石斛具有有性生殖和营养生殖2种繁殖方式[1],然而受限于温暖高湿等环境因素,自然繁殖率极低,加之人为过度采摘和生境破坏,野生石斛资源逐年减少且濒临灭绝;野生驯化是解决石斛野生资源匮乏的根本途径[2]。组织培养技术是保存种质资源的重要技术,并已成为兰花产业种苗生产的一种常规方法,因此通过组织培养快速繁育石斛种苗对其资源保护及可持续利用具有重要意义。但石斛组培苗抗性差,种植存活率较低,必须进行驯化,否则会严重影响移栽成活率。除光照、温度、湿度、通风等环境因子影响其组培苗生长外,栽培基质对石斛驯化起着重要作用,其直接影响到石斛的生长发育和光合作用。国外采用松树皮做基质已有50多年的历史,使用松树皮做基质石斛生物量显著增加,长势较好[3]。国内仅对铁皮（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、金钗（Dendrobium nobile Lindl）、霍山（Dendrobium huoshanense）和鼓槌（Dendrobium chrysotoxum Lindl）等少数知名石斛基质方面进行了研究。水苔做基质有利于提高石斛移栽初期存活率[4];水苔与树皮结合可作为石斛的炼苗基质[5],使用苔藓或木屑作基质也有同样的效果,并且基质的不同成分及配比对铁皮石斛的存活率和生长量影响显著[6]。组培苗基质配制及处理不当会导致种苗存活率低,其中基质的理化性质起决定性作用[7],基质通过影响根系气、水的交换,进而影响石斛茎叶的生长,因此,栽培基质要保证具有良好的保水性和通风透气性。
华石斛（Dendrobium sinense）是海南特有兰科植物,自然分布于海南岛中西部海拔1000 m以上的高山云雾林或山地雨林中[8];同时也是一种传统的黎药[9],因全草富含芪类、联苄类等多类化合物,具有良好的抗菌、抗肿瘤活性[10]。华石斛在自然条件下结实率低,种子萌发成苗极为困难,华石斛野生种群数量不断减少,目前已处于濒危状态。基质对石斛移栽成活和生长影响显著[11],已研究结果表明,水苔保水和透气性均较好[12],而水苔和树皮结合又可促进石斛生长健壮、叶色浓绿[13],有利于组培苗存活和萌发新根、新芽。但基质用量、紧实度等影响基质保水及通气性的指标,造成水苔基质过湿和树皮基质保水不够等现象,在生产上十分常见。基质透气性和保水性矛盾,这可能与用量或基质搭配有关。本研究设计4种基质处理,通过对各基质的理化性质进行分析及其对华石斛组培苗生长指标的影响,以期筛选出适宜华石斛组培苗的炼苗基质。拟解决如下问题：（1）探索基质配比与华石斛组培苗炼苗成活率的关系;（2）研究基质配比对华石斛组培苗炼苗期生长情况的影响;（3）华石斛组培苗炼苗期基质的优化筛选。研究结果为华石斛组培苗对不同基质的适应性研究提供参考,为华石斛的规模化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 华石斛组培苗：选取4片叶（叶色正常）、2~3条根（根长2~3 cm）、无污染的健康苗。
1.1.2 试验区概况 本研究于2017年2—12月在海南省霸王岭自然保护区（北纬19°5′57″,东经109°10′32″;海拔978 m）的塑料大棚内进行。山泉水pH 6.0,采用温湿度自动记录仪LWS-Ⅱ测得环境因子如下：温度18.3~35.0 ℃（平均23.4 ℃）,湿度52.4%~100%（平均94.9%,夜间100%）,光照度0~18.4 klx（白天平均3.4 klx）,风速0~3.7 m/s。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 本研究设计4种基质处理进行炼苗试验（表1）,所有基质在种植前进行杀菌处理。
表1 华石斛组培苗的基质处理Tab. 1 Substrate treatment for D. sinense tissue culture |
| 处理Treatment | 基质比例及 处理方法 Matrix ratio and treatment method | 水苔用量Dosage/g | 容器 Container |
|---|---|---|---|
| 对照 （CK） | 纯水苔 | 6.0 | 105孔穴盘（宽3.5 cm、深4.2 cm） |
| 基质1 （JZ1） | 水苔∶树皮=1∶1 | 5.4 | 105孔穴盘（宽3.5 cm、深4.2 cm） |
| 基质2 （JZ2） | 上层水苔,下层（树皮∶火山岩∶木炭 = 1∶1∶1）占2/3 | 6.0 | 塑料杯（直径10 cm、深10 cm） |
| 基质3 （JZ3） | 纯水苔 | 16.3 | 透明塑料杯（直径5 cm、深5 cm） |
1.2.2 试验处理 首先,把种植好的组培苗放置于75%的遮阳网下7 d,组培苗不喷水（温度持续较高时进行少量叶面喷雾）,刺激其生根,初步适应外界环境。1周后,以喷雾形式对组培苗补充少量水分,逐渐增加基质含水量,使组培苗逐步适应大棚环境,每隔7 d对叶面喷施稀释3000倍的花多多高磷肥（N∶P∶K=9∶45∶15）,增加组培苗抗性,促进石斛生根与萌芽。种植1个月后,每隔7 d喷施稀释3000倍的高氮肥（N∶P∶K=30∶10∶10）,促进石斛进行营养生长。7~10 d喷1次杀菌剂,多种杀菌剂交替使用,并进行石斛常见病虫害防治和及时清理病株。每个处理设置3盘苗,每盘30丛,采用随机区组排列。
1.2.3 指标的测定 （1）基质理化性质的测定：采用饱和重力排水法[14]测定基质的孔隙度和气水比;使用pH计测定基质的pH。
（2）华石斛苗生长指标的测定：每隔1周统计组培苗的存活率和新芽率,存活率=存活丛数/总丛数×100%,新芽率=新芽丛数/总丛数×100%;每个处理随机取5丛,使用游标卡尺测定组培苗茎长和茎粗;处理2个月后,华石斛苗的生长基本稳定,每个处理随机取3丛测定壮苗指标,采用烘干至恒重法测其地上部和地下部干重,计算地上部茎叶含水量和壮苗指数,壮苗指数=（茎粗/茎长+地下部干重/地上部干重）×全株干重[15];5个月后各处理的植株叶片差异显著,测其功能叶的叶长、叶宽和叶面积。
（3）华石斛苗光合指标的测定：处理2个月后,选取华石斛组培苗的功能叶,用SPAD-502Plus测定叶绿素相对含量,5次重复,取其平均值;在晴朗天气的上午9：00—11：30使用Yaxin-1101光合测定仪测定净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度,每个指标做3个重复,取其平均值。
1.3 数据处理
采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析（P<0.05）和Duncan多重比较,并对基质的孔隙度与华石斛苗的生长指标作相关性分析。
2 结果与分析
2.1 不同基质的孔隙度及其对华石斛组培苗存活率的影响
不同基质处理的理化性质有所差异,JZ1和JZ3的容重、总孔隙度和气水比相对较大,且JZ3显著高于其他处理（表2）。JZ1与CK相比,加入树皮后容重、孔隙度和气水比均高于CK处理;CK和JZ2的pH显著高于JZ1和JZ3,但均呈弱酸性,适宜华石斛生长。种植2个月后,华石斛苗生长情况基本稳定,JZ3存活率最高,达56.3%,CK、JZ1、JZ2分别为21.0%、26.7%和20.3%,存活率较低;JZ3的新芽率显著高于其他3种基质,达39.0%。并且基质的总孔隙度（0.98**）、持水孔隙度（0.98**）、通气孔隙度（0.98**）和气水比（0.90**）均与存活率呈极显著相关关系。
表2 基质的孔隙度与组培苗存活率的相关性分析Tab. 2 Correlation analysis of matrix porosity and survival rate of tissue culture seedlings |
| 处理 Treatment | 总孔隙度 Total porosity/% | 持水孔隙度 Water holding porosity/% | 通气孔隙度 Ventilation porosity/% | 气水比 Air-water ratio | pH | 存活率（2个月） Survival rate （Two months）/% | 新芽率 New bud rate/% |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 13.0±0.0c | 5.1±0.0c | 7.9±0.0c | 1.55±0.00c | 6.2±0.1a | 21.0±2.6c | 11.0±1.0c |
| JZ1 | 16.8±0.1b | 5.4±0.1b | 11.4±0.1b | 2.12±0.03b | 6.0±0.1b | 26.7±1.5b | 13.0±1.0b |
| JZ2 | 12.7±0.1d | 4.9±0.1d | 7.8±0.1c | 1.58±0.02c | 6.2±0.1a | 20.3±1.2c | 7.0±1.0d |
| JZ3 | 42.1±0.1a | 12.0±0.1a | 30.1±0.1a | 2.51±0.02a | 5.9±0.1c | 56.3±2.5a | 39.0±1.0a |
注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level. |
2.2 不同基质对华石斛苗形态指标的影响
图1 不同基质处理华石斛组培苗2个月的生长量变化不同小写字母表示各处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 1 Changes in growth of 2 months of D. sinense seedlings treated with different substrates Different lowercase letters indicate significant ifference between treatments (P<0.05). |
2.3 不同基质处理对华石斛组培苗壮苗指数的影响
不同基质处理对华石斛组培苗壮苗程度的影响有所差异（表3）。除茎粗外,JZ1与CK相比各指标差异均不显著,JZ3的茎长显著高于其他3个处理;JZ1、JZ2、JZ3的茎粗显著高于CK;从地上部干重、地下部干重和壮苗指数来看,JZ2和JZ3显著高于CK和JZ1,壮苗指数达0.015和0.016,并且基质的总孔隙度（0.65*）、持水孔隙度（0.66*）、通气孔隙度（0.64*）均与壮苗指数呈显著相关关系,壮苗指数与气水比（0.5）呈正相关。表明组培苗生长需要一定的空间,并且基质太少、失水过快不能起到保湿效果,不利于组培苗生长。
表3 不同基质下华石斛组培苗的壮苗指标Tab. 3 Strong seedling indicators of tissue culture seedlings of D. sinense under different substrates |
| 处理 Treatment | 茎长 Stem length/cm | 茎粗 Thick stem/cm | 地上部干重 Aboveground dry weight/g | 地下部干重 Underground dry weight/g | 壮苗指数 Strong seedling index |
|---|---|---|---|---|---|
| CK | 2.496±0.036c | 0.249±0.003b | 0.036±0.002b | 0.006±0.001b | 0.012±0.001b |
| JZ1 | 2.467±0.060c | 0.280±0.014a | 0.036±0.003b | 0.006±0.001b | 0.012±0.001b |
| JZ2 | 2.741±0.046b | 0.286±0.008a | 0.041±0.002a | 0.008±0.001a | 0.015±0.001a |
| JZ3 | 2.914±0.130a | 0.286±0.007a | 0.045±0.003a | 0.009±0.001a | 0.016±0.001a |
注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level. |
2.4 不同基质处理下华石斛组培苗的光合生理
不同的基质处理对华石斛组培苗的光合指标的影响有较大差异（表4）。各处理的气孔导度无显著差异;JZ2和JZ3的胞间CO2浓度显著高于CK和JZ1;JZ3的蒸腾速率显著高于CK和JZ1;JZ1和JZ3的叶绿素相对含量显著高于CK和JZ2,达32.3和34.1,其中CK为最低;JZ3的净光合速率显著高于其他3个处理,达到7.806 μmol/(m2·s)。
表4 不同基质下华石斛组培苗的光合生理指标Tab. 4 Photosynthetic physiological indexes of tissue cultured seedlings of D. sinense treated under different substrates |
| 处理 Treatment | 叶绿素含量 Chlorphyll content/SPAD | 净光合速率 Net photosynthetic rate/(μmol·m-2·s-1) | 蒸腾速率 Transpiration rate/(mmol·m-2·h-1) | 气孔导度 Stomatal conductance/(mol·m-2·s-1) | 胞间CO2浓度 Intercellular CO2 concentration/(μmol·mol-1) |
|---|---|---|---|---|---|
| CK | 24.7±1.10d | 2.743±0.364c | 0.082±0.051b | 1.0±0.9a | 363±5.0c |
| JZ1 | 32.3±2.48b | 4.747±0.448b | 0.083±0.008b | 2.0±1.7a | 394±6.0b |
| JZ2 | 28.4±0.75c | 4.430±0.633b | 0.183±0.143ab | 2.6±2.3a | 444±16.0a |
| JZ3 | 34.1±0.57a | 7.806±0.365a | 0.325±0.041a | 4.0±1.4a | 452±16.0a |
注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level. |
3 讨论
3.1 基质特性对华石斛组培苗的影响
长期以来,移栽成活率低一直是困扰石斛规模化生产的“瓶颈”。栽培基质是基础,种苗质量是关键,基质是石斛组培苗炼苗初期存活的重要因子,采用疏水透气保水的栽培基质可提高霍山、鼓槌等石斛的种植成活率[16],基质的选择是无土栽培成败的关键[17]。石斛长新根和新芽需要基质保水能力好,根数和新芽的生长量主要依靠基质中的水分和养分,帮助石斛快速恢复生长[18]。华石斛气生根、附生和喜温暖高湿的特性使其对基质透气性、保水和疏水性要求较高。树皮能显著提高铁皮石斛的鲜质量和株高等生长指标,水苔可显著提高铁皮石斛光合色素的合成,从而提高叶片的光合作用[19]。本研究结果显示,用水苔作为基质有利于华石斛组培苗生根、长新芽,可作为组培苗生长所需基质,其中用水苔在5 cm透明塑料杯种植为最佳种植方式。但水苔的处理不同,其透气性和保水性有所差异,如水苔中加入少量树皮,可达到增加孔隙度和透气的作用,从而通过影响根系的水分吸收和透气性影响石斛存活率;用105孔穴盘种植,水苔用量较少,且过于紧实,保水和透气性低于5 cm透明塑料杯。水苔在透气、透水方面存在明显不足[20],而且容易烂根和虫害入侵,这可能是限制华石斛组培苗成活率的主要原因,因此华石斛炼苗基质在既保水又透气方面还有待进一步改善。
3.2 基质配比对华石斛组培苗形态指标的影响
基质为石斛提供水分、养分和保证根系气体交换,进而影响铁皮石斛的生物量[21]。华石斛在2个月内叶片无明显变化,但茎长、茎粗和鲜重增长量较为明显,并且各处理间差异显著。对比发现,基质通透性高,则茎粗增加量较大;基质用量较大保水性较好,茎长和鲜重显著增加。水分胁迫会导致铁皮石斛叶片光反应能力降低,抑制叶绿素的合成[22]。5个月后叶片差异显著,CK和JZ1处理差异不显著,叶片均呈细长状,叶宽和叶长增长量均显著小于JZ3处理,说明CK和JZ1保水性和透气性稍差于JZ3,根部吸收水分不稳定、根系透气性差,导致植株生长不良,叶面积增加量相对较少。叶片是植物进行光合作用的主要器官,叶绿素含量是反映植物光合能力和健康状态的重要指标[23],水分胁迫直接导致碧玉兰叶片的叶绿素含量降低[24],叶面积较小和叶片的非正常生长也会导致植株叶绿素含量和净光合速率较低。JZ2的叶宽增长量明显高于叶长,且基质透气性高于CK,但其保水性与CK无明显差异;JZ3与CK相比,增加了水苔的用量,叶长和叶宽同步增加,生长正常;JZ2与JZ3相比水苔用量较少,说明JZ2用量较少,基质保水性方面稍弱于JZ3,因此JZ2可在保证透气性的基础上增加水苔用量,保证石斛的正常生长。
3.3 基质配比对华石斛组培苗物质累积和壮苗指标的影响
植株的生物量不仅反映了植株对水分、营养的吸收能力,还反映了植株的健康水平[17]。石斛光合作用碳同化具备兼性CAM植物的特征[25],大都生长缓慢,低光合作用能力是石斛生长缓慢的重要原因。光合作用直接反映作物的生长状况,其很大程度上影响金钗石斛的生长速度[26],根系的水、气交换不良,植株生长不良,导致光合速率的降低;净光合速率代表植物物质累积的能力,净光合速率降低导致植株物质积累较少,壮苗指数较低。本研究结果表明,不同的基质处理对华石斛组培苗生长状态有明显差异。2个月后CK和JZ1的茎长和茎粗增加不明显,远低于JZ2和JZ3,进而导致鲜重降低;JZ3的叶片深绿肥厚,表现为较强的光合作用能力,鲜重和壮苗指数较大。
综上所述,在华石斛组培苗炼苗期间,以5 cm透明塑料杯装16.3 g水苔作基质进行种植,华石斛组培苗存活率较高,生长指标和光合指标反应较好,可作为华石斛大棚炼苗的优良基质。由于组培苗生长缓慢、抗逆性差等原因,因此要提高组培苗存活率,必须提高组培苗的抗性。在如何提高华石斛组培苗的抗逆性、改善基质保水透气性等方面,仍需做进一步的研究。
致谢
海南大学周扬老师、陈金辉老师、蔡泽坪老师等在写作中给予了支持和帮助,在此一并致谢！