番荔枝（Annona squamosa L.）原产于热带美洲和西印度群岛,现广泛分布于中国台湾、福建、广东、广西、海南和云南等省（区）,由于其果实糖分含量较高,每100 g果肉组织中的可溶性固形物含量可高达20%,总糖含量达15.3%~18.3%,因此,深受广大甜食爱好者的喜爱。糖是生物体内的主要能源物质及代谢底物,与植物的生长、生殖、发育与衰老等生理过程息息相关,来自SWEET家族的糖转运蛋白在植物生长发育阶段会起到调节糖的运输,从而影响果实糖分的积累。因此,研究番荔枝SWEET基因对糖类的转运调控机理对于番荔枝果实糖分积累、改善品质等田间栽培调控具有重要的理论意义。
SWEETs是一类新发现的糖转运蛋白,具有7个跨膜结构域,广泛存在于原核生物、人类、植物以及动物中。SWEET基因家族的成员数目有所差异,如拟南芥有17个SWEET家族成员,水稻有21个,高粱23个,玉米24个,番茄有29个[1],而大豆的高达52个。不同物种所包括的成员数如此之多,预示着SWEET蛋白功能的多样性[2,3]。对植物SWEET基因家族的研究发现,SWEET蛋白有4个分支：Clade Ⅰ、Clade Ⅱ、Clade Ⅲ和Clade Ⅳ,其中Clade Ⅰ（SWEET1-SWEET3）为己糖转运蛋白,功能为转运葡萄糖;Clade Ⅱ（SWEET4-SWEET8）功能为转运葡萄糖;Clade Ⅲ（SWET9-SWEET15）功能为转运蔗糖;Clade Ⅳ（SWEET16-SWEET17）为液泡膜转运蛋白,功能为转运果糖[4]。SWEET蛋白通过对多糖类,特别是蔗糖起控制亚细胞定位以及从库到源的长距离运输的作用[5]。Madoka等[6]通过对水稻SWEET基因的研究,发现糖的合成与转运是通过己糖激酶来完成的,它能使葡萄糖和果糖磷酸化,再通过SWEET蛋白的结合以实现糖分的运输。SWEET蛋白除了参与糖运输过程,其在植株生长发育、衰老、逆境胁迫、抗病等方面亦起着非常重要的作用[7,8]。本研究以番荔枝‘吉夫纳’品种为材料,通过基因克隆与表达分析,以期探究SWEET基因在番荔枝生长过程中各组织的表达情况,进一步研究SWEET基因的功能与作用,最终为田间植株生长发育与果实品质调控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试植物样品为2006年种植于广西农业科学院示范园区内的番荔枝科凤梨释迦（Atemoya）品系‘吉夫纳’品种,取其根、茎、嫩叶、老叶及花后8、30、90、120、140 d的果实为供试材料。所用试验耗材为：cDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa）、M-MLV逆转录酶（TaKaRa）、EX TaqDNA聚合酶（TaKaRa）、氨苄青霉素（TaKaRa）、pMD18-T载体（TaKaRa）、荧光染料及相关耗材等;琼脂糖、琼脂糖凝胶回收试剂盒、大肠杆菌感受态DH5α（南宁国拓生物科技有限公司）。引物合成及测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取 提取番荔枝不同组织部位的RNA,采用课题组改良华越洋试剂盒提取法[9]。用紫外分光光度计测定其纯度和浓度,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.2.2 cDNA第一链合成 以AUP1为逆转录引物,用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链,紫外分光光度计测定逆转录产物的浓度,并用琼脂糖电泳检测逆转录效果,最后配成200 µg/µL标准浓度用于PCR扩增。
1.2.3 番荔枝SWEET基因片段的克隆 利用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒构建正向消减cDNA文库,利用斑点杂交技术对克隆菌株作进一步筛选,再从中挑选阳性克隆菌株,通过De Novo技术对番荔枝进行测序分析,获得的AT-SWEET同源基因片段序列信息,设计上、下游特异引物（AT-SWEET-F、AT-SWEET-R）,利用RT-PCR方法获得番荔枝长度为1227 bp的SWEET基因序列,命名为AT-SWEET16-1。同源基因cDNA扩增PCR体系：上下游引物各为1 µL,cDNA 1 µL,dNTP 0.5 µL,Dream Taq聚合酶0.16 µL,Buffer 2.5 µL,水18.84 µL。PCR扩增参数为：95 ℃,5 min;95 ℃,40 s;57 ℃,40 s;72 ℃,80 s,42个循环;72 ℃,10 min。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测,试剂盒回收克隆的目的片段,胶回收产物连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,画平板培养后筛选阳性菌落,经PCR验证后测序。本研究所用引物见表1。
表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in this study |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5ʹ-3ʹ） Primer sequence (5ʹ-3ʹ) | 用途 Purpose |
|---|---|---|
| AUP1 | GGCCACGCGTCGACTAGTAC (T)18 | 逆转录 |
| AT-SWEET-F | ATGTGCGGTGGGATCAGCTT | 克隆 |
| AT-SWEET-R | GATTTTTCCATTTCCCTGGT | 克隆 |
| ATS-F | TGCGGTGGGATCAGCTTTCT | 克隆检测 |
| ATS-R | ACAGGGATTTTTCCATTTCC | 克隆检测 |
| AT-F | GCTGGCTACAACACTCGGCATCTTTACTGC | 荧光定量 |
| AT-R | CGAGTATGTTTCTGAATGGGTGTTTGATGG | 荧光定量 |
| GAPDH-F | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | 内参引物 |
| GAPDH-R | GGGGTCGTTGATGGCAACA | 内参引物 |
| SWEET16-1 | GTCATTCCTTTCGCTCCTCTGCTCCTTT | 原位杂交 探针 |
1.2.4 番荔枝SWEET进化树及蛋白序列分析 通过美国国立生物信息中心National Center for Biotechnology Information（NCBI）Blast工具检索SWEET同源基因的相似性;利用DNAman 5.2.2软件分析预测;利用Protparam和GENSCAN软件分别分析氨基酸及核苷酸序列;利用MEGA 10.0软件对多物种SWEET同源基因进行近邻算法分析,构建推测蛋白系统进化树。
1.2.5 qRT-PCR 采集番荔枝的幼嫩叶、老叶、茎、花、花蕾及不同发育阶段的果实的不同部位（果柄、果皮、果肉和种子）。以持家基因GAPDH为内参基因（引物GAPDH-F、GAPDH-R）,设计荧光定量引物AT-F、AT-R,参照试剂盒说明书,利用罗氏荧光定量PCR仪（Light Cycler480）进行qRT-PCR实验,分析番荔枝SWEET基因在植株的不同组织和果实的不同部位中的表达模式。
1.2.6 原位杂交 采集番荔枝成熟果等组织为实验样品,委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成基因探针（SWEET16-1,5'端加地高辛）。实验主要步骤如下：石蜡切片脱蜡至无水;使用3%柠檬酸稀释胃蛋白酶,将刚稀释的混合液保持于37 ℃,进行30 min消化处理;滴加预杂交液,于37 ℃条件下进行实验约2~3 h;将杂交探针混合液稀释到适量的浓度,保持在42 ℃条件下,实验处理12 h;使用在恒温水浴锅中37 ℃温浴的柠檬酸钠缓冲液（SSC）,将样品洗涤2次,每次洗涤时间保持在5~10 min;滴加封闭液,保证在37 ℃条件下进行30 min的实验处理;滴加生物素化鼠抗地高辛,于37 ℃条件下进行约1 h的实验处理;配制显色液,室温显色;苏木素复染细胞核,充分水洗;室温晾干,中性树胶封片;显微镜观察,拍照。
2 结果与分析
2.1 RNA提取及cDNA第一链合成
利用华越洋试剂盒改良提取法提取番荔枝的不同组织、器官样本RNA,经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,条带清晰,无DNA污染;经分光光度计检测,其OD260/OD280在1.9~2.1之间,说明RNA提取质量较好[9]。将RNA稀释成1 g/L,然后按照TaKaRa反转录试剂盒步骤进行反转录。
2.2 AT-SWEET基因全长克隆
利用SWEET基因特异引物AT-SWEET-F和AT-SWEET-R,以番荔枝cDNA为模板扩增基因片段,获得长度为1227 bp的番荔枝科凤梨释迦（Atemoya）品系SWEET基因全长cDNA序列,通过Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）比对及生物信息学分析后,结果发现该基因所编码的蛋白结构与SWEET16蛋白家族结构相似,由α螺旋形成的三螺旋束（triple-helix bundles,THB）结构域,故命名为AT-SWEET16-1,与克隆载体PMD-18连接,转化感受态细胞。通过重组子的筛选,获得阳性克隆菌株9个,通过抑制消减杂交技术及酶切检验后（图1）,送上海生工生物工程技术服务有限公司利用表达谱基因芯片技术进行测序分析,以验证构建克隆载体。
2.3 生物信息学分析
利用BioXM2.6软件对AT-SWEET16-1基因进行分析,基因序列全长1227 bp（NCBI基因登录号：2308905）,编码408个氨基酸,利用Protparam软件对基因所编码的氨基酸进行理化分析,结果表明,理论蛋白质的分子量为44.8 kDa,等电点为8.87;原子个数为6392,分子式为C2070H3240N516O542S24;不稳定指数（instability index）为41.39;脂肪族指数（aliphatic index）为108.48;蛋白质疏水性（grand average of hydropathicity,GRAVY）为0.562,预测为疏水蛋白;该蛋白在活体哺乳动物的红细胞的半衰期为30 h,在活体酵母中半衰期超过20 h,在活体大肠杆菌超过10 h。利用ScanProsite、SMART和DNAman软件对氨基酸序列的结构域进行分析。N端由2个相对保守的3-TM结构域（seven ɑ-helical transmembranes, TM)串联重复和1个低保守的单TM进行连接,组成3-1-3对称结构,再由3个TMs以TM1-TM3-TM2的形式排列形成三螺旋束（triple-helix bundles,THB）结构域（图2）,蛋白质的跨膜片段见图3,二级结构见图4。
2.4 系统进化分析
将获得的AT-SWEET16-1基因ORF用DNAman软件翻译成氨基酸序列,与NCBI上公布的其他物种的相关基因序列进行Blast比对,翻译成氨基酸序列后进行同源比对,结果发现相似性最高为98%,最低为72%,选取14个同源性、相似性较高（≥81%）且具有SWEET蛋白结构特性的氨基酸序列。用MEGA10.0软件绘制进化树（图5）,结果发现其与海枣（Phoenix dactylifera）相类聚,表明在进化关系上非常接近,但与其他物种的SWEET蛋白进化关系较远。对比AT-SWEET16-1基因所编码的氨基酸序列与海枣（XP_ 008784806.1）所编码的氨基酸序列,发现仅有几个氨基酸序列存在差异,相似度达95%。
2.5 番荔枝AT-SWEET16-1基因的表达分析
图6 AT-SWEET16-1基因在植株各组织中的表达情况相同小写字母表示在0.05水平差异不显著。 Fig. 6 Expression of AT-SWEET16-1 gene in different plant tissues The same lowercase letters indicate no significant difference at the 0.05 level. |
AT-SWEET16-1基因在果实不同发育阶段不同部位的表达情况见图7,结果发现在果实成熟期果柄的表达量明显比其他果实发育时期的其他组织部位高,AT-SWEET16-1基因在花后140 d果实的果柄表达量最高,在果实种子中的最高表达量是在花后90 d。AT-SWEET16-1基因在番荔枝果实的不同部位的表达情况为：果柄>果肉>果皮>种子。
2.6 原位杂交
3 讨论
番荔枝作为世界五大热带名果之一,具有非常高的经济价值,其糖分含量对果实风味和品质有着重要影响。而来自SWEET家族的糖转运蛋白在植物生长发育中能够调节糖分的运输,从而影响植株的发育和果实糖分的积累。在本研究中,从番荔枝果实的时空表达分析中发现AT-SWEET16-1基因在根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、幼果、成熟果中均有表达,其表达量依次为：成熟果>茎>根>花蕾>幼果>老叶>嫩叶。AT-SWEET16-1基因在果实成熟期的表达量高于幼果期,说明其对果实发育起着一定的调控作用,可能是基因编码的蛋白参与到果实糖分的合成与运输中,这与Chong等[10]在葡萄上的VvSWEET7基因表达一致。从不同组织部位表达看,AT-SWEET16-1基因在果柄中的表达量最高,果肉和果皮中相对较低,种子中的表达量最低,说明该基因有可能从源器官运输至库器官的转运过程,通过原位杂交电镜观察再次验证了AT-SWEET16-1基因与糖分积累与转运有关。本研究的基因表达结果与番茄[1]、木薯[11]、苹果[12]中SWEET基因的表达较为一致,SWEET蛋白在植物细胞间隙、液泡中均有表达,它们通过调控植物体内糖类化合物的运输、分配和贮藏,参与到植物生长发育的重要生理过程;通过泛素裂解化酵母膜蛋白双杂交和绿色荧光蛋白（GFP）试验表明,SWEET蛋白功能缺失突变能阻止葡萄糖的转运[13];SWEET蛋白同植株配子体发育有关,通过敲除SWEET基因的拟南芥突变体产生的种子较小,并且植株有明显的发育延迟现象[14];SWEET蛋白参与的多种生理过程,如韧皮部装载、蜜腺分泌[15]、籽粒灌浆、花粉发育、叶片衰老及响应生物和非生物胁迫[16,17],但目前有关SWEET基因的功能只在少数作物中得到验证,还有很多SWEET家族成员的功能有待进一步挖掘[18]。
综上所述,番荔枝AT-SWEET16-1基因可能在植株糖分积累与转运等方面起到一定的作用,但该基因具体功能有待进一步验证。