铁兰液体振荡培养再生与快速繁殖

李志英; 符运柳; 徐立

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.014

热带作物学报 >

2019 , Vol. 40 >Issue 1: 92 - 97

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.014

生物技术与组织培养

铁兰液体振荡培养再生与快速繁殖

李志英 ¹^,²^,³ ,
符运柳 ¹^,²^,³ ,
徐立 ^,¹^,²^,³^,^*

展开

1. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南儋州 571737
2. 农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室,海南儋州 571737
3. 海南省热带作物种质资源遗传改良与创新重点实验室,海南儋州 571737

^* 徐立（XU Li）, E-mail： xllzy@263.net。

李志英（1971—）, 女, 研究员, 研究方向：热带作物种质资源离体保存与创新利用。

收稿日期: 2018-06-22

要求修回日期: 2018-11-03

网络出版日期: 2019-01-15

基金资助

农业部物种资源保护项目(B650)

农业部热带作物物种资源保护项目(17Rzzy-101)

海南省自然科学基金项目(317267)

版权

收起

Rapid Propagation of Tillandsia cyanea ‘Bert’ Through Liquid Shake Culture

LI Zhiying ¹^,²^,³ ,
FU Yunliu ¹^,²^,³ ,
XU Li ^,¹^,²^,³^,^*

Expand

1. Institute of Tropical Crop Genetic Resources, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hannan 571737, China
2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Danzhou, Hainan 571737, China
3. Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation, Danzhou, Hainan 571737, China

Received date: 2018-06-22

Request revised date: 2018-11-03

Online published: 2019-01-15

Copyright

Copyright reserved © 1981. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.

Fold

摘要

以铁兰叶片为外植体,诱导获得脆性愈伤组织,液体振荡进行胚性愈伤组织培养及快速增殖,固体培养诱导胚状体萌发、不定芽生根,最后移栽成活,实现了铁兰的快速繁殖。在优化的培养条件下,铁兰无菌苗叶片愈伤组织诱导率90%以上,振荡后的愈伤组织100%成为胚状体,体积增殖系数可达5.0;90%以上的胚状体可分化为不定芽,95%以上的不定芽可诱导生根,移栽成活率95%以上。研究结果表明成功进行了铁兰的液体振荡培养及快速繁殖。

关键词： 铁兰; 胚性愈伤组织; 液体振荡培养; 快速繁殖

本文引用格式

李志英 , 符运柳 , 徐立 . 铁兰液体振荡培养再生与快速繁殖[J]. 热带作物学报, 2019 , 40(1) : 92 -97 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.014

Abstract

Using the leaf of Tillandsia cyanea as the explants, the fragile callus was induced. The rapid multiplication of embryonic callus was realized through liquid shake culture. In solid medium, the germination of the embryos and rooting of adventitious shoots were induced respectively. Rooting plantlets were transplanted and survived with high rates. In the optimized culture condition, the induction rate of callus was more than 90%. All the embryonic callus turned into embryos after liquid culture and the induction rate of the explants volume reached 5.0. More than 90% embryos developed into adventitious buds and 95% of the buds rooted after culture in solid medium. The transplanting survival rate was also more than 95%. These results indicated that the liquid oscillation and rapid propagation of T. cyanea was successful.

Key words： Tillandsia cyanea ‘Bert’; embryonic callus; liquid shake culture; rapid propagation

铁兰（Tillandsia cyanea‘Bert’）又称扇凤梨,属于凤梨科（Bromeliaceae）铁兰属,是多年生单子叶植物,凤梨科植物数据库中记载铁兰属有704个原生种,经过培育用于观赏的栽培种有60多个。铁兰茎短,植株比较矮小,扇形总苞片可观赏数月,为迷你型观赏性植物,具有很强的净化空气的能力,适于盆栽装饰室内,摆放于阳台、窗台、书桌等,也可悬挂在客厅、茶室,还可做插花陪衬材料。

铁兰通常用分株法繁殖,即在开花后萌发的吸芽发育到一定大小时,从母株分离栽种,获得新的植株^[1]。这种方法繁育种苗周期长,繁殖系数低,不宜作为铁兰种苗批量繁育的方法。利用组织培养技术繁育铁兰种苗是目前较为常用的方法,可通过不定芽增殖途径获得批量种苗^[2],也可通过体细胞胚的诱导获得再生植株^[3]。但已经报道的组织培养技术,均采用固体培养基,周期相对较长,从取材到批量出苗需要2~3 a时间,繁育过程中需要投入相对较多的人力和物力进行多次批量继代。

液体振荡培养技术周期短,速度快,多用于兰科植物的快速繁育^[4,5,6],亦有其他植物的少量报道^[7],但鲜见于凤梨科植物的组织培养。本研究以凤梨科植物铁兰为材料,在前期固体培养的基础上,改良了愈伤组织的诱导技术,探索了其液体振荡培养技术,以期为凤梨科植物种苗的快速繁育及品种培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以本实验室离体保存的铁兰无菌试管苗为实验材料^[2]。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织的诱导以铁兰无菌苗的叶片为外植体,切掉叶尖及基部叶鞘后,再切成0.5 cm长的段,接种于添加不同浓度6-BA及NAA的MS固体培养基上,每皿10块,每个处理10皿。

1.2.2 液体振荡将叶片诱导形成的易碎的愈伤组织,取0.5 cm见方的团块,轻轻压碎,接种到液体培养基Ⅰ,即添加0.1~0.5 mg/L 2,4-D的MS液体培养基,50 mL的三角瓶,首次加培养基10 mL,逐代增加,每7 d继代1次。连续3次后,接种到液体培养基Ⅱ,即添加0.1~0.3 mg/L 2,4-D和0.01~0.05 mg/L KT的MS液体培养基,用150 mL三角瓶,50 mL培养基,增殖后改用250 mL三角瓶,100 mL培养基,每14 d继代1次,每个处理3瓶。

1.2.3 胚状体萌发将经过继代培养得到的胚状体,接种到添加1.0 mg/L 6-BA及0.01 mg/L NAA的MS固体培养基上培养90 d,诱导胚状体萌发不定芽。每瓶接种5个胚团,每个处理10瓶。或每瓶接种0.5 mL 胚悬浮液,每个处理3瓶,解剖镜下观察萌发情况。

1.2.4 不定芽生根诱导待不定芽伸长到2~3 cm时,将不定芽丛进行单株分离,接种到不同的生根培养基,1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L,培养40 d。每瓶接种5个芽,每个处理10瓶。

1.2.5 移栽将生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗,一周后将苗移出培养瓶外,洗净小苗根部的培养基,进行移栽。取草炭土、椰糠和河沙,按体积比计为草炭土∶椰糠∶河沙=4∶3∶1的比例配成基质,提前浇透水,并覆盖薄膜保湿。

将已经湿透的基质进行浅翻,然后耙平,并用竹棒打孔,孔深1~2 cm,将小苗根部轻轻放到孔中,并用周围的基质填充,稍压实,用喷雾的方法淋定根水。移栽后,覆盖薄膜保湿,空气湿度保持95%~100%,基质湿度保持80%~90%,7~10 d后逐渐降低到70%;遮阴度60%~70%,7~10 d后逐渐减少到30%。温度25~32 ℃。

1.2.6 培养条件固体培养基添加蔗糖浓度为30 g/L,卡拉胶浓度6 g/L;液体培养基添加蔗糖30 g/L,均于灭菌前调pH为5.80。固体培养光照强度15~20 µmol/(m²·s),温度(26±1) ℃,光照时间8 h/d。液体培养为黑暗条件,温度(25±0.5) ℃,转数90 r/min。

1.2.7 悬浮物体积的测量将悬浮物摇匀后,利用一次性15 mL无菌移液管,剪掉细头,吸取5 mL,静置5 min,观察培养物的体积,并计算每瓶培养物的体积。连续测量4代,根据每瓶对应的体积及体积差,计算平均增殖系数。每个处理2瓶。

1.3 数据处理

采用邓肯氏新复极差法进行实验数据的分析与比较。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导及增殖

铁兰无菌苗叶片切段后,接种到愈伤组织诱导培养基培养40~50 d,叶片基部分化出易碎的愈伤组织（图1A）,愈伤组织诱导率达90%以上（表1）;将愈伤组织与叶片分离后,接种到新鲜的培养基上继续培养,可进行增殖,从而获得较多的易碎的胚性愈伤组织（图1 B）。

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图1 铁兰无菌苗叶片诱导愈伤组织悬浮培养再生过程

A：无菌苗叶片基部分化胚性愈伤组织;B：分离的愈伤组织增殖;C：胚性愈伤组织悬浮初期;D：胚性愈伤组织悬浮培养增殖形成大的胚团块及少量分散的胚（中间部分）;E：单个胚的形态;F：畸形胚;G：单个胚萌发形成不定芽;H：胚团块诱导初期形态;I：胚团块萌发不定芽丛;J：切分的小芽丛壮苗培养;K：不定芽诱导生根;L：生根不定芽移栽成活。

Fig. 1 Regeneration of T. cyanea through callus induction from leaf and suspension of callus

A: Embryonic callus induced from the base of in vitro leaf; B: Propagation of embryonic callus; C: Early stage of the suspension cultures; D: Embryo mass and embryos formed during the embryonic callus suspension culture; E: Form of the embryos; F: Malformed embryos; G: Adventitious bud developed from single embryo; H: Form of embryo mass after germination induction; I: Tufted adventitious buds developed from embryo mass; J: Separated bud; K: Rooted buds; L: Transplanted plantlets.

表1 铁兰无菌苗叶片愈伤组织诱导结果

Tab. 1 Callus induction of T. cyanea from in vitro leaf

6-BA/ (mg·L^-1)	NAA/ (mg·L^-1)	接种块数 Number of explants	出愈伤组织的块数 Number of callus	愈伤组织诱导率 Induction ratio/%
2.0	0.02	50	48	96
2.5	0.02	50	49	98
3.0	0.02	50	46	92

2.2 胚性愈伤组织液体振荡

将疏松易碎的胚性愈伤组织块轻轻压碎,接种到继代培养基Ⅰ中进行黑暗振荡培养3代后,愈伤组织颜色变浅,分散成黄白色的颗粒（图1C）。将在培养基Ⅰ中获得的培养物用培养基Ⅱ继续培养,培养物快速增殖,每个周期的增殖系数最高为5.0（以体积计算）（表2）。多数培养物发育为较大的胚团块（图1D）,少量细小,为单个椭圆形胚（图1E）,成胚率为100%。

表2 铁兰胚性愈伤组织悬浮培养成胚及增殖效果

Tab. 2 Propagation and embryos formation of the embryonic callus from T. cyanea

2,4-D/ (mg·L^-1)	KT/ (mg·L^-1)	平均每代增殖体积Volume increment/mL	平均每个周期增殖系数Multiplication
0.1	0	—	—
0.3	0	—	—
0.5	0	—	—
0.1	0.01	2.9	3.0^b
0.1	0.03	3.1	3.3^b
0.1	0.05	3.1	3.3^b
0.3	0.01	3.2	3.5^bc
0.3	0.03	3.2	3.8^bc
0.3	0.05	3.7	5.0^c
0.5	0.01	1.2	1.4^a
0.5	0.03	1.3	1.4^a
0.5	0.05	1.4	1.6^a

	Note: Different lowercase letters in the same column mean significant differences (p<0.05).
	注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

2,4-D浓度对胚性愈伤组织发育具有较为明显的影响。2,4-D浓度为0.1~0.3 mg/L时,形成的胚为椭圆形,白色至浅黄色（图1C）;当2,4-D浓度提高到0.5 mg/L时,胚颜色为黄色,形状不规则,畸形胚增多（图1F）。KT的浓度对培养物的增殖具有影响,随着KT浓度的提高,增殖系数增加。但在2,4-D浓度较低时,存在少量非胚性愈伤组织。当KT浓度继续提高,多次继代会导致液体振荡培养过程中部分胚状体发育为不定芽,导致生长不整齐（数据未列）。

因此,根据本研究的结果,以2,4-D 0.3 mg/L和KT 0.05 mg/L的组合最好,胚状体状态良好,增殖系数高。

2.3 胚状体的萌发

将液体培养所得的胚性愈伤组织转接到胚状体萌发培养基,培养60 d,单个胚萌发形成不带根的芽（图1G）,萌发率90%以上;大的团块变绿（图1H）后萌发出丛生芽,单个团块萌芽数都在30个以上（图1I）,MS+6-BA 1.0/2.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L团块萌发率均可达100%（表3）,但6-BA增加,会使部分叶片边缘及表面分化愈伤组织,不利于后期芽的发育。因此,根据本研究结果,胚状体的萌发最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.01 mg/L。

与已有的报道相似,铁兰胚状体萌发形成无根不定芽^[3],需要进一步诱导生根。

表3 铁兰胚状体萌发效果分析

Tab. 3 Embryos ermination of T. cyanea

6-BA/ (mg·L^-1)	NAA/ (mg·L^-1)	胚块萌发率 Germination rate of embryo piece/%	胚萌发率 Germination rate of embryos/%
0.1	0.05	30^a	11^a
0.5	0.05	50^b	23^ab
1.0	0.05	82^c	32^b
2.0	0.05	80^c	55^c
0.1	0.02	42^a	21^a
0.5	0.02	64^b	32^b
1.0	0.02	96^c	57^c
2.0	0.02	96^c	56^c
0.1	0.01	40^a	39^b
0.5	0.01	62^b	43^b
1.0	0.01	100^c	90^c
2.0	0.01	100^c	81^c

	Note: Different lowercase letters in the same column mean significant differences (p<0.05).
	注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

2.4 壮苗及生根

胚团萌发形成的丛芽数量太多,需要切分为小丛（图1J）,在胚状体萌发培养基继续培养60 d左右,不定芽发育为4~5 cm的壮芽。分离单芽接种到生根培养基,培养30 d左右,可诱导形成1 cm左右的棕色根,每个芽生根2~5条（图1K）,生根率95%以上（表4）。综合生根率及生根质量,1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基最适于铁兰不定芽生根。

表4 铁兰不定芽生根诱导效果

Tab. 4 Rooting of the adventitious shoots from T. cyanea

基本培养基 Basal medium	IBA/ (mg·L^-1)	NAA/ (mg·L^-1)	接种不定芽数 Number of explants	生根率 Rooting rate/%	状态 Status of seedlings
MS	0.5	0	50	52^c	芽小,根粗壮,根毛少
MS	0.5	0.5	50	39^ab	芽略高,根粗壮,根毛正常
MS	0.5	1.0	50	42^b	芽较高,根正常
MS	0.5	1.5	50	43^b	芽高,根较细弱
1/2 MS	0.5	0	50	30^a	芽小,根粗壮,根毛少
1/2 MS	0.5	0.5	50	41^ab	芽略高,根粗壮,根毛正常
1/2 MS	0.5	1.0	50	47^c	芽较高,根正常
1/2 MS	0.5	1.5	50	48^c	芽高,根细弱

	Note: Different lowercase letters in the same column mean significant differences (p<0.05).
	注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

2.5 移栽

无菌生根苗在大棚中炼苗后洗净培养基,定植到事先准备的基质上,遮阴保湿管理,移栽成活率95%以上（图1L）。

3 讨论

凤梨科植物种类繁多,形态和生物学特性差别明显,而且多数凤梨科植物不能产生种子。为了解决凤梨科植物的繁育问题,菠萝最早被用于进行组织培养获得再生植株^[8,9],后进一步诱导菠萝的叶片分化胚性愈伤组织^[10,11]。与菠萝相比,铁兰的叶片革质化程度更大,诱导愈伤组织困难。符运柳等^[3]以铁兰无菌苗的短缩茎为外植体,通过添加2,4-D和6-BA诱导出了胚性愈伤组织,并获得了再生植株。本研究以铁兰无菌苗的叶片为外植体,通过添加6-BA和NAA,诱导叶片基部分化出胚性愈伤组织,为铁兰的组织培养提供了新的技术参考。

液体振荡培养技术因其快速高效而被应用于植物的组织培养,可节省大量人力物力。迄今,应用较为广泛的是悬浮培养兰科植物的种子^[6],原球茎^{[4-5, 13-15]}, 也有报道利用丛生芽进行悬浮培养^[16]。代容春等^[7]将固体培养基上诱导的愈伤组织在液体中培养12 d,再转入固体培养基,可较大程度地提高愈伤组织的分化率及芽数,为提高较难分化芽的植物的培养提供了借鉴。虽然凤梨科植物的组织培养已经研究多年,但尚未见液体悬浮培养的报道。

液体振荡培养所采用的外植体一般要细碎、分散性良好,增殖潜力大,鉴于此,只有少量种类的作物可以获得理想的外植体而应用液体振荡培养技术进行快速繁殖,例如,兰科植物多数易生成原球茎,可以采用液体培养技术^{[5, 13, 17]};有报道利用丛生芽液体悬浮培养,但是易受组织褐变的影响,继代次数有限,只有极少量种类适用^[18]。以上问题的存在及种苗快速繁育的需求,导致需要探索不同类型的外植体以进行其他植物的液体悬浮培养。胚性愈伤组织,分为易碎型胚性愈伤组织和致密型胚性愈伤组织,其中易碎型胚性愈伤组织结构松散,易分离,更适合进行液体悬浮培养。大量的胚性愈伤组织还可为突变育种、基因工程育种及资源的超低温保存提供理想材料^[19]。

本研究利用铁兰叶片诱导胚性愈伤组织,进行了两段式液体悬浮培养：第一阶段,将叶片诱导获得的愈伤组织在添加了2,4-D的培养基中短周期（7 d）诱导,形成胚;第二阶段,将胚在添加2,4-D和KT的培养基中长周期（14 d）诱导,进行胚的增殖,可以进行铁兰胚的快速繁育,增殖系数（以体积计）可达5.0以上。每个胚的团块进行萌发后,可形成30多个不定芽,增殖效率非常高。该结果表明铁兰的悬浮培养技术已经建立,为凤梨科其他植物的悬浮培养奠定了技术基础。

该研究尚存在一定的不足,即液体悬浮后,胚的萌发比较缓慢,约90 d;胚萌发不能直接形成完整植株,需要进一步诱导生根;不定芽生长缓慢,60 d高度才能达到4~5 cm。后续研究应努力缩短胚的萌发时间,提高芽的生长速度,直接诱导胚形成完整植株。

致谢本研究材料由国家种质资源热带作物中期保存库提供,特此致谢！

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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Abstract

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导及增殖

图1 铁兰无菌苗叶片诱导愈伤组织悬浮培养再生过程

表1 铁兰无菌苗叶片愈伤组织诱导结果

2.2 胚性愈伤组织液体振荡

表2 铁兰胚性愈伤组织悬浮培养成胚及增殖效果

2.3 胚状体的萌发

表3 铁兰胚状体萌发效果分析

2.4 壮苗及生根

表4 铁兰不定芽生根诱导效果

2.5 移栽

3 讨论

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2.2 胚性愈伤组织液体振荡

表2 铁兰胚性愈伤组织悬浮培养成胚及增殖效果

2.3 胚状体的萌发

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