等位基因不存在14 bp缺失,而是第7个外显子存在1个单碱基突变（Rc-s型）。rc和Rc-s基因型的水稻因序列突变而提前终止翻译,无法产生完整的蛋白,导致花青素无法合成,从而表现为白色果皮[12,13]。
本研究根据已知的Bh4和Rc基因序列设计了针对缺失位置的特异性引物,对雷州10个杂草稻群体的100株杂草稻种子的Bh4 和Rc的基因型进行了鉴定,探索雷州杂草稻Bh4和Rc基因的来源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 杂草稻种子来自广东雷州市杂草稻发生严重的10块稻田（1：调风镇;2：雷高镇;3：雷高镇;4：南兴镇;5：南兴镇;6：南兴镇;7：唐家镇;8：唐家镇;9：松竹镇;10：北和镇）,每个稻田10个单株,每株1个单穗,共100份杂草稻种子[14]。
1.1.2 试剂 植物基因组DNA提取试剂盒和PCR产物回收试剂盒购自天根生化科技有限公司,PrimeSTAR® Max DNA Polymerase购自TaKaRa公司,引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 杂草稻种子颖壳和果皮颜色的表型鉴定 取100份杂草稻的种子,手工剥壳,对种子的颖壳颜色和果皮颜色进行表型观察。
1.2.2 DNA提取 由于杂草稻有一定的异交率,种子的基因型可能与母本的基因型不一致,因此本研究取颖壳用于DNA提取。取6~10粒种子的颖壳,用液氮研磨,采用植物基因组提取试剂盒进行DNA提取,DNA的浓度与质量采用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计测定,浓度为10 ng/μL以上,且OD260/OD280值在1.7~1.9之间的DNA样品可作为后续PCR的模板,否则重新提取。并于-20 ℃保存备用。
1.2.3 引物设计、PCR扩增及序列分析 从NCBI（national center for biotechnology information）数据库中下载普通野生稻‘W1943’的Bh4基因（GenBank：FQ377546）和普通野生稻‘IRGC105491’的Rc基因（GenBank：DQ204737）的序列,分别选取Bh4和Rc基因的缺失突变位点两侧150~500 bp范围内的序列设计引物,PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测条带亮度和特异性,分别筛选出1对扩增效率高且特异性好的引物。引物名称、序列及预期片段大小见表1。
表1 引物序列Tab. 1 Primers used in this study |
| 基因 Gene | 引物 Primer | 序列(5ʹ-3ʹ) Sequence (5ʹ-3ʹ) | 片段大小 Fragment size/bp |
|---|---|---|---|
| Bh4 | Bh4D-F | CAACCAGATGCTAGTGATATGC | 192 (Bh4)/170 (bh4) |
| Bh4D-R7 | ACCACCAGTGCGTACTTGGTGAC | ||
| Rc | RcD-F1 | GCGACAGCAAGAGATGAACATC | 289 (Rc)/275 (rc) |
| RcD4-R1[15] | TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC |
PCR扩增使用PrimeSTAR® Max DNA Polymerase,反应体系包括：PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL,引物（10 μmol/L）各1 μL,模板DNA 1 μL,加灭菌水至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min;98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃延伸7 min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳检测,产物回收后送上海英骏生物技术有限公司测序。Bh4基因的PCR产物用引物Bh4D-R7进行反向测序,Rc基因的PCR产物用引物RcD-F1进行正向测序,通过测序峰图来判断序列是否存在双峰,并将测序结果与Bh4和Rc的序列进行BLAST比对分析,查看目标序列是否存在缺失,序列比对使用的软件为DNAMAN。
2 结果与分析
2.1 种子颖壳和果皮颜色的表型鉴定
取雷州的100份杂草稻的种子,观察记录颖壳颜色,手工剥壳观察果皮颜色。雷州杂草稻种子的表型丰富多样,颖壳颜色可分为：黑色、黄色和黄色带黑斑;果皮颜色可分为红色、浅红色和白色（图1）。在这100份杂草稻中,黑色颖壳的有57份,黄色颖壳的有25份,黄色带黑斑颖壳的有18份;红色果皮的有90份,浅红色果皮的有6份,白色果皮的有4份。而在57份黑色颖壳的种子中,有49份为红色果皮,5份为浅红色果皮,3份为白色果皮;在25份黄色颖壳的种子中,有23份为红色果皮,浅红色果皮和白色果皮各有1份;而18份黄色带黑斑颖壳的种子均为红色果皮。由此可见,雷州的黑色颖壳和黄色颖壳的杂草稻几乎各占一半,以红色果皮的杂草稻为主。
将雷州杂草稻的颖壳和果皮颜色的表型按群体来分类,发现雷州的10个杂草稻群体中,有7个群体以黑色颖壳表型为主,黑色颖壳的杂草稻数量>60%,分别是群体1~4和群体7~9;剩下3个群体则以黄色颖壳（含黄色带黑斑）为主,黄色颖壳的杂草稻数量>80%。雷州的杂草稻群体都是以红色果皮表型为主,每个群体的红色果皮杂草稻数量均>60%。群体2和3中有白色果皮,群体2、6、7和9中有浅红色果皮,其中群体2既有白色果皮也有浅红色果皮。
2.2 Bh4基因型的鉴定
将Bh4基因的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测,由于PCR产物较小,通过条带大小可初步判断出目标基因为野生型（Bh4）或突变型（bh4：缺失22 bp）,但杂合型（Bh4/bh4）的判断有一定难度。将PCR产物回收,送上海英骏生物技术有限公司测序,得到约160 bp/140 bp左右的核苷酸片段序列。查看测序峰图,发现部分序列约110 bp处存在后双峰,说明存在杂合型Bh4/bh4。查看这100份杂草稻Bh4基因的测序峰图,发现杂合型的有18个。将测序峰图无双峰的序列与野生稻‘W1943’的Bh4序列进行比对,发现野生型Bh4有39个,突变型bh4有43个,与PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的判断结果一致。雷州的100份杂草稻中,野生型Bh4基因的比例为39%,突变型bh4基因的比例为43%,杂合型Bh4/bh4基因的比例为18%。
2.3 Rc基因型的鉴定
将Rc基因的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测,通过条带大小难以判断出目标基因为野生型（Rc）或突变型（rc：缺失14 bp）。将PCR产物回收,送上海英骏生物技术有限公司测序,得到约260 bp/245 bp左右的核苷酸片段序列。查看测序峰图,也发现部分序列约180 bp处存在后双峰,说明存在杂合型Rc/rc。查看这100份杂草稻Rc基因的测序峰图,发现杂合型的有17个。将测序峰图无双峰的序列与普通野生稻‘IRGC105491’的Rc序列进行比对,发现野生型Rc有73个,突变型rc有10个。雷州的100份杂草稻中,野生型Rc基因的比例为73%,突变型rc基因的比例为10%,杂合型Rc/rc基因的比例为17%。
2.4 杂草稻种子表型与Bh4和Rc基因型的比对分析
将雷州杂草稻群体的颖壳和果皮颜色与其基因型进行比对分析（表2）,发现Bh4和Rc基因的杂合型分别表现为黑色颖壳和红色果皮,说明这2个基因均为显性基因,且18个Bh4杂合型的杂草稻和17个Rc杂合型的杂草稻中有9个相同。
表2 杂草稻群体的种子表型及Bh4和Rc基因型Tab. 2 Seeds phenotypes and their corresponding Bh4 and Rc genotypes of weedy rice population |
| 群体 Population | 颖壳颜色 Hull color | 果皮颜色 Pericarp color | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 黑色Black | 黄色/黄色带黑斑 Yellow/Yellow with black spots bh4 | 红色Red | 白色/浅红色White/Light red rc | |||
| Bh4 | Bh4/bh4 | Rc | Rc/rc | |||
| 1（调风镇） | 9 | 1 | 0 | 9 | 1 | 0 |
| 2（雷高镇） | 4 | 2 | 3/1 | 6 | 0 | 3/1 |
| 3（雷高镇） | 5 | 2 | 3/0 | 7 | 2 | 1/0 |
| 4（南兴镇） | 4 | 3 | 3/0 | 4 | 6 | 0 |
| 5（南兴镇） | 1 | 0 | 4/5 | 10 | 0 | 0 |
| 6（南兴镇） | 0 | 2 | 2/6 | 5 | 3 | 0/2 |
| 7（唐家镇） | 7 | 1 | 1/1 | 7 | 2 | 0/1 |
| 8（唐家镇） | 4 | 2 | 4/0 | 10 | 0 | 0 |
| 9（松竹镇） | 5 | 4 | 0/1 | 6 | 2 | 0/2 |
| 10（北和镇） | 0 | 1 | 5/4 | 9 | 1 | 0 |
| 合 计 | 39 | 18 | 25/18 | 73 | 17 | 4/6 |
从颖壳和果皮颜色的表型与基因型的比对可知,雷州10个杂草稻群体的颖壳颜色和果皮颜色的表型与基因型是一致的。黑色颖壳杂草稻的Bh4为野生型和杂合型,黄色和黄色带黑斑颖壳杂草稻的Bh4均为突变型,说明黑斑可能为病斑或其它因素造成的。红色果皮杂草稻的Rc为野生型和杂合型,白色和浅红色果皮杂草稻的Rc均为缺失14 bp的突变型,且测序的序列中无其他碱基突变。前人研究报道了1个浅红色果皮的Aus栽培稻,为Rc-S基因型[13],本研究中的浅红色果皮的杂草稻却为rc基因型,推测可能是因为其Rc基因有其他的碱基突变,或者存在另外的控制果皮颜色的基因在起作用。
3 讨论
3.1 水稻黑色颖壳基因Bh4
本研究中,雷州杂草稻的颖壳颜色的表型与Bh4基因型完全一致。黑色颖壳的杂草稻有57份,对应的Bh4为39份野生型和18份杂合型,对其中的1份黑色颖壳杂草稻的Bh4全基因进行了测序（数据未显示）,发现其与野生稻‘W1943’的Bh4基因序列完全一致,说明雷州杂草稻的野生型Bh4基因很可能来源于野生稻。黄色颖壳（含黄色带黑斑）表型的杂草稻有43份,对应的Bh4的基因型均为缺失22 bp的突变型,不存在其他2种突变型,说明雷州杂草稻的Bh4突变型基因可能有相同的栽培稻来源。雷州的Bh4基因的野生型和突变型杂草稻几乎各占一半,但突变型Bh4基因的杂草稻主要集中在3个群体中,说明雷州10个群体的杂草稻的来源可能并不完全相同。
3.2 水稻红色果皮基因Rc
国内外学者对杂草稻的Rc的基因型进行了研究。Gross等[22]对Rc基因测序发现,美国杂草稻为Rc野生型,与Aus水稻和普通野生稻亲缘关系更近。Cui 等[23]研究发现,马来西亚杂草稻的Rc单倍型可能至少有3个不同的来源：红色果皮野生稻、红色和白色果皮栽培稻。李潇艳[15]研究发现,江苏省红色果皮杂草稻Rc均为野生型,系统进化树分析表明江苏杂草稻最接近普通野生稻,其次是红色果皮栽培稻;而我国白色果皮杂草稻则来源于当地栽培稻与杂草稻的基因交流。张树林等[24]对Rc基因研究发现,红色果皮杂草稻的Rc均为野生型,在粳稻区,白色果皮杂草稻可能由栽培稻退化返祖形成;在籼稻区,红色果皮杂草稻可能由栽培稻之间或与野生稻杂交演化而来。
本研究中,雷州杂草稻的果皮颜色的表型与Rc基因型基本一致。红色果皮杂草稻有90份,对应的Rc为73份野生型和17份杂合型,说明雷州杂草稻中Rc基因主要为野生型,可能来源于野生稻或红色果皮栽培稻。白色/浅红色果皮杂草稻有10份,对应的Rc基因型均为缺失14 bp的突变型（rc）,无其他Rc基因型,说明雷州杂草稻中的突变型rc基因可能有相同的栽培稻来源。
3.3 雷州杂草稻的来源分析
本研究中,根据Bh4和Rc基因型来推测,雷州杂草稻的野生型Bh4来源于野生稻,野生型Rc来源于野生稻或红色果皮栽培稻,突变型Bh4和Rc则来源于栽培稻。因此,雷州杂草稻中具有野生型基因（Bh4、Rc和sh4）的杂草稻可能来源于野生稻,可能是野生稻入侵农田,或野生稻的基因渐渗入当地杂草稻,或野生稻与栽培稻的杂交后代。而具有突变型基因（Bh4、Rc和sh4）的杂草稻可能是栽培稻的去驯化或籼梗杂交后代,或者是栽培稻驯化基因渐渗入野生型基因杂草稻的后代。此外,雷州杂草稻中杂合型的Bh4、Rc和sh4的比例分别为18%、17%和15%[14],说明雷州杂草稻之间或杂草稻与栽培稻之间有一定程度的基因交流,从而导致各种杂合性状的杂草稻的产生,使得雷州杂草稻的表型丰富多样。