山地五月茶（Antidesma montanum）属大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠亚科（Phyllanthoideae Ascherson）五月茶属（Antidesma）植物。该属植物广泛分布于东半球热带地区,常被作为绿化观赏树种。五月茶属植物全球约170种,我国有16种,主要分布于广东、广西、福建、贵州、云南和海南等地[1]。五月茶的果实可用于制造果酱、果汁和红酒等,在泰国、菲律宾、印度尼西亚等国是重要的经济作物,其嫩叶还可代茶冲泡饮用或作为蔬菜食用[2]。我国传统医药书籍记载五月茶的根、果、叶均可入药,《常用中草药彩色图谱》中记载五月茶具有"收敛,止泻,止渴生津,行气活血"的药用活性,能"治津液少,消化不良,跌打损伤"[3]。国内外研究结果显示,五月茶的茎叶中含有酚酸、环肽和三萜类成分,在抗氧化、抗病毒、抗抑郁等方面具有较好的药理活性[4,5,6,7,8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 山地五月茶（A. montanum）的果和鲜叶均采自海南省万宁市兴隆镇中国医学科学院药用植物研究所海南分所南药园。采集的果和叶于40℃烘干后粉碎,过40目筛,加入5倍体积的80%乙醇浸泡24 h,超声辅助提取3次,每次30 min。提取液经过减压旋转蒸发浓缩近干,以超纯水溶解后,依次用石油醚（30~60℃沸程）、乙酸乙酯、正丁醇萃取,各萃取相经减压旋转蒸发浓缩去除溶剂,冷冻干燥后-20℃冰箱保存。
乳腺癌细胞MDA-MB-231,购自中国科学院昆明细胞库。用含有10%新生胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM 高糖型培养基培养,培养条件为37℃、5%二氧化碳。取对数生长期细胞进行后续实验。
DMEM培养基、胎牛血清、CCK-8试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;结晶紫、羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、穗花杉双黄酮标准品（HPLC≥98%）,上海源叶生物科技有限公司;胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素溶液、PBS缓冲液,合肥Biosharp生物科技公司;RNase A溶液,北京索莱宝科技有限公司;细胞核染料PI染色液,江苏凯基生物技术股份有限公司。
1.1.2 仪器与设备 Thermo 3111二氧化碳培养箱、MUTiskan GO酶标仪,美国Thermo Fisher公司;Axiovert 40 CFL荧光倒置显微镜,德国Zeiss公司;BD FACSCalibur流式细胞仪,美国BD Bioscience公司;UltiMate™ 3000高分辨液质联用仪UPLC-MS/MS,美国Thermo Fisher公司;SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,美国Agilent Technologies公司。
1.2 方法
1.2.1 抑制增殖活性检测（CCK-8法） 在96孔板中接种对数生长期的MDA-MB-231细胞,每孔接种2000个,待细胞贴壁后加入不同浓度提取物的DMEM培养基（含0.25%HEPES）,以0.1% DMSO的DMEM培养基为空白对照。在处理72 h后,吸除旧培养基,加入10 μL的CCK-8及90 μL培养基,放入CO2培养箱静置1 h后,用酶标仪读取405 nm吸光度。按照下列公式计算细胞活力：
细胞活力=（A空白组-A处理组）/A空白组
用Graphpad Prism 8软件以提取物浓度的对数值log (X)为横坐标,提取物的吸光度与对照吸光度的百分比值为纵坐标,做非线性回归分析,获得抑制细胞增殖的IC50。
1.2.2 细胞迁移活性检测（划痕实验） 在24孔板中接种对数生长期的MDA-MB-231细胞,每孔2×105个细胞,二氧化碳培养箱培养24 h,待细胞贴壁后用枪头划痕,用PBS缓冲液洗去漂浮细胞,加入不同浓度提取物,24 h后用结晶紫染色细胞,在显微镜下拍照,用ImageJ软件统计处理前后划痕面积变化,计算抑制迁移率。
1.2.3 细胞侵袭实验 山地五月茶叶乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相分别配置成25、50、100 μg/mL的DMEM培养基,用含有不同浓度提取物的培养基培养MDA-MB-231细胞24 h,经胰酶消化细胞脱壁,用不含牛血清的培养基制备成4×104个/mL 的细胞悬液加入 Transwell小杯（置于24孔板中）,Transwell的下层加入含10%牛血清的培养基,37℃培养箱培养24 h,用棉签擦去孔内细胞,75%乙醇固定0.5 h后用结晶紫染色1 h,洗去多余染液,在显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数细胞个数,取5个视野的平均数表示肿瘤细胞的体外迁移和侵袭数。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期变化 用6孔板,每孔接种5×105个对数生长期的MDA-MB- 231细胞,以含50 μg/mL的山地五月茶叶乙酸乙酯萃取相的培养基处理24 h后,以不含EDTA的胰蛋白酶使细胞脱壁,经预冷的PBS洗2遍,1500 r/min离心5 min,弃上清并用预冷的PBS洗2遍,用预冷的70%乙醇固定,-20℃冰箱过夜。检测前用预冷的PBS洗2遍,离心、弃上清,加入2 μL浓度为1 mg/mL的核糖核酸酶（RNaseA）,37℃水浴30 min,加入400 μL PI染色液,暗处反应30 min后,用流式细胞仪检测提取物对细胞周期的影响。
1.2.5 UPLC-MS/MS分析 将活性组分进行UPLC-MS/MS分析,以甲醇（A）和0.5%甲酸水
溶液（B）为流动相,梯度洗脱（0~10 min,40%~ 60%A;15~25 min,80%A;25~30 min,40% A）。流速0.4 mL/min,柱温28℃,进样体积10 μL。质谱检测条件：电喷雾离子源（ESI）,正负离子模式,雾化N2体积流量为800 L/h,脱溶剂气温度为400℃,锥孔气流量为50 L/h,离子源温度100℃,毛细管电压3.0 kV,锥孔电压40 V,离子喷雾电压（ESI-）2200 V和（ESI+）3000 V;MSE扫描模式检测,扫描范围m/z 100~1500 。
1.3 数据分析
所有实验均设3次以上重复,采用Graphpad Prism 8.0.1软件进行数据处理,并进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 提取物对乳腺癌细胞增殖的抑制
分别将山地五月茶的果和叶乙醇提取物用DMSO溶解,DMEM培养基稀释至一定浓度,测试其对MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制活性,结果见图1。乙醇提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖的活性,随浓度增加而增强。果和叶的乙醇提取物对MDA-MB-231细胞72 h的IC50分别为483 、306 μg/mL,叶提取物的抑制增殖活性高于果的提取物。
图1 山地五月茶果和叶提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖活性**表示差异极显著（P<0.01）。A：果乙醇提取物;B：叶乙醇提取物;C：叶提取物不同萃取相（200 μg•mL-1）;D：叶乙酸乙酯萃取相。 Fig. 1 Inhibitory activity of fruits and leaves extract of A. montanum in proliferation of MDA-MB-231 cell ** means extremely significant difference (P<0.01). A: Ethanol extracts of fruits; B: Ethanol extracts of leaves; C: Different extracts phase of leaves (200 μg•mL-1); D: Ethyl acetate phase of leaves. |
2.2 提取物对细胞迁移的影响
考察山地五月茶叶乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞迁移活性的影响,结果表明100 μg/mL的乙酸乙酯萃取相处理MDA- MB-231细胞24 h后,与对照相比提取物对细胞迁移的平均抑制率达86%（图2）。本研究还考察了更低浓度提取物处理对细胞迁移活性的影响,结果显示随着提取物浓度的降低,其对细胞迁移的抑制率也逐渐减小。
2.3 提取物对细胞侵袭的影响
不同浓度山地五月茶叶提取物的乙酸乙酯萃取相处理乳腺癌MDA-MB-231细胞,图3结果表明,随着浓度的提高,乙酸乙酯萃取相提取物对MDA- MB-231细胞迁移抑制活性也提高。25、50、100 μg/mL提取物处理后的穿过膜孔的细胞数量分别为对照的69.9%、37.6%和34.3%,表明五月茶叶提取物的乙酸乙酯萃取相中含有抑制MDA- MB-231细胞侵袭的活性成分。
图3 Transwell实验结果**表示差异极显著（P<0.01）。A：对照;B：叶乙酸乙酯萃取相（25 μg•mL-1）;C：叶乙酸乙酯萃取相（50 μg•mL-1）;D：叶乙酸乙酯萃取相（100 μg•mL-1）。 Fig. 3 Results of transwell test **means extremely significant difference (P<0.01). A: Control; B: Ethyl acetate phase of leaves (25 μg•mL-1); C: Ethyl acetate phase of leaves (50 μg•mL-1); D: Ethyl acetate phase of leaves (100 μg•mL-1). |
2.4 提取物对细胞周期的影响
通过流式细胞仪检测山地五月茶叶提取物乙酸乙酯萃取相对MDA-MB-231细胞周期的影响,结果见图4。由结果可知,以50 μg/mL的乙酸乙酯萃取相处理细胞24 h,能增加G0/G1期和S期细胞的数量,减少G2期的细胞数量。与空白对照相比,G0/G1期细胞的数量平均由54.5%增加到55.6%,S期细胞数由25.6%增加到32.0%,G2期细胞数量由14.5%减少到6.5%。说明山地五月茶乙酸乙酯萃取相活性成分能够阻滞MDA-MB- 231细胞周期在S期,从而抑制其增殖。
2.5 提取物活性成分的UPLC-MS/MS分析
2.6 活性成分抑制细胞增殖活性
3 讨论
本研究对山地五月茶（A. montanum）果实及叶提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用进行了研究,山地五月茶叶提取物主要活性物质在乙酸乙酯萃取相,其对细胞的抑制增殖作用具有剂量依赖性,可将乳腺癌细胞S期延长,导致细胞不能增殖。划痕实验和Transwell实验结果证明,山地五月茶叶的提取物能有效抑制MDA- MB-231细胞的迁移和侵袭。
国外早期研究显示,五月茶（A. bunus）叶和果实的甲醇粗提物对卤虫藻（Artemia salina）有细胞毒活性[12]。五月茶全株含有多种维生素如硫胺素（thiamine）、核黄素（riboflavine）、烟酸（nicotinic acid）[13],果实中含有较多的没食子酸（gallic acid）、(-)-表儿茶素[(-)-epicatechin]、(+)-焦儿茶酸[(+)-catechin]、矢车菊素（cyanidin-3-O- glucoside）[14]。研究表明,山地五月茶（A. montanum）地上植株含有黄酮类、甾萜类、生物碱类、酚类、蒽醌类成分,乙酸乙酯相提取物有抗炎活性[15,16]。
本研究的结果也表明,山地五月茶（A. montanum）叶提取物抑制MDA-MB-231细胞增殖的活性成分主要在乙酸乙酯萃取相,乙酸乙酯萃取相中主要活性成分是一种黄酮类物质——穗花杉双黄酮（amentoflavone）,该萃取相其他组分的化学结构及细胞活性有待进一步研究。
通常癌症的形成需要几十年的时间,在饮食中注意长期持续摄取具有抑制癌细胞生长的食物是预防癌症的一种可取的生活方式。山地五月茶能够抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭活性,有望开发为具有预防和治疗乳腺癌功能的保健茶产品。