干旱胁迫是影响植物生长和发育的一个重要因子[1]。当植物受到干旱胁迫后,其形态和结构也会出现明显变化,进一步产生了生长速度减慢、叶片失绿畸形、萎蔫乃至于死亡等问题[2]。为了适应干旱胁迫环境,植物自身也会作出一些反应,诸如关闭气孔、增大根量以及减少蒸腾等来维持其水分的吸收或减少水分的散失,使植株依然能维持生存状态存活下去[3]。
由于火龙果抗旱能力强、果实品质优、经济效率高,已在中国的很多喀斯特高温地区广泛种植[4,5]。目前,贵州低海拔富热量地区火龙果种植面积已超过6000 hm2,位居全国第三,已发展成为贵州喀斯特山区农民脱贫致富的重要支柱产业。然而国内外有关火龙果的报道主要集中在新品种选育[6]、苗木繁育[7]、营养成分[8]、色素提取[9]、栽培技术[10]等方面,关于火龙果在干旱逆境下的适应性研究较少,而贵州喀斯特山区土地贫瘠,夏季高温干旱时有发生,很多经济作物在此区域都不能存活,火龙果的种植对于此区域的生态建设和环境保护有着重要意义。本研究以贵州地区广泛种植的火龙果品种‘紫红龙’为试验对象,研究其对干旱胁迫的响应,并对其抗旱适应能力进行评价,可以提高火龙果栽培管理效益,同时为火龙果逆境生理研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
从贵州省果树科学研究所镇宁热带果树基地,选择生长一致、无病虫害的一年生火龙果（Hylocereus undatus）品种‘紫红龙’盆栽苗,将这些盆栽苗分为2组,每组各100株,给予2个水分处理：对照（CK）,隔3 d浇500 mL水,持续保证土壤含水量约80%,枝条含水量89.5%;干旱处理（T）,停止浇水。干旱处理后第4周开始采样,每隔2周采1次,共4次。采集样品均为成熟中部茎干,每次采样为5株,每次采样同时部分样品用于测定样品含水量,以换算干重,其余茎干储存于-80 ℃冰箱中。
1.2 方法
1.2.1 生长量测量 茎生长量：待对照和处理的母茎上同时长出新梢后,从水分处理时间开始计算,每隔2周用直尺和精度为0.02 mm的游标卡尺测量新梢茎长度和宽度,直至新长茎段成熟,停止生长。每个处理10个重复。
根系生长量：干旱处理16周时,统计须根数量,并用直尺测量对照和处理的根系长度,每个处理10个重复。
1.2.2 气孔观察 选夏季平均气温为20 ℃的晴朗日,从早上8：00到次日早上8：00,每隔4 h,用指甲油涂抹法获取火龙果成熟茎上气孔印模,光学显微镜下观察气孔形态。具体操作步骤为：首先把要印模的火龙果茎提前数日用擦镜纸清洗干净,然后用透明指甲油薄薄地涂抹一层在成熟茎上,大约15 min后,待指甲油干透后,用尖头镊子小心把印模撕下来,轻轻放在载玻片上,盖上盖玻片,在莱卡DFC550（Leica Microsystems,Switzerland）显微镜下观察气孔状态,并统计分析。单株小区,5个生物学重复。每个样品至少观测500个气孔,每份样品各选取10个单位面积,统计气孔数量,换算成每平方毫米气孔个数（气孔个数/mm2）。气孔的大小、开张度用莱卡Application Suite 4.2.0测量。
1.2.3 含水量测定 每隔2周取盆内的土壤和成熟茎段进行土壤含水量和茎段含水量的测定。土壤含水量：取适量对照和处理的土壤于已知重量的瓷盘中,称重后将土壤置于烘箱内,80 ℃烘至恒重,称重,湿土重减去干土重即为该土壤的绝对含水量。对照和处理各5个重复。
茎含水量：取长度一致的茎段,称重后放置于烘箱内,80 ℃烘至恒重,再次称重,计算含水量。对照和处理各5个重复。
1.2.4 茎表温度测量 待干旱处理8周后,每隔2周,早、中、晚分3次用红外线温度计（Testo 830-T2,德国）测量茎（母茎和子茎均分别测量）3个侧面的表面温度,每个处理测5盆,即每个处理测量30次。
1.2.5 光合色素含量的测定 叶绿素含量测定：称取0.2 g肉质茎,加入20 mL丙酮:无水乙醇（V∶V=1∶1）混合提取液,暗环境下室温20 ℃浸提12 h以上,利用分光光度计在470、665和649 nm下分别测定吸光值,叶绿素和类胡萝卜素含量用以下方程算出：
Chl a (mg/g)=(13.95 A665-6.88 A649)×V/M
Chl b (mg/g)=(24.96 A649-7.32 A665)×V/M
Total Chl (mg/g)=Chl a+Chl b
Car (mg/g)=(1000×A470-2.05×Chl a-114.8× Chl b)/248
其中,V：提取液体积,M：样品重量。实验设3个重复。
1.2.6 叶绿素荧光测定 采用脉冲调制荧光仪FMS-2（Hansatech,UK）,在上午10：00,暗适应20 min后测定饱和脉冲模式下叶绿素荧光参数（指PSII反应中心处于完全开放和完全关闭时的荧光产量Fo和Fm,PSII最大光化学效率Fv/Fm,光化学淬灭系数qP,非光化学淬灭系数NPQ,光照下PSII的实际光化学效率ΦPSII）,设淋水和干旱2个处理,3个重复。
1.3 数据处理
所有数据均根据成熟茎不同的含水量换算成干重的数据,并使用Origin 6.0和Microsoft Excel 2007软件分析、制图,采用DPS v7.05进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 干旱胁迫对盆内土壤含水量及肉质茎含水量的影响
2.2 干旱对火龙果茎生长量的影响
2.3 干旱对火龙果根生长量的影响
如表1所示,从根系长度和数量来说,都是干旱处理显著大于对照。说明干旱促进根系伸长生长和促进萌发新根,以便在干旱的环境中吸收尽可能多的水分。
表1 干旱对火龙果根生长量的影响Tab. 1 Effects of drought on growth of pitaya root |
| 项目Item | 对照Control | 干旱处理Drought treatment |
|---|---|---|
| 须根长度/cm | 26.66 | 41.66* |
| 须根数量 | 16.66 | 32.83* |
注：*表示对照和干旱处理间差异显著（P < 0.05,t检验）。 | |
Note: * indicated significant differences between control and drought treatment (P < 0.05, t test). |
2.4 干旱对火龙果气孔行为的影响
从图3、图4和表2、表3可见,干旱处理茎的气孔开放率和开放度都比对照的要低。在干旱处理中,气孔在4：00、8：00和12：00时都是完全关闭的,而对照的气孔开放率在4：00和8：00时仍分别为17.4%和3.0%。在20：00时,干旱处理的气孔开放率为41.6%,气孔开放度（开口横径）为5.05 µm;而对照的气孔开放率为76.2%、开放度为6.48 µm。由此可见,即便是晚上,干旱处理的气孔开放时间也比对照短,开放率和开放度均比对照低,气孔密度也显著地比对照的小。干旱处理下,气孔大小也比对照小,气孔长度比对照小约0.91 µm,气孔宽度比对照小约1.59 µm。总之,在淋水条件下气孔开放度更大,开放率更高,且白天也会偶有少量气孔开放,而干旱条件下,气孔大部分在夜晚开放,白天处于关闭状态,且气孔密度和气孔大小均降低。
图3 干旱对火龙果茎气孔在20：00开放状态的影响Fig. 3 Effects of drought on stomata opening status of pitaya stem at eight o 'clock in evening |
图4 干旱对火龙果茎气孔昼夜开放状态的影响Fig. 4 Effects of drought on diurnal stomata opening status of pitaya stem |
表2 干旱对火龙果茎气孔开放率和开放度的影响Tab. 2 Effects of drought on open percentage and open size of stmata aperture in pitaya stem |
| 时间 Time | 气孔开放率 Frequency of opened stomata/% | 气孔开放度 Stomata aperture/µm | ||
|---|---|---|---|---|
| 对照 Control | 干旱处理Drought treatment | 对照 Control | 干旱处理 Drought treatment | |
| 8：00 | 3.0±1.30d | 0d | 1.71±0.10de | 0f |
| 12：00 | 0d | 0d | 0f | 0f |
| 16：00 | 20.2±4.97c | 8.2±2.22cd | 5.14±0.39b | 3.14±0.21c |
| 20：00 | 76.2±6.98a | 41.6±5.06b | 6.48±0.23a | 5.05±0.14b |
| 0：00 | 35.2±5.83b | 15.6±4.95cd | 3.43±0.25c | 2.06±0.16d |
| 4：00 | 17.4±3.43cd | 0d | 1.35±0.06e | 0f |
注：不同小写字母表示对照、干旱处理及不同时间点间差异显著（P<0.05,LSD检验）。 | |
Note: Different lowercase letters indicated significant differences between control, drought treatment and different time points (P<0.05, LSD test). |
表3 干旱对火龙果茎表气孔密度和气孔大小的影响Tab. 3 Effect of drought on stoma density andstoma density of stem of pitaya |
| 处理 Treatment | 气孔密度 Stoma density/ (piece·mm-2) | 气孔大小Stoma size | |
|---|---|---|---|
| 长Length/µm | 宽Width/µm | ||
| 对照 | 26.08±5.27 | 20.17±1.04 | 14.53±1.21 |
| 干旱 | 22.46±3.64* | 19.26±1.65 | 12.94±0.97* |
注：* 表示对照和干旱处理间差异显著（P<0.05,t检验）。 | |
Note: * indicated significant differences between control and drought treatment (P<0.05, t test). |
2.5 不同水分条件下火龙果茎表温度统计
表4所示,干旱处理后12周（土壤含水量34%,茎含水量82%,水分重度胁迫后,见图1）上午9：00,大棚温度为25.2 ℃,对照和干旱处理的茎表温度均高于大棚温度,随着白天大棚内温度的升高,火龙果茎表温度也随之升高,到12：00,大棚内温度为32.3 ℃,对照老茎温度为33.67 ℃,嫩茎温度为34.17 ℃,而干旱处理的老茎温度为34.25 ℃,嫩茎温度为34.87 ℃。可见,白天2次测量结果显示火龙果茎表温度都比气温高,其中嫩茎的茎表温度比老茎的茎表温度更高,表明嫩茎蒸腾弱于老茎;而干旱处理的茎表温度均比对照的茎表温度更高,显示干旱处理导致蒸腾减弱。随着偏西日落,大棚内温度逐渐降低,此时火龙果茎表温度也随着下降,晚上21：00大棚气温为21.9 ℃,对照老茎的温度为22.13 ℃,干旱处理老茎的温度为21.27 ℃;而干旱处理的嫩茎茎表温度比气温下降的更低（20.94 ℃）,嫩茎的温度比老茎的温度低,干旱处理的茎表温度比对照低。由此可见,嫩茎比老茎对于气温的升高或者降低更加敏感,而干旱处理后,火龙果茎表对气温的变化也会变得更敏感,升温快,降温也快。
表4 干旱处理对火龙果茎表温度的影响Tab. 4 Effects of drought on surface temperature of pitaya stem |
| 时间 Time | 大棚温度Greenhouse temperature /℃ | 老茎表面温度 Temperature of old stem surface /℃ | 嫩茎表面温度 Temperature of young stem surface /℃ | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 对照Control | 干旱处理Drought treatment | 对照Control | 干旱处理Drought treatment | ||
| 8周 | |||||
| 9：00 | 26.5 | 30.25±1.06a | 28.85±0.70b | 30.05±0.96a | 29.15±0.70b |
| 12：00 | 30.5 | 33.70±1.12a | 32.43±0.72b | 32.09±0.96b | 33.40±0.73a |
| 21：00 | 23.2 | 22.75±0.61a | 22.32±0.18a | 22.44±0.43a | 21.77±0.23b |
| 10周 | |||||
| 9：00 | 20.4 | 21.70±0.60a | 20.46±0.14b | 21.48±0.43a | 20.47±0.18b |
| 12：00 | 25.4 | 24.89±0.29b | 25.37±0.31a | 25.30±0.28ab | 25.75±0.29a |
| 21：00 | 23.1 | 23.85±0.41a | 22.69±0.18b | 23.69±0.30a | 22.45±0.15b |
| 12周 | |||||
| 9：00 | 25.2 | 26.45±0.89b | 26.89±0.79a | 26.51±0.64b | 27.56±0.82a |
| 12：00 | 32.3 | 33.67±0.35b | 34.25±0.32a | 34.17±0.30a | 34.87±0.63a |
| 21：00 | 21.9 | 22.13±0.38a | 21.27±0.17b | 22.12±0.36a | 20.94±0.22c |
| 16周 | |||||
| 9：00 | 26.7 | 26.69±0.70ab | 26.17±0.40b | 27.39±0.42a | 25.86±1.95b |
| 12：00 | 29.8 | 30.53±0.76a | 30.68±0.73a | 30.47±0.48a | 30.89±0.71a |
| 21：00 | 20.4 | 21.12±0.61a | 19.63±0.15bc | 20.93±0.63a | 19.32±0.18c |
注：不同小写字母表示对照、干旱处理间差异显著（P < 0.05,LSD检验）。 | |
Note: Different lowercase letters indicated significant differences between control and drought treatment (P < 0.05, LSD test). |
2.6 干旱对火龙果茎光合色素的影响
随着时间的推移,对照和干旱处理火龙果茎中的叶绿素和类胡萝卜素含量都呈现增加的趋势,说明随着茎生长成熟,叶绿素和类胡萝卜素也在积累。从图5看出,干旱处理对火龙果茎中的叶绿素含量有一定影响,干旱处理4周时,干旱处理和对照中的Chl a、总叶绿素含量（Chl a + Chl b）差异不大,但干旱处理中的Chl b含量显著高于对照,Chl a/Chl b显著低于对照;随着干旱程度的加深（干旱处理12周、16周时）,干旱处理中的Chl a、Chl b、总叶绿素含量（Chl a + Chl b）及Chl a/Chl b都显著低于对照。
2.7 干旱对火龙果茎叶绿素荧光参数的影响
Fo和Fm指PSII反应中心处于完全开放和完全关闭时的荧光产量,研究表明,水分胁迫能引起Fo上升和Fv下降,它们的变化程度可以用来鉴别植物不同抵抗或忍耐干旱的能力[11]。
由图6A可见,在第4周时,干旱处理的Fo值显著高于对照,在第8周时对照和干旱处理的Fo值差异不显著;随着干旱处理时间延长,干旱处理和对照的Fo值先上升后下降（到12周时,达最大值）,且干旱处理的Fo值显著高于对照。
Fv/Fm反映PSII最大光化学效率。由图6 B可见,在干旱处理的前12周,干旱处理和对照的Fv/Fm值都很稳定,随着胁迫时间延长,干旱处理的Fv/Fm值呈下降趋势,至16周时显著低于对照,可见轻度胁迫对PSII光化学特性影响较小,而胁迫时间过长到重度胁迫时才对PSII光化学特性影响较大,也进一步说明火龙果茎抗旱能力较强。
光化学淬灭系数qP值的大小反映的是PSII原初电子受体QA的氧化还原状态和PSII开放中心的数目,其值越大,说明PSII具有更高的电子传递活性。由图6C可见,干旱处理的qP值持续低于对照,说明干旱胁迫使得QA重新氧化能力减弱,削弱了PSII受体的电子传递。
非光化学淬灭系数NPQ值是PSII反应中心对天线色素吸收过量光能后的热耗散能力及光合机构的损伤程度。PSII系统通过提高非辐射性热耗散,可以消耗PSII吸收的过剩光能,从而保护PSII反应中心免受因吸收过多光能而引起的光氧化伤害。当植物处于胁迫条件时,NPQ值增大,表明干旱胁迫使PSII非辐射能量的耗散增加。由图6 D可见,在前8周,干旱处理和对照的NPQ值差异不明显,而随着干旱胁迫时间延长,NPQ值增加,到12周和16周时,干旱处理的NPQ值均显著高于对照。
ΦPSII反映光照下PSII的实际光化学效率。由图6E可见,在前8周,干旱处理和对照的ΦPSII值都很稳定,没有明显差异,但随着处理时间延长,干旱处理的ΦPSII值呈下降趋势,在12周和16周时,干旱处理的ΦPSII值均显著低于对照值。对照的ΦPSII值到16周时也有一点降低。
3 讨论
3.1 火龙果生长量及茎水分状态对土壤干旱的响应
抗旱性强的植物可以通过构建发达的根系,增加根的吸水面积,提高根冠比,抑制叶片生长等来提高植株的抗旱能力[12];并且抗旱性强的植物在干旱条件下,能维持较高的叶片含水量[13]。本研究中,停止灌水后,土壤含水量迅速下降,在8周后达到严重干旱程度;但火龙果茎中含水量下降很缓慢,到16周时,含水量仅下降10%（轻度失水）。因此,火龙果茎的保水能力非常强。Nerd等[14]也发现火龙果植株在土壤严重干旱下,水势下降仅显示为轻度胁迫,并可维持茎生长;与之对应的是,停水处理10周内,茎的伸长生长并不受显著影响,显示火龙果可以在极端土壤干旱下维持茎的生长。研究中茎的横向生长（增宽）对土壤干旱更为敏感,在干旱胁迫下,减弱横向生长,维持伸长生长。Nerd等[14]的研究表明,新生的火龙果茎在重度干旱胁迫下,可以通过韧皮部从老茎中主动吸收水分。与茎生长受到重度土壤干旱抑制的效应相反,干旱胁迫反而显著促进根系伸长生长和新根萌生（表1）,以增强火龙果干旱条件下的吸水面积,是火龙果在干旱胁迫中的一种适应性表现。因此,干旱胁迫下,火龙果可以“动员”老茎中的储水供给根系生长和幼茎伸长生长。
3.2 干旱对火龙果光合生理的影响
叶片是植物响应水分胁迫最敏感的器官。叶温随着时间的变化与周围气温变化趋势基本一致,但叶温的变化滞后于气温的变化。一般来说,干旱条件下的植株叶温会比正常叶片温度高,可能是因为干旱使得气孔开放减少或角质层增厚而导致蒸腾作用减弱,从而叶片温度上升[15,16]。研究也指出长势差的作物比长势好的作物叶温高,老叶子比嫩叶子叶温高;白天,叶温均高于气温;日落后无直射光时,则低于气温[17,18]。和前人研究结果一致,火龙果新茎比老茎对于气温的升高或者降低更加敏感,而干旱处理的火龙果茎表温度比对照高。并且白天时,茎表温度高于气温;晚上,茎表温度低于气温。同时干旱条件下的火龙果茎对于气温的升高或降低更加敏感。
气孔关闭通常是植物应对干旱胁迫的最普遍反应[19],气孔开放度对土壤含水量变化的敏感程度大于气孔密度,气孔开口变小、密度变化、气孔数量变化是植物对干旱环境的响应[20]。刘紫娟等[21]研究指出,干旱胁迫使八宝景天叶片上下表皮气孔长度、宽度和气孔开度减小,气孔密度增大;气孔密度增加的原因可能是由于干旱景天叶面积减小,使单位叶面积气孔密度增加。而气孔长度、宽度和开度减小的原因是由于干旱影响了气孔的发生、分化和发育,使气孔变小。气孔变小使蒸腾减弱,提高水分利用效率。在本研究中,在干旱处理下,火龙果茎表气孔数量减少,气孔开放率和开放度明显减小,气孔长度和宽度均减小（图3,表2~3）。这可能是因为干旱导致气孔关闭,从而降低光合速率保持水分;同时,光合作用的降低又会影响细胞的伸长,造成叶面积减小,气孔变小。
陈昕等[22]研究干旱胁迫对石灰花楸幼苗的光合生理影响时发现,干旱胁迫下,石灰花楸幼苗叶片逐渐变薄,重度胁迫下干旱抑制光合色素合成,总叶绿素和类胡萝卜素含量均呈下降趋势,叶绿素a/b和叶绿素/类胡萝卜素值呈上升趋势。本研究结果表明,干旱处理显著影响了火龙果茎中的叶绿素和类胡萝卜素的含量,轻度干旱胁迫时,干旱处理和对照中的Chl a和总叶绿素含量差异不大;随着干旱程度的加深,处理中的Chl a、Chl b、总叶绿素含量及Chl a/Chl b都显著减少,说明火龙果茎的光合器官在轻度干旱胁迫时（干旱处理前8周）没有严重受损,光合色素可以通过增加合成的量来适应干旱环境,而在重度干旱胁迫时水分的亏缺已经超过火龙果茎的耐受范围,光合器官严重受损,光合色素降解速率大于合成速率,表现光和色素含量显著下降。在水分胁迫下,叶绿素荧光参数会发生一系列的变化。任何影响光合作用的环境胁迫（如水分胁迫）都会使Fv/Fm值降低。干旱胁迫下,李[23]、胡杨[24]、黑果枸杞[25]、橡胶树[26]植物的Fo和NPQ会升高,Fm、Fv以及Fv/Fm均下降,同时通过叶绿素荧光参数的变化情况筛选出了抗旱性最强的品种。本研究中,干旱胁迫初期,对照和干旱处理中的Fo、NPQ、Fv/Fm和ΦPSII值都没有差异;随着胁迫加剧,到了干旱胁迫后期,干旱处理中的Fo和NPQ显著高于对照;而Fv/Fm和ΦPSII值却显著低于对照;说明火龙果茎在轻度和中度水分胁迫下,光合能力不会明显下降,在重度水分胁迫时（干旱处理16周,土壤含水量下降至15%）才会显著影响光合效率。叶绿素吸收的光能主要通过光合电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散3种途径消耗,这3种途径之间存在着此消彼长的关系[27],当水分胁迫下叶绿素荧光降低,由热耗散引起的非光化学淬灭也会导致叶温上升,与本研究结果相符。