蔗糖转化酶（sucrose invertase）,是调节蔗糖代谢的关键酶之一,能不可逆地催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖,其不仅存在于光合作用组织中,也广泛存在于根、果实等非光合作用的组织中。根据亚细胞定位不同,分为细胞壁、液泡和胞质转化酶3类;根据酶的最适pH不同,可将转化酶分为酸性和中性或碱性两类,研究表明蔗糖转化酶在调节韧皮部蔗糖卸载、控制贮藏器官中糖分的组成、细胞渗透调节及参与果实对逆境胁迫的响应与信号转导等方面都具有重要作用[1]。细胞壁转化酶和液泡转化酶属于酸性转化酶,具有相似的酶学特性,最适pH为4.5~5.5,可水解蔗糖和其他β-果糖类寡糖,因此又被称为β-呋喃果糖苷酶（β-Fructofuranosidase）[2],多样化程度较高,细胞壁酸性转化酶（cell wall acid invertase, CWIN）在生长发育过程中起着维持植物渗透胁迫和逆境应答的作用,进一步研究发现细胞壁蔗糖转化酶与维管束植物共演化,而液泡酸性转化酶（vacuolar acid invertase, VIN）是己糖积累的重要调节因子,在果实发育后期及采后蔗糖代谢中发挥着重要作用[3]。
菠萝果实中绝大部分的糖都在液泡中积累,酸性转化酶基因的表达受器官和发育特异性、糖信号、胁迫及激素的调节,而酶活性则受反应产物和内源蛋白抑制子的调节,菠萝酸性转化酶在果实收获前期活性降低,与菠萝果实蔗糖的大量积累呈现负相关[4],前人在玉米中研究发现干旱胁迫可诱导液泡酸性转化酶基因Ivr2的表达,促使植株中葡萄糖和果糖的积累,但在不同的器官中其调控模式并不相同[5]。已有研究结果表明,番茄细胞壁转化酶基因LIN6在防御应激反应途径中发挥着重要作用,可被茉莉酸甲酯和脱落酸诱导,并且在低温胁迫下可维持叶片中较高光合速率和可溶性糖含量增强植株的耐寒性[6]。而液泡酸性转化酶则在果实成熟过程中发挥主要作用,研究发现番茄中液泡酸性转化酶基因SlVI受果实成熟抑制转录因子RIN的直接调控,与液泡酸性转化酶抑制子基因SlVIF相互作用调控果实的糖代谢进而影响乙烯的产生和果实的成熟[7]。果蔬贮藏过程中液泡酸性转换酶活性可影响贮藏器官中糖组分及耐冷性,研究发现桃果实PpVIN2在冷害中被大量诱导,在低温冷藏中的糖代谢机制扮演重要角色[8],而马铃薯液泡酸性转化酶基因KCVIN1和KCVIN2被证明是冷藏过程导致马铃薯低温糖化的关键基因[9]。酸性转化酶基因家族与果蔬品质和抗逆性大小有着极为密切的联系,酸性转化酶基因的功能已陆续在其他物种如甘蔗[10]、无核柑橘[11]、辣椒[12]中得到鉴定和研究。已知酸性转化酶基因在植物中以家族存在,成员数量因物种不同而异,菠萝采后蔗糖的降解与酸性转化酶关系密切,但目前尚无在基因组水平上的报道,2015年菠萝（Ananas comosus L. Merr）基因组测序完成[13],为在全基因组水平上对其进行基因家族系统的生物信息学分析和重要功能基因的发掘提供了良好的平台。菠萝果实采后贮藏过程中面临各种逆境胁迫,因此对酸性转化酶基因家族生物信息学和表达特性的研究,对进一步研究酸性转化酶在菠萝采后贮藏过程中蔗糖降解和果实品质形成及逆境胁迫方面具有十分重要的意义,也可为菠萝冬季果升糖降酸提高果实品质及采后贮藏保鲜奠定理论基础。
本研究基于全基因组测序结果对菠萝酸性转化酶基因家族成员进行预测,并对菠萝采后不同温度贮藏下该家族基因的表达水平进行分析,为进一步鉴定采后菠萝果实蔗糖降解的关键基因以及研究其与黑心病发病的关联奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以禾本科‘巴厘’菠萝为研究对象,供试菠萝采自广东省湛江市徐闻县菠萝试验基地,选取无病虫害、无机械损伤、果实大小一致的六至七成熟果实,用0.5 g/L咪鲜胺浸泡果实10 min,捞出置于阴凉通风处,待风干后将试验用果放在套有0.02 mm聚乙烯薄膜袋的镂空塑料筐中,室温下（20 ℃）贮藏,并于3、6、9 d切开果实,在近果髓处进行取样,在9 d时选取果实一侧（以果髓为中心）发生黑心病的果肉和一侧未发生黑心病的健康果肉,立即用液氮速冻以备提取RNA;在另一次独立实验中将实验用果进行同样处理,之后分别放于10、25、38 ℃的恒温培养箱中贮藏,并于贮藏3、6、9 d进行取样,取样部位为菠萝果实远果髓处果肉,立即用液氮速冻,置于-80 ℃超低温冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 菠萝AcAINs基因家族的筛选 在数据库网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome搜索与菠萝亲缘关系较近的水稻酸性转化酶氨基酸序列（AAF87246）,并以其保守结构域为探针在植物基因组网址（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/ portal.html）和菠萝基因数据库（http://pineapple. angiosperms.org/）Blast搜索,利用Pfam和SMART对搜索到的候选基因进一步确认,同时获得其CDS、氨基酸序列及染色体位置信息。
1.2.2 菠萝AcAINs基因的鉴定及生物信息学分析 RNA提取采用植物RNA提取试剂盒（华越洋生物科技有限公司）。反转录试剂盒选用M-MLV反转录试剂盒（TaKaRa）,参照已测序菠萝基因组中AcAINs编码区序列,设计相应的全长引物。
测定菠萝AcAINs基因家族的基本理化性质,利用在线工具Expasy（http://web.expasy.org/ protparam/）进行分析蛋白分子量、等电点、不稳定指数、总平均疏水性、脂溶系数,二级结构及亚细胞定位预测分别运用https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html及Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行预测,菠萝及水稻、番茄的AINs蛋白序列多重比对利用Clustal W（1.83）进行,系统进化树运用MEGA 6.0软件Neighbor-joining绘制,BootStrap值为1000,其余参数均为默认值,菠萝AcAINs基因内含子和外显子结构分析采用在线软件GSDS 2.0（Gene Structure Display Server,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）进行分析,氨基酸序列的蛋白质保守区域在NCBI在线网站进行分析,蛋白保守基序分析采用在线工具MEME 4.0 （http://meme-suite.org/tools/meme）进行,基序长度设为6~200个氨基酸,基序大数目设置为5,保守基序功能注释运用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在线工具。
表1 AcAINs基因的引物序列Tab. 1 Primer sequence of AcAINs genes |
| 基因名称Gene name | 正向引物Forward primer (5°-3°) | 反向引物Reversed primer (5°-3°) |
|---|---|---|
| Actin | CTGGCCTACGTGGCACTTGACTT | CACTTCTGGGCAGCGGAACCTTT |
| AcVIN1 | ATGGATGGCCCAGATGATCTCGTCCG | TCAACTATTGGTTTGATTAGAGTATGG |
| AcVIN2 | ATGGACGAGAGCGATCTCACCCT | TTAAGCTTCAGCAGGGTAGGGTTGGT |
| AcCWIN1 | ATGTACTACAATGGAGTCTACCACC | CTAGATCTCTCCGTCATTCATGCGA |
| AcCWIN2 | ATGAAACCAGGACCAATGTACTACA | CTAGTTTTCATTAATTTTGGCCT |
| AcVIN1(qPCR) | AGACGGATCTGCTCAAAGGGTG | TGATGCTGCTGAAGTTCGTGCTA |
| AcVIN2(qPCR) | GACGGACTTCAGCGGCATCA | CGCCTCCTTCGGAATCTCAAACT |
| AcCWIN1(qPCR) | TTTATCCGAGTTTGGCAGTAG | ATTCTTCATCTCCCATCCCT |
| AcCWIN2(qPCR) | ACAATAACGGGTGCTGGTC | GATACGGGTCGGTTAGGTT |
2 结果与分析
2.1 菠萝AcAINs基因家族的克隆及鉴定
通过基因名查找在菠萝基因组数据库里找到4个酸性转化酶基因（2个AcCWINs和2个AcAINs）,将其分别命名为AcCWIN1、AcCWIN2 和AcVIN1、AcVIN2,以提取的菠萝果肉RNA为模板,用设计的全长特异性引物进行RT-PCR扩增,分别得到大小为1539、1527、1929、1914 bp的DNA片段（图1）,将目的DNA片段测序后通过NCBI Blast序列比对,结果显示,所克隆的AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2全长序列与基因组已预测的对应的菠萝基因具有较高的同源性,分别为99.48%、90.98%、92.25%、99.57%,证明所克隆的目的基因为预测的菠萝细胞壁酸性转化酶基因和菠萝液泡酸性转化酶基因。其基本理化性质的分析结果见表2,2个AcCWINs均分布在20号染色体上,AcVIN1分布在3号染色体上,而AcVIN2分布在22号染色体上,相应蛋白的氨基酸数目为508~642个,分子量在57.19~70.98 kDa之间;AcCWIN1等电点为8.50呈碱性,AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2等电点均小于7.0,呈酸性;AcVIN1和AcCWIN1蛋白不稳定指数小于40,为稳定蛋白,AcVIN2和AcCWIN2不稳定指数大于40,为不稳定蛋白;所有的AcAINs蛋白为亲水性蛋白。其蛋白二级结构的分析结果见表3,4个AcAINs蛋白二级结构均由α-螺旋、扩展链结构、β-转角和无规则卷曲组成,且各组成的百分比均为无规则卷曲>扩展链结构>α-螺旋>β-转角。亚细胞定位预测AcCWIN1和AcCWIN2定位于细胞壁,而AcVIN1和AcVIN2定位于液泡中。
图1 菠萝AcAINs基因家族的PCR扩增M: DL5000 DNA Marker; 1: AcCWIN1; 2: AcCWIN2; 3: AcVIN1; 4: AcVIN2. Fig. 1 PCR amplication of pineapple AcAINs gene family |
表2 菠萝酸性转化酶基因家族信息Tab. 2 Information on AcAINs gene family in pineapple |
| 基因名称 Gene name | 基因编号 Gene ID | 染色体 Chr. | 氨基酸数量Amino acid/aa | 分子量 Mw/kDa | 等电点 pI | 不稳定指数 Instablity index | 总平均疏水指数 Grand everage of hydropathicity | 脂溶指数 Fat soluble index |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AcVIN1 | Aco016281.1 | 3 | 642 | 70.98 | 5.14 | 35.38 | -0.290 | 79.58 |
| AcVIN2 | Aco017533.1 | 22 | 637 | 69.63 | 5.08 | 44.06 | -0.309 | 75.97 |
| AcCWIN1 | Aco023030.1 | 20 | 512 | 57.60 | 8.50 | 34.99 | -0.422 | 75.53 |
| AcCWIN2 | Aco023036.1 | 20 | 508 | 57.19 | 5.24 | 44.66 | -0.429 | 78.72 |
表3 菠萝酸性转化酶蛋白的二级结构及亚细胞定位Tab. 3 The secondary structure and subcellular location of AcAINs protein in pineapple |
| 基因名称 Gene name | α-螺旋 α-helix | 扩展链结构 Extended chain structure | β-转角 β-corner | 无规则卷曲 Random coil | 亚细胞定位 Subcellular locations |
|---|---|---|---|---|---|
| AcVIN1 | 94 | 154 | 39 | 355 | 液泡 |
| AcVIN2 | 93 | 162 | 36 | 346 | 液泡 |
| AcCWIN1 | 74 | 137 | 29 | 272 | 细胞壁 |
| AcCWIN2 | 83 | 132 | 29 | 264 | 细胞壁 |
2.2 菠萝AcAINs基因家族基因结构、蛋白保守基序及系统进化分析
基因结构分析结果表明,菠萝的AcAINs基因结构均由外显子和内含子组成,AcCWIN1和AcVIN1均有5个内含子,AcCWIN2含有3个内含子,而AcVIN2含有6个内含子（图2）。与模式植物水稻、番茄及其他植物AINs蛋白序列的系统进化树分析结果表明,AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2分别与其他植物的细胞壁酸性转化酶蛋白和液泡酸性转化酶蛋白聚类在一起（图3）。NCBI在线CDD分析结果发现,AcCWIN1和AcCWIN2均只含有1个Glyco_32结构域,而AcVIN1和AcVIN2除含有Glyco_32结构域外,在其N端还含有1个功能未知的DUF3357结构域,说明该家族基因属于糖基水解酶基因家族GH32（图4）。菠萝AcAINs蛋白保守基序MEME预测结果如图5所示,基序分析中,4个AcAINs蛋白的5个保守基序位置和序列均较为相似,并利用SMART和Pfam对预测的保守基序进行命名（表4）。
图3 菠萝与其他物种酸性转化酶蛋白系统进化树分析Fig. 3 Phylogenetic tree of acid invertase proteins from pineapple and other species |
图4 AcAINs蛋白结构域斜纹区域和网格区域分别表示AcAINs蛋白的DUF3357和Glyco_32结构域。 Fig. 4 Structure of AcAINs proteins Twill area and mesh area represent DUF3357 and Glyco_32 domains of AcAINs proteins. |
表4 菠萝酸性转化酶基序氨基酸序列及功能Tab. 4 Function name of motif sequences of AcAINs |
| 基序 Motif | 基序序列 Motif sequence | 基序功能名称 Motif function name |
|---|---|---|
| 1 | WYHLFYQYNPDGAVWGNITWGHAVSRDLINWLYLEPAMVPDZPYDINGVW | Glyco_hydro_32N |
| 2 | LRYDYGKFYASKTFYDPVKKRRILWGWSGESDSESDDILKGWAGIQTIPR | Glyco_hydro_32N |
| 3 | SGSATILPDGRPIILYTGSDTDSVQVQNJAFPADPSDPLLRKWVKPDYNP | Glyco_hydro_32N |
| 4 | JSLRTLIDHSIVESFGQGGRTCITSRVYP | Glyco_hydro_32C |
| 5 | HKGAAILYKSRDFVRWELAPGPLHTVGGTGMWECPDFYPV | Glyco_hydro_32N |
2.3 菠萝AcAIVs基因家族在采后不同时期及黑心病部位中的表达分析
对室温（20 ℃）贮藏近果髓果肉（靠近果心处约1 cm）及10、25、38 ℃贮藏过程中远果髓果肉不同时期的样品提取RNA并进行反转录,用设计的荧光定量引物进行定量表达分析。结果表明,在室温贮藏试验中,AcCWIN1和AcCWIN2基因相对表达量随贮藏时间延长逐渐降低,而AcVIN1和AcVIN2基因则随贮藏时间延长相对表达量逐渐升高,比较黑心病发病果肉和健康果肉中4个基因的相对表达量发现,AcCWIN1基因表达量在二者之间差异不显著,AcCWIN2和AcVIN2基因表达量在黑心病发病果肉中显著下调,而AcVIN1则在黑心病发病部位中显著上调（图6）。在不同贮藏温度试验中,随着贮藏时间的延长,菠萝果肉中AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2基因表达量的变化趋势与室温贮藏下表达量的变化趋势相一致,在25 ℃时贮藏3 d和6 d的菠萝果肉中AcAIN1和AcVIN2的相对表达量均比10 ℃和38 ℃贮藏条件下高,其中25 ℃贮藏6 d时,AcVIN1基因表达量急剧升高至最大值后降低;在38 ℃贮藏9 d时,AcVIN1基因的相对表达量达到峰值;在25 ℃贮藏6 d及10 ℃和38 ℃贮藏9 d时AcVIN2基因的相对表达量均达到最大值（图7）。
图6 菠萝AcCWIN1、AcCWIN2、AcVIN1、AcVIN2基因在采后室温贮藏过程中表达量变化9H：健康果肉贮藏9 d;9B：发病果肉贮藏9 d。不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 6 Relative expression of AcCWIN1, AcCWIN2, AcVIN1, AcVIN2 genes in pineapple at room temperature during postharvest storage 9H: The healthy pulp was stored for 9 days; 9B: The diseased pulp was stored for 9 days.Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05). |
图7 菠萝AcCWIN1、AcCWIN2、AcVIN1、AcVIN2基因在采后不同温度贮藏中表达量变化不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 7 Relative expression of AcCWIN1, AcCWIN2, AcVIN1, AcVIN2 genes in pineapple at different temperature during postharvest storage Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05). |
3 讨论
糖代谢是果实色泽、风味形成及其他营养物质代谢的重要基础,是决定果实品质和商品价值的主要因素,在采后果实品质和成熟衰老调控方面,糖代谢的合理调控更为重要[15]。‘巴厘’菠萝以积累蔗糖为主,采后蔗糖的降解与蔗糖转化酶的关系密不可分,然而菠萝果实酸性转化酶基因的研究尚未见报道,随着植物基因组学研究的广泛深入以及广泛的基因家族分析,酸性转化酶家族已相继在其他物种陆续得到鉴定和研究,如番木瓜基因组中发现有6个酸性转化酶基因,其中3个细胞壁转化酶基因,3个液泡转化酶基因[16];辣椒中含有9个酸性转化酶基因,2个属于液泡酸性转化酶,7个属于细胞壁酸性转化酶[17];水稻编码9个细胞壁酸性转化酶基因（OsCIN1-9）和2个液泡酸性转化酶基因（OsVIN1-2）[18,19]。本研究在菠萝全基因组数据库中共发现2个细胞壁转化酶基因（AcCWIN1和AcCWIN2）和2个液泡转化酶基因（AcVIN1和AcVIN2）,基因克隆扩增出的条带与预期大小相同且测序正确,前人研究表明植物酸性转化酶基因的原始结构为7个外显子6个内含子,在进化过程中可出现多次内含子丢失事件,导致其基因结构的多样性[16]。在本研究中AcVIN2保留了原始基因的结构,AcCWIN1和AcVIN1在进化过程中均丢失了1个内含子,而与AcCWIN1位于同一染色体的AcCWIN2则进化程度较高,在进化过程中丢失一部分内含子和氨基酸序列。酸性转化酶蛋白系统进化分析表明,菠萝AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2氨基酸序列均能与其他植物的细胞壁转化酶和液泡转化酶蛋白分别聚类在一起,且与单子叶植物水稻、油棕、海枣等亲缘关系较近。保守域预测发现AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2编码蛋白均属于糖基水解酶家族32（GH32）,AcCWIN1、AcCWIN2编码蛋白均含1个典型的Glyco_32结构域,而AcVIN1和AcVIN2编码蛋白则含有2个保守结构域即位于 N-端的Pfam DUF3357结构域和Glyco_32结构域。保守基序分析发现,菠萝AcAINs成员均含有5个保守基序,位置序列相对一致。
蔗糖代谢平衡在果实品质形成及抗逆性大小方面起着重要的作用,菠萝果肉细胞内积累了大量的蔗糖及酚类物质,蔗糖代谢平衡在菠萝果实后熟品质形成以及黑心病的触发阶段发挥重要作用。本研究采后菠萝果实AcAINs基因在贮藏过程中的表达差异情况表明,在整个贮藏过程中,AcCWIN1、AcCWIN2在室温及不同贮藏温度下相对表达量逐渐降低,且贮藏温度越高,其表达所受到的抑制程度越大。早期研究认为水稻细胞壁转化酶OsVIN1主要通过卸载质外体蔗糖为子代组织提供碳源[19],在谷粒发育早期表达丰度较高后期降低,这与菠萝AcCWIN1的表达量在果实贮藏过程中逐渐降低的趋势较为一致,说明AcCWINs可能在菠萝果实发育早期发挥更为重要的作用,而在菠萝果实采后贮藏过程中蔗糖的降解可能主要发生在液泡,菠萝细胞壁转化酶与采后菠萝蔗糖降解关系不密切。AcCWIN1在发生黑心病和健康果肉中的表达量不显著,而AcCWIN2在发生黑心病果肉中由于黑心病引发系列的代谢失调其表达量显著下调,说明菠萝细胞壁转化酶基因与黑心病的发病并不相关。AcVIN1、AcVIN2基因则在贮藏过程中表达量逐渐升高,说明AcVIN1、AcVIN2虽然在菠萝果肉中表达丰度较低,但在菠萝果实采后贮藏蔗糖降解过程中发挥了更为重要的作用,而AcVIN2和AcVIN1在黑心病发病部位与健康部位的表达量差异表明,AcVIN1的过量表达可能与菠萝黑心病发病有着密切的联系,这与Fukuoka等[20]研究发现液泡酸性转化酶IbAIV基因的表达水平与甘薯黑心病的发病程度密切相关的结论较为一致,在发病程度严重的区域检测到较高水平的果糖和葡萄糖含量,而细胞内高浓度的糖含量可触发活性氧ROS的产生,ROS继而引发酚类物质的积累及细胞膜完整性的破坏导致黑心病的发生,而‘巴厘’菠萝果实采后贮藏过程易发黑心病,褐变底物等酚类物质主要聚集在液泡,是否是因为AcVIN1在液泡中大量表达引起较高水平的果糖和葡萄糖含量而导致了黑心病的发生?蔗糖的降解速率是否与菠萝的后熟进程及黑心病的发病有着密切的联系[21]?这一具体机制还需要更深入和进一步的研究。
本研究对菠萝酸性转化酶基因家族进行了初步分析,为深入研究该基因家族的表达调控、结构和功能等提供参考数据及从整体水平上弄清酸性转化酶调控采后菠萝蔗糖降解机制,通过调控其表达来达到增强果实品质及提高果实抗逆性的目的。