琯溪蜜柚 [Citrus maxima (Burm.) Merr. cv ‘Guanximiyou’] 是中国特色果树柚子最重要的品种之一,其丰富的芽变为柚子栽培提供了大量优质的新品种。从1998年在福建平和县小溪镇厝丘村琯溪蜜柚果园中首次发现果实汁胞呈红色芽变单株以来,至今已发现10多个芽变品种或单株,选育出了果皮、海绵层、果肉颜色不同和果实大小、成熟期不同的突变系列新品种或单株,如黄色果皮、白海绵层、红色果肉的芽变品种‘红肉蜜柚’,黄色果皮、白色果肉、红色海绵层的芽变品种‘红绵蜜柚’,黄色果皮、红色海绵层和果肉的芽变品种‘三红蜜柚’,黄色果皮、白色海绵层、金黄色果肉的芽变品种‘黄金蜜柚’,以及‘迷你红柚’‘红钻蜜柚’‘璋益蜜柚’‘金桔蜜柚’‘西瓜柚’‘六月早柚’等不同变异的芽变单株。这些芽变品种（单株）极大地丰富了我国柚子栽培品种。随着生活水平的不断提高,人们对果实外观、品质和保健要求越来越高,柚子果实色泽的突变也受到越来越多的关注。‘琯溪蜜柚’一代芽变品种‘红肉蜜柚’、二代芽变品种‘三红蜜柚’,海绵层、瓤衣、果肉发生了变异。‘琯溪蜜柚’果皮呈淡绿黄色、海绵层和果肉均为白色,一代芽变品种‘红肉蜜柚’的果皮为淡绿黄色,海绵层为白色,但果肉为红色,而二代芽变品种‘三红蜜柚’果皮为淡绿黄色（套袋后可显示淡紫红色）,海绵层和果肉均为紫红色。
对‘琯溪蜜柚’及其芽变品种果实生长发育过程中类胡萝卜素的分离及其积累[1],类胡萝卜素合成途径[2],β-胡萝卜素合成途径相关酶基因[3],COMT基因的克隆与表达[4]等进行了相关研究,结果初步明确了‘琯溪蜜柚’及其2个红肉芽变品种果实内不同组织中红色色素分布与积累过程各有差异。但基于基因组和转录组对‘琯溪蜜柚’突变体类胡萝卜素代谢差异基因的研究较少。对富含番茄红素的‘红肉蜜柚’和富含β-胡萝卜素的‘黄金蜜柚’进行基因组、转录组整合分析,发现除了NCED2在红肉和橙肉柚中出现更高表达,整体类胡萝卜素合成途径上基因的表达水平变化并不显著。对191份代表性的柚类群体进行GWAS分析,认为自然界柚类资源果肉的红色性状可能由不同的机制和位点控制着[5]。
‘琯溪蜜柚’及其芽变株系果实,在生长发育的不同阶段其果肉颜色变化不同,‘红肉蜜柚’果实在花后120 d左右有个转色期,由白色转为红色,到花后180 d时颜色最深;‘三红蜜柚’果实在花后不同的生长发育阶段均为红色,但颜色随着花后生长时间延长而由浅到深。研究发现,决定这3个品种颜色变化差异的原因,是由于‘红肉蜜柚’和‘三红蜜柚’的果肉大量积累类胡萝卜素的番茄红素形成的[1],但是具体的分子机制并不清楚。为此,本研究对这3个品种果实的3个不同发育阶段进行转录组测序分析,以期探讨引起果肉色素差异的原因,探索柚子类胡萝卜素形成与积累的分子机理。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究对‘琯溪蜜柚’（GX）及其芽变一代品种‘红肉蜜柚’（HR）、芽变二代品种‘三红蜜柚’（SH）的盛花后不同时期的果实汁胞（图1）进行转录组测序分析,比对不同时期的GX vs. HR、GX vs. SH和HR vs. SH的相关基因和转录因子的差异表达。
试验材料GX、HR、SH果实采自漳州市平和县。分别选取供试3个品种各1株8年生结果树,选择盛花后80、120和180 d 3个时期,每个时期3个品种3个对照组,每株果树各采3个果实样品,共27个样品,采样当天运回试验室,剥开果实,将汁胞混匀装进提前折好的铝铂纸盒中,液氮速冻后放入超低温冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 转录组测序与分析 转录组的建库、组装与分析均委托广州华大生物科技有限公司完成。采用spearman方法计算类胡萝卜素生物合成途径的功能基因与转录因子的相关性,设置相关性系数阈值为大于0.73或者小于-0.73,且至少有1个FKPM大于等于10,以排除假阳性。将转录组的参考基因组（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）进行注释（https://www.plabipd.de/portal/mercator- sequence-annotation）,然后将差异基因上传到软件MapMan中,根据软件自带的通路图（mteabolism overview）进行DEGs的汇总。
1.2.2 qRT-PCR验证 RNA提取方法参照博日多糖多酚RNA提取试剂盒说明书。分别以不同品种和不同时期果肉的RNA为底物,按照PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa公司）说明书合成cDNA。利用软件Beacon Designer 6设计基因的荧光定量引物,Actin-F: 5°-AGAAC TATGAACTGCCTGATGGC-3°,Actin-R: 5°-GCT TGGAGCAAGTGCTGTGATT-3°。qRT-PCR反应参照SYBR® Premix Ex TaqTM (TliRNaseH Plus)（TaKaRa公司）说明书进行,相关引物见表1。
表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab. 1 Primers for real-time quantitative PCR analysis |
| 基因ID Gene ID | 基因序列Genes sequence | 引物序列（5°-3°）Primers sequence (5°-3°) |
|---|---|---|
| Cg2g000880 | F: AGGGCATGAGAATGGACACA | R: CACCGGAACACTCATTAGGC |
| Cg3g011400 | F: TACGGGCTTCTTTGGACACT | R: GCCCAGCTCCAATAATAGCG |
| Cg1g004260 | F: GGTTACGACTTGCTGACACC | R: CATTACTCCGCCTCCAGGAT |
| Cg3g000740 | F: TCGGGACAAGTGTGATGTGA | R: AATAGAGCTGCGGAATGGGA |
| Cg7g023370 | F: TCGGAGCACGAAATGGAGTA | R: GAGCGAAGTTACCGGAGAGA |
| Cg5g030510 | F: CGTTGGCTGCAAGTTCCATA | R: TAACTGGGAGCACGTTGACT |
| Cg5g016320 | F: CTGCCAGAACCTTCCCACTA | R: CGTCTCCGTCGAAGAAATGG |
| Cg2g044950 | F: GAACAAGAAGTCCCGGTTCG | R: TTCATCAGTTTCCGGCTCCT |
| Cg8g011320 | F: TCTCAAGCGTTGACCCTTCT | R: ACTTGGTCAAGCTCAGGGTT |
| Cg6g020290 | F: TTCATGCCATTTGGGAACGG | R: TGGGCTAATCTGATGGGCAA |
| Cg1g024280 | F: CAGACGGATTCGAGTTGCC | R: CCATTTGGGCACACTTTGGA |
| Cg9g020260 | F: ACTTCCCAAGTTTGCTGGC | R: TGGCCTCAGGTAGTTCATCC |
| Cg4g000690 | F: AAACGTCAAGAGCACTGAC | R: CCGGTGATAGCAGAGGACAT |
| Cg5g010410 | F: CTCCTTCATCGGTCCCAGT | R: TGAGGCCTGTGTCTTGTGAA |
| Cg2g039290 | F: GGGCTGACTCCTTAACTGT | R: AAGGAACAGCACATGATCGC |
| Cg6g006420 | F: GGAAGACGGTTGGTGATGTG | R: GAGTCGATGAGCCTCTCTT |
| Cg2g021370 | F: AGCTGGTGGTTCACTACCTC | R: GTTGCCTTAGCTGGAAGCTC |
| Cg5g039890 | F: GGAGCCTTGGAACAGGTACT | R: TGGCGAAATTGGTTGAAGGG |
| Cg9g001010 | F: AACCCAGCTACTCCCAACTC | R: ATCGTCATCACCAGCTTTGC |
| Cg6g008620 | F: TTTGCGTCAAAGACAGGCAA | R: CTTCGAGCAGACGGGAAATG |
| Cg3g014620 | F: CCTGTTTCCGAACAGAGCAA | R: TTCACAAGTTGAGGCTGCTG |
| Cg4g019190 | F: GCCGATCATGCTCAACTTCA | R: CTGAGGCCAGCAGGAATAGA |
| Cg2g021360 | F: GGTTCAGAGTGGGCTTAGGA | R: TCAACCGGGCTACAGAAGTT |
| Cg7g016010 | F: GCATCGGAGATGAGGAGGAA | R: GCAAAGCATCCAAGGCTACA |
| Cg8g017110 | F: TCCTTGCCCAAGGTGAGAAA | R: TGAGCATGGCTTCGGATTTG |
| Cg1g007400 | F: CCCAGTGGATGGATCCTTGA | R: TGACGTGTCAACCTCTGGAA |
| Cg6g024730 | F: CCGGTGTATCGAGGATCAGT | R: GGTCATCAACTTCCCTGTGC |
| Cg5g022640 | F: ACGTTCATGGGTCACCTTCA | R: ACTCCGACACCGTTTGATCT |
2 结果与分析
2.1 转录组测序结果统计
以花后80、120和180 d的3个蜜柚品种的果肉总RNA构建27个cDNA文库。将原始测序数据过滤组装。每个样品均达到5.1 Gb数据量,GC含量43.73% ~ 44.56%,且各样品Q30碱基百分比均大于88.82%。进而,分别将各样品的Clean Reads与柚子（Citrus maxima）基因组进行序列比对,各样品的Reads与参考基因组的比对效率为94.67% ~ 95.98%,说明数据测序质量与所选参考基因组组装质量完全满足转录组分析的要求。
2.2 差异基因分析
图2 在不同发育阶段3个蜜柚品种差异表达的基因数量Fig. 2 Venn diagram illustrating the number of differentially expressed genes of three pomelo cultivars at different developmental stages |
表2 3个蜜柚品种在果实发育阶段的差异表达基因数Tab. 2 Differentially expressed genes at fruit developmental stages in three pomelo cultivars |
| 果实发育阶段Fruit development at different stages | GX | HR | SH | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 差异基因总数 ALL DEGs | 上调数 Up- regulated | 下调数Down- regulated | 差异基因总数 ALL DEGs | 上调数 Up- regulated | 下调数 Down- regulated | 差异基因总数 ALL DEGs | 上调数Up- regulated | 下调数Down- regulated | |
| 80 d/120 d | 3182 | 1322 | 1860 | 2896 | 1240 | 1656 | 2784 | 1127 | 1657 |
| 120 d/180 d | 1673 | 952 | 721 | 3094 | 1304 | 1790 | 3020 | 1162 | 1858 |
| 80 d/180 d | 4301 | 2008 | 2293 | 4158 | 1571 | 2587 | 3834 | 1375 | 2459 |
| 80 d/120 d/180 d | 619 | 651 | 632 | ||||||
2.3 差异表达基因的功能注释和分析
为了确定和注释3个蜜柚品种的转录组数据,对差异表达基因与NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,Pfam和KEGG这7个数据库进行功能注释,发现HR果肉在80 d和180 d之间注释富集到了最多的KEGG,共1317条。3个蜜柚品种芽变的性状是由次级代谢中的类胡萝卜素决定的,进一步对次级代谢中的主要KEGG进行差异基因数目的统计（图3）,发现在苯丙烷生物合成途径差异基因最多,在GX、HR和SH 3个品种果实中分别有63、66和68个,其次是黄酮类合成途径,在类胡萝卜素代谢途径中分别有8、9、10个。苯丙烷、黄酮类代谢均与木质素合成关系密切,与汁胞粒化密切相关;且黄酮类代谢还与类胡萝卜素代谢相关。说明‘琯溪蜜柚’果肉红色芽变还伴随着与汁胞粒化相关的突变,这与‘红肉蜜柚’‘三红蜜柚’2个芽变品种较‘琯溪蜜柚’容易发生汁胞粒化症相符合。
2.4 类胡萝卜素代谢分析
表3 3种蜜柚品种中果实发育阶段的类胡萝卜素生物合成相关基因的表达谱Tab. 3 Expression profiles of carotenoid biosynthesis-related genes at fruit developmental stages in three pomelo cultivars |
| 基因名 Gene name | 基因ID Gene ID | 基因长度 Gene length | 琯溪蜜柚GX | 红肉蜜柚HR | 三红蜜柚SH | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 80 d | 120 d | 180 d | 80 d | 120 d | 180 d | 80 d | 120 d | 180 d | |||
| PSY | Cg2g000880 | 1155 | 0.05 | 0.02 | 0.17 | 0.28 | 0.06 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| ZDS | Cg3g011400 | 587 | 2.43 | 0.87 | 1.29 | 3.33 | 3.11 | 3.35 | 2.52 | 1.40 | 2.68 |
| CRTISO1 | Cg1g004260 | 1698 | 2.08 | 0.70 | 1.69 | 2.65 | 2.14 | 1.82 | 1.70 | 1.29 | 1.67 |
| CRTISO2 | Cg3g000740 | 1743 | 0.42 | 0.40 | 0.29 | 0.85 | 0.31 | 0.65 | 0.81 | 0.22 | 0.74 |
| CCD4 | Cg7g023370 | 1788 | 78.78 | 94.48 | 159.88 | 116.83 | 109.13 | 82.82 | 96.98 | 97.24 | 101.90 |
| NPQ1 | Cg5g030510 | 1452 | 0.91 | 1.49 | 1.39 | 1.33 | 0.82 | 1.59 | 1.57 | 0.58 | 1.43 |
| NCED3 | Cg5g016320 | 1821 | 6.97 | 4.91 | 4.93 | 18.95 | 3.66 | 2.27 | 11.78 | 1.31 | 2.13 |
| NCED5 | Cg2g044950 | 1830 | 93.53 | 130.10 | 52.13 | 62.55 | 45.50 | 156.30 | 92.87 | 24.02 | 179.20 |
| AAO3 | Cg8g011320 | 4143 | 6.730 | 4.772 | 1.787 | 8.991 | 5.595 | 1.800 | 7.720 | 4.540 | 2.290 |
| CYP707A1 | Cg6g020290 | 1413 | 18.51 | 32.73 | 144.59 | 37.64 | 96.74 | 8.84 | 13.06 | 93.23 | 49.39 |
为了鉴定3个蜜柚品种差异表达的转录因子,利用百迈客云平台（www.biocloud.net）预测柚子中的所有转录因子,与所有差异基因取交集发现其中具有差异表达的转录因子共有570个,来自51个不同家族。用spearman方法计算类胡萝卜素生物合成途径的功能基因与转录因子的相关性,设置相关性系数阈值为大于0.73或者小于-0.73,且至少有一个FKPM大于等于10（排除假阳性）,得到的转录因子共有205个。又分别筛选每个功能基因正负相关性最大的5个基因进行分析,最终得到与类胡萝卜素代谢高度相关的候选转录因子71个,分布在27个不同家族。其中,包括7个与类胡萝卜素代谢相关的转录因子家族,为MADS、bZIP、bHLH、MYB、AP2/ERF、NAC和WRKY（图5）。在图5中,有大片区域展示蓝色,说明该区域转录因子对类胡萝卜素合成基因为负调控作用;红色区域说明处于这一块区域转录因子对类胡萝卜素合成基因为正调控作用。如Cg4g002330对CYP707A1显著正相关,与NCED5、ZDS显著负相关,与CRTISO2极显著负相关。
图5 类胡萝卜素合成基因与转录因子的相关性横排代表的是转录因子,竖排代表的功能基因;蓝色代表负相关,红色代表正相关,颜色越深代表相关性越高;+表示P<0.05,*表示P<0.01。 Fig. 5 Correlation between carotenoid synthesis genes and transcription factors The horizontal row represents the transcription factor, and the vertical row represents the gene of the carotenoid synthesis; in the figure, blue represents a negative correlation, red represents a positive correlation, and the darker the color, the higher the correlation; + means P<0.05, * means P<0.01. |
此外,由图6可知,类胡萝卜素代谢相关的转录因子,在3个蜜柚品种和3个时期的表达趋势各异。
2.5 ‘红肉蜜柚’果实转色期的初生和次级代谢分析
果实发育是一个代谢物积累、转运和降解的过程。类胡萝卜素代谢只是次级代谢中的一种,离不开其它代谢过程的相互作用。‘红肉蜜柚’是‘琯溪蜜柚’的芽变品种,在果实成熟过程,果肉从白色突变为红色,是研究类胡萝卜素与其他代谢途径协同关系的重要材料。经‘红肉蜜柚’果实转色期的初生和次生代谢通路DEGs富集分析,发现在类胡萝卜素积累的过程中,差异基因富集最多的是细胞壁代谢、脂质代谢、次生代谢途径,其次是糖代谢、抗坏血酸和谷胱甘肽等一些代谢途径。其中,细胞壁代谢途径差异表达最多的是纤维素合成、果胶甲脂酶、果胶酸裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶基因;在糖代谢途径中,淀粉降解加快,蔗糖合成加快,蔗糖降解减慢,符合果实成熟发育的特征;抗坏血酸和谷胱甘肽代谢的基因多数上调表达;次级代谢途径中,类胡萝卜素代谢的上游代谢途径类黄酮代谢中差异表达基因数最多,与类胡萝卜素代谢关系较为密切。
这一结果再次表明,在果肉红色芽变果肉中类胡萝卜素代谢相关基因差异表达的同时,伴随着与汁胞粒化相关基因的差异表达。
2.6 qRT-PCR验证
为了进一步证实转录组学分析的结果,选择了10个类胡萝卜素合成的差异表达基因,以及18个与类胡萝卜素代谢极显著（P<0.01）相关的转录因子,通过qRT-PCR在3个蜜柚品种中分析了10个与类胡萝卜素生物合成相关的基因。如图7所示,所有选择的基因在3个阶段中以不同水平表达,并且与RNA-seq数据具有紧密相关性。
根据qRT-PCR结果（图7）,HR和SH 3个时期果实的ZDS和CRTISO2基因的表达均高于GX,可能是HR和SH积累番茄红素的关键因素。CCD4对应拟南芥中的AtCCD4（AT4G19170.1）,GX果肉中的表达量从80 d到180 d下降了约2倍,而HR上升了约1.5倍,说明CCD4可能在蜜柚果肉中调控番茄红素的降解。AAO3在不同蜜柚品种中随着果实的成熟而下降,说明到成熟后期内源ABA合成迅速减慢。CYP707A1在HR和SH中呈先升高后降低的趋势,而GX则随着成熟不断升高。这可能涉及在果实成熟后期降低ABA含量防止其过度积累,从而使果实生命活动趋于稳定。因此,推测ABA的合成受类胡萝卜素的含量和组分的调控,同时,ABA也参与调控果实成熟及类胡萝卜素的反馈调节。MYB5、WRKY1、MADS1、MADS2和WRKY2在GX的3个发育时期的差异表达是3个品种中最显著的。MYB3在80 d时在SH中的表达量最高,随着果实发育迅速下降。转录因子NAC3在GX 3个发育时期的果实中的表达量逐渐上升,在HR和SH的80 d与120 d时期保持一定的表达量,在180 d时表达量增大1倍,而NAC4则呈现逐渐下降后期回升的趋势。转录因子ZIP1、ZIP2、BHLH1和BHLH2在3个品种中则都随着果实发育而下降。
3 讨论
在本研究中发现,‘红肉蜜柚’和‘三红蜜柚’3个不同时期果实的ZDS和CRTISO2基因的表达均高于‘琯溪蜜柚’。前人研究表明,八氢番茄红素合酶基因（PSY）、六氢番茄红素脱氢酶基因（ZDS）、类胡萝卜素异构酶基因（CRTISO）、紫黄质脱环氧酶（NPQ）、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）在类胡萝卜素生物合成中,可能是控制类胡萝卜素代谢的关键因素[2,3,8,10]。另有研究报道,分别从番茄和拟南芥中分离和鉴定得到了类胡萝卜素异构酶（CRTISO）基因,并确认了在植物体内由八氢番茄红素转化番茄红素是PDS、ZDS和CRTISO三个酶基因共同作用的结果[11,12]。由此可见,ZDS和CRTISO2基因的上调表达是‘琯溪蜜柚’红肉突变体‘红肉蜜柚’和‘三红蜜柚’积累番茄红素的关键因素。
‘琯溪蜜柚’果肉中的CCD4表达量从花后80 d到180 d下调了约2倍,而‘红肉蜜柚’上调了约1.5倍。有研究证实,CCD4酶是编码具有9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶活性的蛋白质,作用于多种类胡萝卜素,包括β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和全反式-紫黄质。在不同植物不同组织中对类胡萝卜素具有调控作用,如拟南芥种子[13]、菊花瓣[14]和桃果肉[15,16]。柑橘中的CCD4酶通过切割β-胡萝卜素、β-隐黄质和玉米黄质中的C7’-C8’双键,从而调控果皮色素、β-柑橘苷、β-柠檬醛以及挥发物等[17,18,19]。已经证实9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶NECD对顺式-环氧类胡萝卜素的氧化裂解是高等植物中ABA合成调节的关键步骤[20]。说明CCD4可能在蜜柚果肉中调控着番茄红素的积累。
本研究结果表明,在不同蜜柚品种中AAO3随着果实的成熟而下降,说明到果实成熟后期内源ABA合成减慢。已有研究表明,水果中ABA含量的调节是由两种主要的代谢酶基因AAO3和CYP707A1调控的[21]。外源ABA处理,可以显著影响杧果[22]、葡萄[23,24]、西瓜[25]等水果类胡萝卜素含量的积累。同样,参与类胡萝卜素代谢的几个重要基因,如来自玉米的PSY3和来自水稻的β-胡萝卜素羟化酶基因DSM2,都被ABA处理显著诱导[12, 26]。这些结果表明,ABA既是类胡萝卜素途径的下游产物,同时也是类胡萝卜素代谢的反馈调节剂。在本研究中观测到,CYP707A1在‘红肉蜜柚’和‘三红蜜柚’果实中,呈先上调而后下调的趋势,而‘琯溪蜜柚’则随着成熟不断升高。因此,推测ABA的合成受类胡萝卜素的含量和组分的调控,同时,ABA也参与调控果实成熟及类胡萝卜素的反馈调节。
本研究筛选到18个与类胡萝卜素合成基因显著相关的转录因子,其家族分别为9个AP2/ERF、4个bHLH、3个bZIP、3个MADS-box、7个MYB、5个NAC和5个WRKY。已有研究报道了一些转录因子可能调控类胡萝卜素代谢,如拟南芥中的PIF1和RAP2.2（AP2/ERF家族）[27,28];西瓜中的ERF6等[29];红薯中的NAC、MYB、AP2/ERF、WRKY、bZIP和ARF等[30]。在番茄中,沉默SlNAC4不仅延迟果实成熟同时导致类胡萝卜素含量减少,说明SlNAC4是类胡萝卜素和成熟的正调控因子[30]。将葡萄中的R2R3-MYB转录因子（VvMYB5b）转入番茄中,发现苯丙烷代谢下调,而β-胡萝卜素的量上调,证明了这2条途径都受到调控并可以独自代谢[31]。而在柑橘突变体（Citrus reticulata cv Suavissima）中,也发现R2R3-MYB转录因子（CrMYB68）通过负调控CrBCH2和CrNCED5的表达,从而调控α-和β-分支类胡萝卜素的转化[32]。共表达分析表明,本研究筛选到的转录因子与类胡萝卜素合成基因具有显著相关,有些同时与多个类胡萝卜素合成基因具有显著相关性。
综上所述,本研究初步鉴定了一批与蜜柚类胡萝卜素代谢相关的功能基因和转录因子。研究结果揭示,‘琯溪蜜柚’果实红肉突变品种‘红肉蜜柚’和‘三红蜜柚’果实类胡萝卜素的形成和积累,是由类胡萝卜素的代谢相关酶基因差异表达和转录因子调控引起的;在果肉红色芽变的同时,伴随着与汁胞粒化相关的基因突变。诚然,这些功能基因的功能已有较多的研究,作用已经逐渐清晰,但是调控它们的转录因子目前研究的还很少,特别是多年生果树柑橘,由于童期太长,研究进展相对缓慢。因此,这些被鉴定的转录因子,是如何与靶基因相互作用而实现转录调控的;是如何影响蛋白修饰如组蛋白磷酸化、甲基化和乙酰化,从而导致不同的调控途径发挥不同作用的,都尚不清楚。这些调控机理尚待进一步研究,为揭示柚类等柑橘的类胡萝卜素调控和果实颜色芽变机理提供理论支持。