MADS-box基因家族是一类序列相对保守的基因家族,它编码的蛋白具有激活或抑制目的基因转录表达的作用,广泛分布于真核生物中,最先在Minichromosome Maintenance（酵母菌代谢调节因子）[1]、Agamous（拟南芥花器官发育决定因子）[2]、Deficienns（金鱼草花器官发育决定因子）[3]和Serum Response Factor（人类血清反应因子SRF4）[4]4个基因的研究中确定其存在,因此,取各基因的首字母而命名为MADS-box基因家族。
前人对于MADS-box基因的研究最早是从拟南芥和金鱼草的花形态突变体开始的[5],深入研究后,不仅从番茄[6]、葡萄[7]、荷花[8]、小麦[9]等植物中克隆出MADS-box基因家族相关基因,还发现MADS-box基因除了与花形态建成调控[10]有关外,还在促进根的形成[11]、分生组织的分化[12]、开花时间的调控[13]、花粉成熟[14]、种子和果实发育成熟[15,16]等众多方面发挥着重要作用,与植物的生长发育密切相关。
在橡胶树MADS-box基因家族的相关研究中,Dornelas等[17]发现HbLFY基因在产生花序的侧分生组织和所有花分生组织中均有表达,推测HbLFY与植物开花相关;华玉伟等[18]对HbFCA基因进行克隆与功能分析,推测HbFCA基因参与植物开花起始的调节;王辉等[19]克隆了MADS27基因,推测在开花过程中起调控作用;魏利然等[20]对HbMADS4基因进行克隆与功能分析,推测其作为一个负调控因子调控合成天然橡胶;王亚杰[21]克隆并功能验证了MADS-box家族的26个基因,发现该家族相关基因在茎尖、花器官显著高调表达,推测其在花形态建成和生殖发育过程中起显著作用。
本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97’品种古铜期嫩叶为材料,制备染色体标本,利用荧光原位杂交技术对MADS-box基因家族中的HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1共6个基因进行染色体定位,从而揭示MADS-box基因家族分别在细胞核染色体上的实际位置,同时分析各个基因之间的分布特点,这有利于完善功能基因的分子细胞遗传学信息,为MADS-box基因功能研究提供新的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.2 特异性引物的设计与筛选 根据MADS- box基因家族中6个基因的登录号在NCBI上找到目的基因序列,利用NCBI上在线比对软件BLAST程序进行序列同源性比对,找到序列比对同源性最高的（98%以上）巴西橡胶树‘热研7-33-97’品种全基因组序列。使用Primer Permier 5设计引物。以橡胶树基因组DNA为模板进行PCR扩增,反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,48~60 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30个循环;72 ℃后延伸7 min。将PCR产物进行凝胶电泳检测,检验产物是否为单一条带。单一条带且长度符合的PCR产物测序后用DNAMAN软件进行多序列比对,判断是否符合引物的特异性。最后将6个对应基因PCR扩增单一目的条带产物纯化,检测其浓度,于-20 ℃保存。筛选得到特异性引物见表1。
表1 MADS-box基因家族PCR扩增的特异引物Tab. 1 Primers used for amplifying MADS-box genes family |
| 基因名称 Gene name | 基因登录号 Gene No. | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) | 引物长度 Primer length/bp | 扩增片段长度 Amplified fragment length/bp |
|---|---|---|---|---|
| HbAGL30 | KY471163.1 | CTTCCCAATAGGTAGCA ACCAGGGTTAGAGTCGT | 17 | 1208 |
| HbTT16 | KY471155.1 | TCCTCCTCCAACATTCGC ACCAGACCACAAGGCAAG | 18 | 1998 |
| HbAGL8 | KY471148.1 | CTCCTCCAATCCCACAT TACCACCACCGTCAACA | 17 | 1084 |
| HbAG15 | KY471151.1 | ATAGCCCTACTAAAGAACA ATAGAATAAGAAACGCACA | 19 | 1222 |
| HbAP1 | KY471161.1 | TATCCGTGAGTTGTGCCT CTTTGCCTTGAGTCTGTT | 18 | 1743 |
| HbSVP1 | KY471154.1 | TCAGTTCACGGGTCTTC CTACTCCTGCCTTTGTC | 17 | 1259 |
1.2.3 探针的制备 将扩增纯化后的6个基因的特异DNA序列中HbAGL8、HbTT16和HbAP1基因用生物素切口平移（BIO-Nick Translation Mix）试剂盒标记成探针,信号位点呈红色。HbAG15、HbAGL30和HbSVP1基因用地高辛切口平移（DIG-Nick Translation Mix）试剂盒标记成探针,信号位点呈绿色。探针纯化后于-20 ℃保存待用。
1.2.4 荧光原位杂交 参照官锦燕[24]的方法,并稍作改进,操作如下：首先将染色体形态良好且分散的染色体标本于70 ℃烘箱中恒温处理2 h左右,起牢化作用,做好标记区分正面;37 ℃下使用10 mg/mL RNA酶溶液处理1 h,减少杂信号影响,使特异信号清晰;在70 ℃预热后的70%去离子甲酰胺中变性5 min后快速放入预冷的70%、90%和100%酒精各脱水5 min,用冷风吹干;滴加45 μL经变性处理后的杂交液[50%去离子甲酰胺,10%硫酸葡聚糖,2×SSC（柠檬酸缓冲液）,0.5 mg/mL鲑鱼精DNA,20 ng/μL已标记探针]在标本正面中央,盖上盖玻片并用指甲油封片后放入杂交仪中,先于90 ℃变性10 min,后于37 ℃孵育16~24 h;孵育结束后用刀片轻轻揭开盖片,依次在2×SSC溶液中洗涤10 min、20%去离子甲酰胺（42 ℃）静置10 min、2×SSC溶液中洗涤5 min,1×PBS溶液中洗涤5 min。
级联荧光信号显示与放大操作如下：首先滴加50 μL由终浓度为20 μg/mL鼠抗地高辛-Alexa Fluor488、终浓度为10 μg/mL链亲和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）和1%牛血清白蛋白（中文名称）配制成的混合液,孵育1 h;然后滴加总体积50 μL的终浓度为20 μg/mL兔抗鼠-Alexa Fluor 488[Alexa Fluor 488-Affinipure Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)]、终浓度为10 μg/mL生物素化抗链亲和素（Biotinylated Anti-streptavidin）和1% BSA配制成的混合液,孵育40 min;再次滴加总体积50 μL的终浓度为20 μg/mL鼠抗兔- Alexa Fluor 488（Alexa Fluor 488-Affinipure Mouse Anti-Rabbit）、终浓度为10 μg/mL链亲和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）孵育和1% BSA配制成的混合液,孵育40 min,在每次孵育过后都需经过1×PBS洗涤各3次,洗涤过程均需在水平摇床（WD-9405B型）上中速震荡洗涤,每次洗涤时间分别是5、5、8 min。最后用40 μL 10 μg/mL的DAPI（抗淬灭剂稀释）染色,盖上盖片并用指甲油封片。实验过程在避光条件下进行。
1.2.5 镜检与分析 在杂交后的染色体标本正面滴加适量的镜油后,用荧光显微镜（型号BX51TR-32FA1-A03）观察,选择WBV荧光激发块,用Image-Pro Plus软件中文版6.0进行拍照保存,第3通道观察对染色体进行拍照,染色体呈蓝色,第2通道观察生物素标记的杂交位点为红色,第1通道观察地高辛标记的杂交位点为绿色,用Photoshop CS6软件和Adobe Illustrator CS6软件处理图片。
$扩增信号位点的百分距离=\frac{扩增信号位点到着丝粒的距离(\mu m)}{扩增信号位点所在染色体臂的长度(\mu m)} \times 100$
2 结果与分析
2.1 HbAGL8和HbAGL15基因的FISH检测与物理定位分析
制作探针时,HbAGL8目的序列用生物素标记,HbAGL15目的序列用地高辛标记,然后进行双探针荧光原位杂交实验,以检测其在染色体上的实际位置。杂交检测过程中2个基因的信号位点在细胞分裂间期、前期和中期均能同时检测到,并且红色和绿色荧光位点明显分布在不同的染色体上（图2A、图2B、图2C）;阴性对照试验中,不加入探针进行荧光原位杂交,用荧光显微镜检测时检测不到任何荧光信号（图2D）。以高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97’品种的核型所得的核型参数为依据,进行中期染色体核型分析,得到核型图（图2E）和核型模式图（图5）。结果表明,HbAGL8定位在5号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离平均值为39.71;HbAGL15位于4号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离平均值11.85。
图2 HbAGL8与HbAGL15在‘热研7-33-97’有丝分裂不同时期染色体上荧光原位杂交（FISH）检测A：间期;B：前期;C：中期;D：阴性对照;E：中期细胞核型图;红色：HbAGL8信号位点;绿色：HbAGL15信号位点。 Fig. 2 Fluorescence in situ hybridization (FISH) of HbAGL8 and HbAGL15 on chromosomes at different stages of mitosis in ‘7-33-97’ A: Interphase; B: Prophase; C: Metaphase; D: Negative control; E: Cell karyotype; Red: HbAGL8; Green: HbAGL15. |
2.2 HbAGL30和HbTT16基因的FISH检测与物理定位分析
制作探针时,HbTT16目的序列用生物素标记,HbAGL30目的序列用地高辛标记,进行双探针荧光原位杂交实验,检测其在染色体上的实际位置。杂交检测过程中2个基因的信号位点在细胞分裂间期、前期和中期均能同时检测到,并且红色和绿色荧光位点明显分布在不同的染色体上（图3A、图3B、图3C）;阴性对照试验中,不加入探针进行荧光原位杂交,用荧光显微镜检测时检测不到任何荧光信号（图3D）。以高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97’品种的核型所得的核型参数为依据,进行中期染色体核型分析,得到核型图（图3E）和核型模式图（图5）。结果表明：HbTT16定位在1号染色体短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离平均值为22.19;HbAGL30位于7号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离平均值48.94。
图3 HbTT16与HbAGL30在‘热研7-33-97’有丝分裂不同时期染色体上荧光原位杂交（FISH）检测A：间期;B：前期;C：中期;D：阴性对照;E：中期细胞核型图;红色：HbTT16信号位点;绿色：HbAGL30信号位点。 Fig. 3 Fluorescence in situ hybridization (FISH) of HbTT16 and HbAGL30 on chromosomes at different stages of mitosis in ‘7-33-97’ A: Interphase; B: Prophase; C: Metaphase; D: Negative control; E: Cell karyotype; Red: HbTT16; Green: HbAGL30. |
2.3 HbAP1和HbSVP1基因的FISH检测与物理定位分析
制作探针时,HbAP1目的序列用生物素标记,HbSVP1目的序列用地高辛标记,进行双探针荧光原位杂交实验,检测其在染色体上的实际位置。杂交检测过程中2个基因的信号位点在细胞分裂间期、前期和中期都能同时检测到,并且红色和绿色荧光位点明显分布在不同的染色体上（图4A、图4B、图4C）;阴性对照试验中,不加入探针进行荧光原位杂交,用荧光显微镜检测时检测不到任何荧光信号（图4D）。以高和琼等[26]分析的‘热研7-33-97’品种的核型所得的核型参数为依据,进行中期染色体核型分析,得到核型图（图4E）和核型模式图（图5）。结果表明：HbAP1定位在13号染色体短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离平均值为18.01;HbSVP1位于8号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离平均值6.70。
图4 HbAP1与HbSVP1在‘热研7-33-97’有丝分裂不同时期染色体上荧光原位杂交（FISH）检测A：间期;B：前期;C：中期;D：阴性对照;E：中期细胞核型图;红色：HbAP1信号位点;绿色：HbSVP1信号位点。 Fig. 4 Fluorescence in situ hybridization (FISH) of HbAP1 and HbSVP1 on chromosomes at different stages of mitosis in ‘7-33-97’ A: Interphase; B: Prophase; C: Metaphase; D: Negative control; E: Cell karyotype; Red: HbAP1; Green: HbSVP1. |
3 讨论
3.1 不同功能基因在橡胶树中的连锁关系
通过把巴西橡胶树MADS-box基因家族中的6个成员（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbSVP1和HbAP1）序列用DNAMAN分别两两进行序列比对,它们的相似度均在24.48%~ 66.40%之间,这说明它们之间的同源性不高,因此可利用原位杂交技术对这6个MADS-box基因家族成员进行物理定位分析,确定其在染色体上的具体位置。
本研究结果表明,已定位的MADS-box基因家族中的6个成员均位于不同的染色体上,遗传上可能互为独立基因的关系（图5）。结合前人已完成的其他功能基因定位的结果,可以得出：HbAGL15与HbWRKY7[27]、GGPS[28]、HbJAZ1、HbJAZ2[29]、HbCOI1[30]同时位于第4号染色体上;HbAGL8与HblMYC4[31]、HbRZF3[32]、HbNIN1[33]、HbMyb1[34]、HbNAC1[35]同时位于第5号染色体上;HbAGL30与HbWRKY75[27]、HEV1.2[36]、HbPT3[28]、HbRZF4[32]、HbSUT4[24]同时位于第7号染色体上;HbTT16与HbJAZ7[29]、HRT2[28]均位于第1号染色体上;HbAP1与HbWRKY2[27]、HblMYC3[31]、HbJAZ3[29]、SRPP[37]、HEV1.1[36]同时位于第8号染色体上。这些位于同一条染色体上的基因在遗传上可能互为连锁基因。
3.2 在橡胶树基因组组装中的辅助作用
随着全基因组测序工作的不断推进,中国热带农业科学院橡胶研究所于2016年5月完成了巴西橡胶树‘热研7-33-97’品种的测序工作,并发布了其基因组草图[38]。但目前只是将contig（重叠群）拼接为大片段的scaffold,而众多scaffold尚未确定在哪条染色体上,故染色体归类并不清楚。本研究将MADS-box基因家族中的6个成员HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1基因的序列在NCBI中与巴西橡胶树‘热研7-33-97’品种的全基因组序列进行比对,这6个成员分别位于全基因组中的scaffold0520、scaffold0451、scaffold2068、scaffold0063、scaffold1741和scaffold0673片段上。根据本研究对MADS-box基因家族中的6个成员定位的结果,可初步判定scaffold0451、scaffold0520、scaffold2068和scaffold0673分别位于第4、5、7和8号染色体长臂上;scaffold0063和scaffold1741分别位于第1和13号染色体短臂上。因此,本研究结果可为橡胶树基因组scaffold序列的染色体归属提供分子细胞遗传学依据。
3.3 对比分子标记基因定位的优势
用现有分子标记也能进行基因定位,关键环节包括：（1）根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合,建立作图群体;（2）群体中不同植株的标记基因型的分析;（3）标记间连锁群的确定。其中构建分离群体是作图成功的关键[39]。选择合适的分子标记对群体中所有个体进行基因型分析,通过亲代与子代表现型的分离比例,可以判定基因与标记基因的连锁关系,从而确定基因与连锁群的连锁关系,其他功能基因也需要使用同样方法才能确定与连锁群的连锁关系,才能得知不同基因间的连锁关系,需要耗费大量的时间、人力和物力。但通过物理定位仅需将染色体标本通过FISH的方式,确定基因在染色体上的真实位置,通过其位置关系来初步推测它们的遗传关系,初步判断它们是否存在连锁,以及它们与其他已定位基因的连锁关系,更快更容易就能知道这些基因的遗传关系。
本研究所揭示的MADS-box基因家族中的6个基因分别在细胞核染色体上的物理位置,以及它们与其他已定位基因之间的位置关系,有助于进一步了解这些基因间可能的遗传关系,弥补了MADS-box基因家族分子细胞遗传学信息的空白,可为该基因家族在橡胶树分子调控机理的研究提供细胞核位置信息,从而为橡胶树分子辅助育种提供有力的科学依据。